Wir danken Professor Hiraoka für die Zusendung Stämme. Wir danken für die Unterstützung aus dem Goran Gustafssons Stiftung und der Schwedischen Cancer Society (2008/939).

1. Fission Hefekultur <ol><li> Bereiten Edinburgh Minimal Medien (EMM) und EMM ohne Ammoniumchlorid (EMM-N) 8. Zur Reduzierung der Autofluoreszenz der Glucose-Lösung sollte nicht autoklaviert werden, aber statt steril filtriert mit einem 0,2 um Filter und anschließend auf die autoklaviert Medien aufgenommen. </li><li> Impfen Spalthefe Zellen frisch auf einer Agar-Platte mit Rich-Media gewachsen, YEA 8, in 3 ml EMM flüssigen Medien mit Filter sterilisiert Glukose. Verwenden Sie 13ml Röhrchen mit einem leicht auf Kappe geschoben, um eine gute Belüftung der Zellen zu gewährleisten. Lassen Sie die Zellen wachsen durch Schütteln mit 225 rpm in 30 ° C. Halten Sie die wachsenden Zellen in der log-Phase (1 X 06 bis 2 Oktober X 10 7 Zellen / ml) für 2 Tage durch Zählen sie mit einem Burker Kammer gefolgt von entsprechender Verdünnung jeden Morgen und Abend. </li><li> Am Tag des Experiments stellen Sie sicher, Zellen in frühen Log-Phase, 5 haben X 06 bis 1 Oktober X 10 7 Zellen / ml. </li><li> Um verhungern ter Zellen für Stickstoff während 20 Minuten Wechsel von EMM Medien EMM-N-Medien. Dies ist durch die Ernte 3 ml der Zellen in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei maximal 1,5 rcf wie Zentrifugation bei einer höheren Geschwindigkeit durchgeführt veranlassen könnte eine Stress-Reaktion in Spalthefe 9. Verwenden Sie die Doppel-Spinning-Technik, das heißt, erste Spin für 2 min, dann drehen Sie den Eppendorf-Röhrchen 180 ° und Spin wieder für 1,5 rcf 2 min 10. Dies hilft, um alle Zellen in einem Pellet sammeln sich am Boden des Röhrchens. Wash einmal mit EMM-N und dann lösen sich die Pellets in EMM-N und inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten bei 30 ° C unter Schütteln bei 225 rpm und dann weiter zu Punkt 2. Probenvorbereitung. </li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Ernte von 1,5 ml der Zellen in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei maximal 1,5 rcf wie Zentrifugation mit einer schnelleren Geschwindigkeit veranlassen könnte eine Stress-Reaktion in Spalthefe 9. Verwenden Sie die Doppel-Spinning-Technik, meaning; erste Spin für 2 min, dann drehen Sie den Eppendorf-Röhrchen 180 ° und Spin wieder für 1,5 rcf für 2 min 10. Dies hilft, um alle Zellen in einem Pellet sammeln sich am Boden des Röhrchens. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, aber lassen Sie 10-15 ul und Zellen in den übrigen Medien. Alternativ gibt man 10 ml frisches Medium, um das Zellpellet resuspendieren. </li><li> Achten Sie darauf, Klarglas Dias haben und Deckglas (No 1,5). Normalerweise müssen Sie nicht um sie zu reinigen, aber stellen Sie sicher, sie sind nicht voller Staub. </li><li> Nehmen Sie aus der Tiefkühltruhe ein Aliquot einer Stammlösung von 1mg/ml Lektin, die Filter sterilisiert. Das Lektin-Lösung kann wieder eingefroren werden ein paar mal. Das Lektin wird verwendet, um die Hefezellen auf dem Deckglas fixieren. </li><li> Platz 5 ul der EMM mit Filter sterilisiert Glucose auf die objektive Glas. </li><li> Platz 5 ul des Lektin-Lösung in die Ecke des Deckglases. Anschließend Platz 5 ul der Zellkultur in der gleichen Ecke, also in das Lektin drop. Mix durch Pipettieren ein paar Mal und breitete sich dann die Zellkultur-Lektin-Mix über das Deckglas mit der langen Seite der Pipettenspitze. Abhängig von der Dichte der Zelle Mischung lassen Sie alles oder saugen überschüssige Flüssigkeit in die gegenüberliegende Ecke des Deckglases. </li><li> Legen Sie die Abdeckung aus Glas, oben auf, mit einer Seite auf das Ziel aus Glas und auf der anderen Seite auf der Bank. Lassen Sie das Deckglas trocken ein wenig für ein paar Minuten. Es sollte auf keinen Fall vollständig trocken sein, aber es sollte nicht zu viel Flüssigkeit auf dem Glas. </li><li> Legen Sie die Abdeckung aus Glas mit einem ungefähren 70 ° Engel von der objektiven Glas durch den Rückgang der EMM. Lassen Sie das Deckglas, so dass es Herbst wird von oben nach unten in die Tropfen EMM. </li><li> Zur Abdichtung der Kanten mit Silikonfett Vorbereitung einer 2-ml-Spritze. Schneiden Sie das breite Ende einer 200 ul Spitze und befestigen es an der Spritze. Füllen Sie die Spritze mit etwa 1 ml Silikonfett. Eine feine Linie von Silizium an die Ränder des Deckglases durch vorsichtiges Eiter angewendething der Kolben der Spritze. Jetzt haben Sie ein kleines Wachstum Kammer des S. pombe Zellen. </li></ol> 3. Mikroskopie <ol><li> Initialisieren der Fluoreszenz-Mikroskopie, indem Sie die Quecksilber / Xenon-Lampe, das Mikroskop und Computer. Legen Sie die Hefe Klimakammer im Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine 63 X Objektiv oder einem 100 X-Objektiv mit NA = 1,3 oder höher. Wenn ein Öl-Objektiv verwendet wird, Öl nachfüllen. </li><li> Verwenden Sie das Hellfeld auf die Zellen zu finden und ein scharfes Bild. </li><li> Die Einstellungen für die Fluoreszenzmikroskopie sind je nach Fluorochrome verwendet, um die Hefezellen und das Mikroskop label je. Wir verwenden einen konfokalen Mikroskop Zeiss LSM 700 Laser Scanning Mikroskop mit Plan-Apochromat 63x Öl Objektiv (NA = 1,4) mit der 16-Linie mittlere Ebene Scan-Einstellung. Die Lochkamera sollte 1-1,1 Airy-Einheiten, die eine optische Scheibe von 0,8 mm ergibt eingestellt werden. Wir erkennen GFP in Track 1 mit dem Filter-Set für Alexa 488 mit einem Strahlteiler auf 582 nm, also detecting Wellenlängen zwischen 488 und 582 nm. In Track 2 verwenden wir ein Filter gesetzt optimal für mCherry mit einem Strahlteiler bei 578 nm, also Erkennen Wellenlängen zwischen 578 und 600 nm. Dies bedeutet, dass in Track 2 sowohl die mRFP (SPB) und NM (mCherry) erkannt werden. </li><li> Nehmen Sie so viele Bilder benötigt, um in der Lage sein in 60 verschiedenen Zellen für jeden Stamm zu messen. In der Regel 15 Bilder von unabhängigen Mikroskopie Felder sind genug. Es wird empfohlen, eine neue Klimakammer mit frischen Zellen hergestellt wird, wenn Ihr Mikroskopie länger als 60 Minuten. </li></ol> 4. Quantitative Messung der subzellulären Distanzen <ol><li> Öffnen Sie die Bilder in den Zeiss Zen Light Edition-Programm. Mit den Messungen Werkzeug messen Sie den Abstand in um zwischen den verschiedenen Fluorochromen in allen Zellen, in denen alle Signale sind in der gleichen Bildebene. Passen Sie die Lichtstärke und Kontrast zu der Mitte des Fluoreszenzsignals zu identifizieren. Dieser vereinfachte Protokoll verwendet nur zwei verschiedene colours und damit die SPB und NM sind in den gleichen Kanal. Die SPB ist durch seine große, runde Struktur in der NM hervorgehoben. Übertragen Sie die Abstände zu einem Notizblock Blatt. Messen Sie in mindestens 60 Zellen. Andere Programme wie ImageJ könnte auch genutzt werden, um den Abstand zu messen, sondern Zeiss Zen Light ist aufgrund seiner höheren Auflösung des Bildes und der Leichtigkeit, in und mit Hilfe dieses Programms zoom bevorzugt. Bilder in lsm Format in ImageJ geöffnet haben die beiden Kanäle auf der jeweils anderen. Um ein Bild mit beiden Kanälen, erste Spaltung der beiden Kanäle und danach zusammenführen. Danach wird das Tool kann verwendet werden, um die Abstände, wie oben beschrieben gemessen werden. </li><li> Vergleichen Sie die Mittelwert oder Median subzellulären Abstände zwischen verschiedenen Stämmen und Behandlungen mit einem statistischen Programm, zum Beispiel t-Test oder Mann-Whitney Rank Sum Test, zum Beispiel durch Verwendung der SigmaStat-3.5-Software. Häufig werden die Daten nicht normal verteilt, da es eine Auswahl von Zellen mit kürzeren werdenAbstände zwischen den Fluoreszenz-Signale, da alle Signale müssen in der gleichen Bildebene zu messen sein. Ein T-Test kann nur verwendet werden, wenn die Daten einer Normalverteilung, während ein Mann-Whitney Rank Sum Test ermöglicht den Vergleich von Datensätzen, die Normalverteilung Mangel sein. In einem t-Test der Mittelwert von zwei unterschiedlichen Datensätzen verglichen werden, während in einem Mann-Whitney-Rangsummentest der Median verglichen wird. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Der Stamm PJ1185: (h + + his7: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 lacO] sid4-mRFP: kanMX6 cut11-mCherry: natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN / N) wurde in EMM gewachsen . Eine Probe wurde entnommen und montiert in einer kleinen Klimakammer und Bilder aufgenommen wurden (Abb. 1A + N). Anschließend wird das Nährmedium wurde mit EMM w / o Ammoniumchlorid (EMM-N) ersetzt und die Zellen wurden grown für 15 Minuten unter Schütteln. Der Stickstoff unterversorgten Zellen wurden dann in eine Klimakammer mit EMM-N und Bilder montiert wurden (Abb. 1A-N). Das Messgerät wurde verwendet, um den Abstand zwischen dem Locus (GFP) und der SPB (Abb. 1B und Tabelle 1) zu messen. Darüber hinaus wurde der Abstand zwischen den locus (GFP) und die NM gemessen (Abb. 1B und Tabelle 2). Der Median subzellulären Strecken vor und nach der Stickstoff-Abbau wurden verglichen mit dem SigmaStat-3.5-Software (Tabelle 3). Es gab eine statistisch signifikante Verschiebung in der Lokalisation der Gen-Cluster weg von der NM zur SBP. Die Daten zur Messung der Entfernung zwischen dem GFP und die SBP hatte eine normale Verteilung und damit die mittlere Entfernungen (1,777 um + N und 1.587 um-N) konnte im Vergleich mit einem t-Test (Tabelle 1 und 3). Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Mittelwerten (P = 0,008, t-Test). Die Daten zur Messung der Entfernung zwischen dem GFP und NM nicht über eine normale distribution und damit die mittlere Entfernungen (0 um + N und 0,390 um-N) wurden mit Hilfe eines Mann-Whitney Rank Sum-Test (Tabelle 2 und 3). Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden mittleren Werte (p &lt;0,001, Mann-Whitney Rank Sum Test). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Lokalisierung eines Clusters von Genen namens Chr1 von GFP markiert, nach dem Stickstoff Hunger verändert. (A) Linke Spalte, + N, eine repräsentative Zellkern aus einer Zelle in EMM rechte Spalte gewachsen,-N, eine repräsentative Zellkern aus einer Zelle in EMM-N gewachsen. Grün ist die GFP-Signal Kennzeichnung der Chr1 Cluster ist Rot die mRFP und mCherry Kennzeichnung der SPB und nM. (B) Gleiche Zellkern als (A), aber jetzt mit gemessenen subnuclear Distanzen, gelb: der Durchmesser des Zellkerns, blau: der Abstand zwischen SPB und GFP-Signal und rosa: der Abstand zwischen den GFP-Signal und die Kernmembran. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> Tabelle 1. Die gemessenen subnuclear Entfernungen in um der PJ1185 Belastung in EMM gewachsen. Erste Reihe, Durchmesser der Zelle (d), zweite Reihe, Abstand zwischen den GFP und der SPB, dritte Reihe, Abstand zwischen den GFP und die NM. <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> Tabelle 2. Die gemessenen subnuclear Entfernungen in um der PJ1185 Belastung in EMM-N gewachsen. Erste Reihe, Durchmesser der Zelle (d), zweite Reihe, Abstand zwischen den GFP und der SPB, dritte Reihe, Abstand zwischen den GFP und die NM. <imgalt = &quot;Tabelle 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot; /&gt; Tabelle 3. Beschreibende Statistik der beobachteten subnuclear Strecken im Stamm PJ1185 vor (+ N) und nach (-N) Stickstoff Hunger. Erste Zeile: Anzahl der Zelle gemessen, zweite Reihe: mittlere Durchmesser (d), dritte Zeile: mittlere Durchmesser (d), weiter Reihe: mittlere Abstand zwischen den GFP und SPB, fünfte Zeile: Median Abstände zwischen den GFP-und NM.

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	<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li><li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. 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Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li><li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li><li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy in yeast. , (2000).</li><li>Tsien, R. 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Wir haben nichts zu offenbaren.

Während des letzten Jahrzehnts den Einsatz von Live Cell Imaging, um zelluläre Ereignisse zu überwachen ist zunehmend populärer geworden. Es begann mit dem Einsatz von grün fluoreszierendes Protein, von Qualle Aequorea victoria und jetzt viele verschiedene Fluorochrome sind Fluoreszenz-durch ein breites Spektrum von cyan (475 nm) bis weit roten (648 nm) 11. Einer der wichtigsten Vorteile des Live Cell Imaging über Immunfluoreszenz ist, dass die Zellen nicht durch Formaldehyd oder Ethanol / Aceton-Behandlung vor der Mikroskopie fixiert, damit Vermeidung möglicher Artefakte aus der Fixierung. Darüber hinaus bietet Live Cell Imaging die Möglichkeit, einzelne Zellen zu verfolgen und zu fotografieren in kurzen Abständen während Stunden oder Tagen der Inkubation, die es ermöglicht, Filme von zellulären Ereignissen 12 Jahre erhalten. Säugetierzellen haben den Vorteil, dass eine größere Größe, mit Durchmessern von etwa 100 Mikrometern, im Vergleich zu den kleineren Hefezelle mit einem Durchmesser von etwa 3-4 &amp;mu; m. Auf der anderen Seite liegt der Vorteil mit der Hefe der leicht manipuliert Genoms. Die homologe Rekombination erfolgt sehr effizient in der Hefe und wird verwendet, um Proteine ​​von Interesse zu unterschiedlichen Fluorochromen 3 Sicherungen. Darüber hinaus durch gezielte Integration von lacO Sequenzen und anschließende Expression von lacR-GFP-Protein ermöglicht die Erkennung eines bestimmten Teils des Genoms im Zellkern 2. Mit S. pombe-Zellen in der Mikroskopie hat zusätzliche Vorteile, da sie natürliche einzellige Organismen, die mit einem schnellen Generationszeit in Low-Cost-Bedingungen der Zellkultur wachsen. Darüber hinaus S. pombe ist ein ausgezeichneter eukaryotischen Modellorganismus, da es Metazoen homologe Gene hat. Eine der wichtigsten Einschränkungen dieser Technik ist Autofluoreszenz in der Hefezelle stören den Nachweis des echten Signals. Dieses Problem kann durch die Verwendung minimal Nährmedien mit Filter sterilisiert Glukose statt autoklaviert überwunden werden. InNeben den Hefezellen sollten für 2 Tage in der log-Phase vor dem Einbau zusammen angebaut werden. Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine relativ einfache, aber dennoch quantitative Methode, um die subzelluläre Lokalisation von Proteinen innerhalb der Hefezelle zu bestimmen. Darüber hinaus, indem sie Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten können wir folgen zellulären Vorgänge.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Lectin </td><td> Sigma </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> Silikonfett </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laser-Scanning-Mikroskop LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> Andere konfokalen Mikroskop verwendet werden könnte. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3,5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3,5 </td><td> Jede Software für statistische Analysen verwendet werden könnte. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

Mehrere Mikroskopie-Techniken sind heute verfügbar, die ein bestimmtes Protein in der Zelle erkennen können. Während des letzten Jahrzehnts Live Cell Imaging mit Fluorochromen wie Green Fluorescent Protein (GFP) direkt an das Protein von Interesse verbunden ist zunehmend populärer geworden 1. Mit GFP und ähnlichen Fluoreszenzfarbstoffen die subzelluläre Lokalisationen und Bewegungen von Proteinen in einem Fluoreszenz-Mikroskop erkannt werden. Darüber hinaus ist auch die subnukleare Lokalisierung einer bestimmten Region eines Chromosoms kann studierte mit Hilfe dieser Technik werden. GFP ist es, die Lac Repressor Protein (lacR) fusioniert und ektopisch in die Zelle, in Tandem-Wiederholungen der lacO Sequenz in der Region von Interesse auf der Chromosom 2 eingefügt wurde zum Ausdruck gebracht. Die lacR-GFP wird die lacO wiederholt und diesem Bereich des Genoms sichtbar sein, wie ein grüner Punkt in der Fluoreszenz-Mikroskop wird zu binden. Hefe ist speziell für diese Art der Manipulation, da homologe geeignetRekombination ist sehr effizient und ermöglicht dadurch die gezielte Integration der lacO wiederholt und entwickelt Fusionsproteine ​​mit GFP 3. Hier beschreiben wir eine quantitative Methode für Live-Cell-Analyse Spalthefe. Weitere Protokolle für Live Cell Analyse Spalthefe gefunden werden kann, zum Beispiel, wie man einen Film der meiotischen Chromosomen Verhalten 4 vorzunehmen. In diesem speziellen Experiment, das wir auf subnuclear Organisation und wie ist es bei Geninduktion betroffen konzentrieren. Wir haben ein Gen-Cluster namens Chr1, durch die Einführung von lacO Bindungsstellen in der Nähe der Gene bezeichnet. Das Gen-Cluster ist für Gene, die früh während Stickstoff Aushungern von Spalthefe 5 induzierte bereichert. In der Belastung der Kernmembran (NM) ist durch das Anbringen von mCherry der NM-Protein Cut11 was zu einer roten Fluoreszenz-Signal bezeichnet. Die Spindel Pole Körper (SPB)-Verbindung Sid4 ist Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6 fusioniert </sbis&gt;. In vegetativ wachsenden Hefezellen den Zentromeren sind immer auf die SPB, dass in der NM 7 eingebettet ist beigefügt. Die SPB ist wie eine große, runde Struktur in der NM identifiziert. Durch die Abbildung vor und 20 Minuten nach dem Abbau der Stickstoff-Quelle können wir bestimmen den Abstand zwischen der Gen-Cluster (GFP) und der NM / SPB. Der Mittelwert oder Median Abstände vor und nach der Stickstoff-Abbau verglichen, und wir können somit quantifizieren, ob oder nicht es gibt eine Verschiebung in der subzellulären Lokalisation der Gen-Cluster nach dem Stickstoff Erschöpfung.

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Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Die Spalthefe,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt; Ist ein gutes Modellsystem zur grundlegenden zellulären Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methode zur quantitativen Analyse der lebenden Zelle Spalthefe durchzuführen. In diesem speziellen Experiment, das wir über die Organisation des Genoms im Zellkern zu konzentrieren, aber die Methode kann auch verwendet werden, um cytosolische Faktoren zu studieren.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Aufrufe.  University of Uppsala. Die Spalthefe, Schizosaccharomyces pombe Ist ein gutes Modellsystem zur grundlegenden zellulären Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methode zur quantitativen Analyse der lebenden Zelle Spalthefe durchzuführen. In diesem speziellen Experiment, das wir über die Organisation des Genoms im Zellkern zu konzentrieren, aber die Methode kann auch verwendet werden, um cytosolische Faktoren zu studieren.

Serie: Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Forschung

Biologie

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...