Wir danken Brian G. Coon und Claudia B. Hanna für hilfreiche Diskussionen und Unterstützung. Dieses Projekt wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem Dep unterstützt. of Biological Sciences, Purdue University zu R. Claudio Aguilar und ein American Cancer Society Institutional Research Grant R. Claudio Aguilar durch die Purdue Cancer Center.

A. Zellkultur und Protein Induction Dieser Abschnitt beschreibt Zellkulturbedingungen, Zellzyklus-Synchronisation mit Nocodazol, durch Induktion der Proteinexpression von einem regulierbaren Promotor in Hefe-Zellen gefolgt. <ol><li> Die Wildtyp-Hefestamm W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) ist mit hoher Kopienzahl (2μ) Plasmid-DNA, die unsere Gen von Interesse (ENTH2) enthält unter der Kontrolle verwandelt eines Methionin-repressible Promotor (MET25). 2mM Methionin ist ausreichend, um die Promotoraktivität zu unterdrücken, während Medien fehlt Methionin ermöglicht maximale Expression. Somit kann eine Reihe von Methionin-Konzentrationen verwendet werden, um das Protein auf dem gewünschten Niveau zu äußern. 1 Transformation von Plasmid-DNA in Zellen W303 erfolgt über die LiAc-TE-Methode gemäß Standardverfahren. 2 Hinweis: Dieses Experiment sollte, indem die Zellen über Nacht in Gegenwart von 2 mM Methionin-Protein-Expression nur im Hintergrund Ebenen zu gewährleisten durchgeführt werden. Am nächsten Morgen sollte die Proteinexpression durch Resuspendieren der Zellen in Medien fehlt Methionin unmittelbar nach Zellzyklus-Synchronisation (ca. 4h) induziert werden. Allerdings haben wir festgestellt, dass die ENTH2-abhängige Zellteilung Phänotyp induziert wird (in der Regel nach 4-6h von Protein-Induktion 3) erst mit einer erheblichen Konzentration von ENTH2 hat sich in den Zellen gebaut, was den zeitlichen Verlauf der Analyse aller Erscheinungsformen des der Phänotyp sehr lange (mindestens 16h). Wir haben festgestellt, dass das Wachstum der Zellen über Nacht in Gegenwart von 0,2 mM Methionin unterdrückt die morphologischen Phänotyp, sondern ermöglicht unterkritischen Proteinkonzentration, die schnell auf-Phänotyp-induzierenden Ebenen erhöht werden kann, wenn die Medien fehlen Methionin übertragen. Dies ermöglicht eine detaillierte Analyse der schweren Erscheinungsformen der Zellteilung Defekt in einem relativ kürzerer Zeit. Wir empfehlen daher, dass der Experimentator die Methionin-Konzentration, die unterhalb der Schwelle für Phänotyp Induktion auf einer Fall-zu-Fall-Basis zu ermitteln. </li><li> Wählen sechs Kolonien aus einer Platte, die vor kurzem transformierten Zellen und impfen in 50 ml von selektiven Medien mit 0,2 mm Methionin in einem sterilisierten Erlenmeyerkolben mit Standard-sterile Techniken. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. (Für weitere Informationen über Standard-Hefekultur Bedingungen, vgl. Rz. 4) </li><li> Am nächsten Morgen, schätzen Zelldichte durch Messung der optischen Dichte der Kultur bei 600nm. Übertragen Sie die Höhe von 20 OD 600nm von Zellen in ein steriles Zentrifugenröhrchen und Ernte durch Spinnen bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Die Zellen in einer Konzentration von 0,4 OD 600nm / ml YPD und fügen Nocodazol, um eine endgültige Konzentration von 15μg/ml von einem Bestand von 1mg/ml in DMSO. Inkubieren 4h bei 30 ° C unter Schütteln bei 200rpm. Hinweis: Alternative Verhaftung Methoden einschließlich Verhaftung an der G0-Phase mit alpha-Faktor-oder G1-S-Phase mit Hydroxyurea eingesetzt werden kann. Wir haben festgestellt, dass Verhaftung bei der Mitose mit Nocodazol einfach und effektiv genug für unsere Zwecke ist. </li><li> Nach 4h, überprüfen Prozentsatz an Zellen in der Mitose durch Zählen der Anzahl der Zellen mit gleich großen Knospen, indem Sie unter dem Mikroskop verhaftet. Wenn die Verhaftung von mehr als 90% auf den folgenden Schritt fort. Ansonsten halten Zellen in Nocodazol, bis der gewünschte Prozentsatz der Mitose erreicht wird. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten und wäscht mit eiskaltem Wasser dreimal. Nach dem letzten Waschen, das Pellet in selektiven Medien fehlt Methionin in einer Zelldichte von ~ 0,5 OD 600nm / ml. Übertragung der Hälfte des Volumens von Zellen zu einem neuen sterilen Röhrchen und fügen Methionin, um eine endgültige Konzentration 0,2 mM. Dies wird als Kontrolle für Effekte aufgrund basalen Ebenen der Proteinexpression dienen. Dies ist das erste Mal-Punkt des Experiments (Zeit = 0h). Analysieren Sie die Zellen jede Stunde für 6h. </li></ol> B. Analyse der Phänotyp Entwicklung Hinweis: Alle die Analyse unten beschriebenen Methoden müssen nicht gleichzeitig durchgeführt werden. Bestimmung von Protein-Expression mittels Western Blot <ol><li> Bei jedem Zeit-Punkt, messen Sie die OD 600nm von der Kultur und Ernte 2 OD 600nm Äquivalente der Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Das Pellet in 1 ml sterilem Wasser und übertragen Sie die Suspension auf eine 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie die Zentrifugation zu einem Pellet zu erhalten. Den Überstand aspirieren. </li><li> Das Pellet in 50 ul SDS-PAGE Laemmli-Probenpuffer (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 2% β-Mercaptoethanol und 0,006% Bromphenolblau). Add 50 ul des Säure-gewaschene Glasperlen (0.2-0.4 Mikron Durchmesser) und Wirbel für 1 min. </li><li> Boil Röhrchen auf einem 95 ° C Hitze block für 2 Minuten, Wirbel wieder für 30 Sekunden und wieder kochendes für 5 Minuten. Einfrieren der Proteinprobe bei -20 ° C. </li><li> Run Protein-Proben auf einem 12% SDS-PAGE-Gel, Transfer auf eine Nitrozellulosemembran und führen Western-Blot mit den entsprechenden Antikörpern gegen das Protein von Interesse zu erkennen. In diesem Beispiel Sonde wir das Vorhandensein von Hämagglutinin (HA) markiert ENTH Domains durch Inkubation mit Maus-Anti-HA-Antikörper (Covance, Princeton, NJ) bei 1:2000-Verdünnung in Blotto-Tween (1XPBS, 5% fettfreier Trockenmilch , 0,1% Tween). HRP markierten Ziege anti-Maus Sekundärantikörper (Pierce) in einer Verdünnung von 1:2500, auch in Blotto-Tween, darf an den primären Antikörper auf der Membran für 1h bei Raumtemperatur zu binden. Supersignal West Pico Chemilumineszenzsubstrat wird verwendet, um HRP markierten anti-Maus-Antikörper erkennen. </li><li> Quantifizierung der Proteinexpression Ebenen durch Densitometrie. </li></ol> Dieser Abschnitt beschreibt zwei Methoden der Tracking-Phänotyp Entwicklung in Abhängigkeit von steigender Proteinkonzentration. Die erste Methode ist Zell-Population basiert, während die zweite Studien auf der Ebene einer einzelnen Zelle. Die Quantifizierung der Zellteilung Phänotyp und Zelltod <ol><li> Zu jeder Zeit-Punkt, Transfer 1ml Zellsuspension in ein steriles Eppendorf-Röhrchen mit sterilen Techniken und Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 70μl Medien, von 30μl Methylenblau aus einem Bestand von 1mg/ml in sterilem Wasser gefolgt. Methylenblau ist ein blauer Vitalfarbstoffs dass farblos in der reduzierenden Umgebung des Cytosol damit toten Zellen können durch ihre blaue Farbe identifiziert werden wird. </li><li> Pipette ~ 6μl dieser Suspension auf einen sauberen Glasobjektträger und setzen Sie ein Deckglas über die Tropfen. Drücken Sie die Deckglas vorsichtig, um eine dünne, gleichmäßige Schicht von Zellen zwischen den Glas-Grenzflächen zu bilden. </li><li> Teilen Sie dem Deckglas in 9 Quadranten und nehmen Sie 3 Bilder pro Quadranten wie in Abb.. 2. Die Anzahl der Zellen / Feld sollte nicht größer als 30 Zellen eine genaue Quantifizierung. Jedes Deckglas kann für ca. 15 Minuten dargestellt werden, bevor Luftblasen Schaden der Vorbereitung. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den Phänotyp unter studieren. Die Zellteilung Fehler auf ENTH2 Überexpression induzierten führt zum Zelltod und damit wir auch zählen die Anzahl der toten Zellen durch ihre blaue Farbe gekennzeichnet. </li><li> Berechnen Sie den Anteil der phänotypischen Zellen. </li><li> Zeichnen Sie die Daten wie in Abb.. 3. </li></ol> Visualisierung von Phänotyp-spezifische Defekte mittels Fluoreszenzmikroskopie Zellteilung defekten Zellen, wie auf ENTH2 Überexpression gesehen haben, sind oft von Zellwand Mängel und Septin mislocalization3 (visualisiert als GFP-Fusionsproteine) gekennzeichnet. Die Zellwand von Hefezellen kann leicht durch Färbung mit Calcofluor White (CFW), die irreversibel bindet in Hefe-Zellwände Chitin. <ol><li> Bei jedem Zeit-Punkt, Aliquot 1 ml Kultur in ein steriles Eppendorf-Röhrchen und Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Zellpellet in 100 &amp;mgr; l von 1mg/ml CfW Lösung in sterilem Wasser und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und 3 x waschen mit 1X PBS. </li><li> Das Pellet in 100 &amp;mgr; l 1X PBS und Bild unter dem Mikroskop mit UV-Optik (Zellwand) und FITC-Filter (GFP-Septin) bei 100-facher Vergrößerung. </li><li> Quantify Anteil der Zellen mit Zellwand Mangels und Septin mislocalization durch folgende Schritte 4-6 in Abschnitt B.2.1 </li></ol> B.3. Bestimmung des Phänotyps Entwicklung an der einzelnen Zelle Ebene: Zeitraffer-Video-Mikroskopie. <ol><li> Saubere einem Glasträger mit einer konkaven Vertiefung mit 70% Alkohol und an der Luft trocknen. </li><li> Boil 0,06 g Agarose in 5ml selektiven Medien fehlt Methionin in einem sterilen Glasröhrchen in der Mikrowelle, bis die Agarose vollständig auflöst. </li><li> Schnell Pipette 200 ul der Agarose mit Medien in der Folie Depression und invertieren Sie einen sauberen Glasobjektträger über sie darauf achten, dass keine Luftblasen unter gefangen sind. </li><li> Wenn das Gel erstarrt, stellen Sie den Schieberegler auf der Oberseite glatt weg von der Depression rutschen, halten ihre Flächen parallel zu allen Zeiten. Dies gewährleistet, dass die Oberfläche der Agarose Bett bündig mit der Oberfläche der Mulde gleiten kann. Reinigen Sie die Folie Region um die Agarose Bett mit einem feinen Gewebe. Die Folie ist nun einsatzbereit. </li><li> Zum Zeitpunkt = 4 Stunden, Transfer 1ml von Zellen aus der Kultur in ein steriles Eppendorf-Röhrchen und Ernte durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Hinweis: Es wird empfohlen, zu einem späteren Zeit-Punkt gewählt, um ein hohes Maß an Protein-Expression zu gewährleisten, so dass Phänotyp Entwicklung garantiert werden. Pilotversuche sind determin erforderliche Induktionszeiten auf einer Fall-zu-Fall-Basis. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die Zellen in 100 &amp;mgr; l frisches selektiven Medien fehlt Methionin. </li><li> Vaseline, um die Ränder des Deckglases. Dann geben Sie einen Tropfen der Zellsuspension in der Mitte der Agarose Bett und breitete einheitlich durch leichtes Drücken auf einem Deckglas über sie. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Vaseline und fixieren ihre Position durch die Auskleidung die Ränder mit Nagellack. Warten Sie, bis der Nagellack trocknet. </li><li> Legen Sie die Folie auf einem beheizten eines Mikroskops, und wählen Sie ein Feld, das nicht mehr als 10 Zellen verteilt ausreichend enthält. Wie sich Zellen teilen, wird das Feld im Laufe der Zeit überfüllt. </li><li> Nehmen Sie ein Bild des Feldes alle 5 Minuten für ca. 5 Stunden. Phänotyp Fortschreiten kann durch Zusammenfügen der Bilder in einen Film mit ImageJ-Software (studiert werden <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005</a> ) </li></ol> Hinweis: Wir verwenden Zeiss Axiovert 200M Mikroskop, monochrome Zeiss AxioCam MRm Digitalkamera und Carl Zeiss AxioVision Bildaufnahme-Software (Version 4.4) für Live Cell Imaging. Die Temperaturregelung erfolgt, indem gleitet auf einer beheizten Bühne bei 30 ° C durch die Pecon TempControl 37 medizinischen Geräten erzielt. Um zu vermeiden, re-Einstellung des Fokus wiederholt, ist es zweckmäßig, die Bildaufnahme-Software-Programm, um automatisch erwerben ein paar Z-Stapel-Bildern zu jeder Zeit-Punkt, und wählen Sie das Bild mit dem besten Fokus später bei der Montage des Films. Einige Bildaufnahme Software haben die Möglichkeit, Autofokus für zeitliche Verlauf Experimente. Es ist zweckmäßig, diese Option ein, wenn verfügbar ist. Wildtyp-Hefezellen wachsen am besten bei 30 ° C damit Temperaturregelung ist kritisch. Um eine ausreichende Wärme zu gewährleisten, ist es hilfreich, einen externen Wärmequelle neben dem beheizten Bühne bieten. Zum Beispiel lassen wir die übertragenen weißem Licht des Mikroskops auf für die gesamte Dauer der Bildgebung. Es ist auch wichtig, um Luftblasen zu vermeiden, wenn die Vorbereitung der Agarose Bett und Zell-Sandwich. Die Luft in den Blasen eingeschlossene erweitert, wenn im Laufe der Zeit erhitzt und neigen dazu, Zellen wegschieben aus dem Bereich abzubildenden. Es ist auch wichtig, dass einzelne Zelle Positionen innerhalb des Feldes werden, nicht wesentlich ändert über die Dauer der bildgebenden Verfahren, vor allem während der Re-Fokussierung versucht. Bildstabilisierung Plugins sind verfügbar für ImageJ kleine Verschiebungen in der Zelle Position zu korrigieren, um nach dem Film montiert worden ist. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / code / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Entwicklung eines morphologischen Phänotyp (Hefezelle nicht korrekte Zellteilung) auf Protein-Überexpression zu überwachen. Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, um Hefezellen durch Pelletierung bei der empfohlenen Zentrifugationsgeschwindigkeit als höhere Geschwindigkeiten Zellen und obskuren Ergebnisse Schäden können zu ernten. Methylenblau und Calcofluor weiß sollte hinzugefügt werden, um Zellen kurz vor der Bildgebung leben, wie sie giftig sind. Dieses Verfahren kann auch leicht für Phänotypen unter Protein Repression Bedingungen beobachtet angepasst werden, sofern das Ziel von einem steuerbaren Promotors exprimiert.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Obwohl dieses Protokoll auf die Überexpression eines Proteins beruht, kann es leicht zur morphologischen Phänotypen abhängig Unterdrückung der Proteinexpression angepasst werden. Unser Labor ist interessiert an einem Studium der Signalisierung Eigenschaften der endocytischen Adapter-Protein epsin. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine dominant negative Ansatz, bei dem wir die konservierten überexprimiert<u&gt; E</u&gt; PSIN<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (ENTH) Domain, um mit den Funktionen des endogenen epsin-2 (Ent2 oder YLR206W) stören. Wir haben beobachtet, dass die Überexpression der ENTH Domäne Ent2 (ENTH2) in Wildtyp-Zellen führte zu einer Zellteilung Defekt, der abhängig von der mislocalization einer Familie von Gerüstproteine, septins ist.

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Aufrufe.  Purdue University. Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in Saccharomyces cerevisiae.

Serie: Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Forschung

Biotechnik

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Biochemie

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Hefekolonie Embedding-Methode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Biologie

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

Analyse des Lipidtröpfchengehalts in Spalt- und Budding-Hefen mittels automatisierter Bildverarbeitung

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Immunologie und Infektion

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...