这种方法在几分钟内从三维中跟踪酵母细胞的结构，使我们能够研究细胞内细胞器和隔间的动态。4D 成像可确保我们可以得出有关细胞内动力学的可靠结论，尤其是对于可能是瞬态的结构或标记。演示这个程序的将是娜塔莉·约翰逊，一个来自我实验室的博士后。
首先在5毫升非荧光合成定义，或NSD，中等，在15毫升的困惑烧瓶中生长感兴趣的酵母菌株的隔夜培养，在23摄氏度。分析前三到四个小时，在新鲜的NSD介质中稀释对数相酵母培养，使600纳米或OD600的最终光学密度在成像时为0.5至0.8。在培养物准备好前至少一小时，将每毫升 Concanavalin A 溶液的等同物全速离机五分钟，以颗粒任何颗粒，并将 250 微升的上清液加入一个干净的 35 毫米玻璃底部显微镜盘中。
15分钟后，用两毫升蒸馏水洗两到三次，在干后加入250微升酵母培养物。等待10分钟，让细胞粘附，然后轻轻地用两毫升的新鲜NSD介质轻轻洗盘子两到三次。然后用两毫升的新鲜 NSD 覆盖细胞。
要对酵母细胞进行成像，请在共焦光显微镜上选择一个 63 倍油浸透镜，其数值孔径至少为 1.4。在这里，还可以使用 100 倍的客观镜头，而不是 63 倍的客观镜头。然后，将盘子放在客观镜上，用浸入油发现。
从"采集模式"选项卡的下拉菜单中，选择 xyzt。在 XY 选项卡下，将帧大小格式化为 256 宽度 X128 高度。使用最大扫描速度，通常为 8 千赫。
如果双向 X 扫描可用，请打开该扫描，并将缩放系数调整为 9，这将导致像素大小约为 80 纳米。如果使用 100 倍目标，请相应地调整缩放系数，以保持大约 80 纳米的像素大小。然后将线累积设置为 4 或 6。
将针孔设置为 1.2 个 Airy 单元，并打开白光激光器（如果有）。然后设置每个荧光通道的激发波长和激光功率百分比。如果可用，则通过取消选择最大集成时间，在配置选项卡下启用光子计数模式。
对于每个荧光通道，分配一个高灵敏度检测器，设置发射波长范围，并打开光子计数模式（如果可用）。将每个荧光通道的时间浇注窗口设置为 0.6 到 10 纳秒，以避免从玻璃盘捕获反射光。接下来，打开亮场成像，并选择低灵敏度检测器进行数据收集。
打开实时成像模式，并在明亮的场通道中打开增益，直到细胞清晰可见。如果在光子计数模式下，将灰色值的范围从手动更改为自动以查看荧光信号。将 Z 堆栈设置为成像酵母细胞的整个体积，并指定成像的方向性，以便向下向盖滑移动。
将 Z 步长间隔设置为 0.25 至 0.35 微米，以获取每个 Z 堆栈大约 20 到 25 个光学部分，并在可用时打开 Galvo 流。对于典型的影片，将 Z 堆栈之间的时间间隔设置为两秒钟，将影片持续时间设置为 5 到 10 分钟。然后将影片另存为 LIF 文件。
对于电影去卷积，启动一个适当的去卷积软件程序，使用经典的最大可能性估计算法，并打开数据系列。选择"去卷积"向导和参数编辑器，以确认已检测到并正确显示成像参数。将嵌入介质折射率值更改为 1.4 以近似酵母细胞质。
然后使用编辑器估计盖滑位置。选择"设置所有已验证"并单击"接受"，然后选择"输入向导"。单击下一个箭头可绕过点传播函数选择和裁剪预处理阶段，然后通过每个荧光通道的去卷积向导。
选择计算对数垂直映射功能并检查原始数据荧光强度剖面。将手动设置为背景估计模式，输入背景值，然后单击"接受"。将最大迭代值保留为 40，并输入估计信号与噪声比。
然后关闭漂白剂校正，然后单击"去旋转"。如果噪声已充分消除而不消除昏暗结构中的正荧光，请选择"接受到下一个通道"。一旦所有荧光通道都令人满意地去配置，单击"全部完成"，然后先排列红色通道，然后是绿色、蓝色和明亮的通道，以便随后在 ImageJ 中进行编辑。
然后将图像序列保存为八位 TIF 文件，每个通道选择一个文件，将对比度拉伸作为转换模式。要进行漂白校正，请将去旋转的图像序列导入 ImageJ，然后单击"图像"、超堆栈和堆栈到超堆栈，将图像转换为超堆栈。从下拉菜单中选择 xyzct，并输入通道数、Z 堆栈切片和时间帧数。
要校正照片漂白的荧光通道，请选择"图像、颜色、分割通道"和"荧光通道"，请选择插件、EMBL 工具、漂白校正和指数拟合。然后选择"图像、颜色"和"合并通道"，将亮场和漂白校正荧光通道合并到超堆栈中，并将去旋转和漂白校正的超堆栈保存为后续影片生成和编辑，作为八位 TIF 文件。要将去旋转和漂白校正数据集转换为缩放蒙太奇，请选择插件、IJ_Plugins 和"制作蒙太奇系列"，然后选择相关的八位超堆栈。
单击"打开"和"确定"以接受所有切片将用于创建蒙太奇，然后再次单击"确定"以接受建议的规模因子值。将原始蒙太奇保存为八位 TIF 文件，并选择插件、IJ_Plugins、蒙太奇系列到超堆栈和 OK，以创建一个包含所有时间帧的原始蒙太奇的 4D 超堆栈。要生成原始平均投影影片，请首先选择"IJ_Plugins、项目超堆栈和确定"，以接受 Z 投影默认参数。
将平均投影影片保存为八位 TIF 文件，并检查影片以识别可以在其标记期间跟踪的单个结构。识别可在影片持续时间内可靠跟踪的结构，并隔离该结构进行分析，是该过程最关键的步骤。然后按照插件用户指南中的说明，通过编辑蒙太奇来隔离感兴趣的结构。
从编辑蒙太奇的期间（包括感兴趣的结构）创建 4D 超堆栈，并保存编辑的超堆栈。要量化编辑的 4D 超堆栈中隔离结构的荧光强度，请选择插件、IJ_Plugins 和"分析已编辑的影片"，输入 Z 堆栈之间的时间间隔，然后单击"确定"。若要创建隔离结构的最终影片，请选择"插件、IJ_Plugins"和"项目超堆栈"，指定应包含的 Z 堆栈切片，选择"平均强度"作为"投影"类型，然后单击"确定"。若要在编辑的数据上使用原始数据创建 4D 超堆栈，请选择插件、IJ_Plugins、合并两个超堆栈，并将第一个放在第二位以上。若要在编辑的数据上使用原始数据从 4D 超堆栈生成影片，请选择"插件、IJ_Plugins"和"项目超堆栈"，请指定应包含的 Z 堆栈切片，选择"平均强度"作为投影类型，然后单击"确定"。在这里，原始数据的 Z 堆栈投影的第一帧可以与相同的去卷和漂白校正数据进行比较。
这些帧从相同的去相和漂白校正电影显示两个蓄水池进行分析，其中首先标记与绿色Vanadate耐糖蛋白4或Vrg4标记，后来与红色分泌7或Sec7基因传输蛋白标记。此蒙太奇由去卷和漂白校正的超堆栈创建，在编辑之前和之后的单一时间点显示所有光学部分，以便从所选的蓄水池之一隔离信号。在此图中，投影 Z 堆栈的最后影片中的几帧显示在图的顶部，并在底部编辑投影。
从所选的 Golgi cisternae 对绿色和红色荧光信号进行量化后，绿色 Vrg4 标记到达并持续约 80 秒，之后，红色 Sec7 标记到达并持续约 60 秒，两个标记之间短暂重叠。执行此过程时，确定可以在其生存期内明确跟踪的结构非常重要。在发生突变或某种其他类型的特定扰动后，可以执行相同类型的分析。
该技术为研究高尔吉素酸和内质性沉默性退出位点以酵母为模型系统的动态行为开辟了一条。
