This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. Einrichtung Suspension Zellkulturen <ol><li> Bereiten Flüssigkeit BY-2 - Medien durch Zugabe von 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog Basal Medium, 30 g Saccharose, 200 mg KH 2 PO 4 und 200 &amp; mgr; g von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) zu 900 ml destilliertem Wasser und pH-Wert auf 5,8 mit 0,1 M KOH. Nach dem Einstellen des pH, passen auf 1000 ml mit destilliertem Wasser und Autoklaven Endvolumen. Medien können bei 4 ° C zu 2 Wochen gelagert werden. </li><li> Beimpfen eines 250 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der Flüssigkeit BY-2-Medien und einem einzigen Stück BY-2 Kallus (&gt; 1 cm Durchmesser) gezüchtet auf festen BY-2-Medien (flüssig BY-2-Medien mit Zusatz von 1% Agar) und Dichtung mit Aluminiumfolie. Inkubiere Kultur bei 28-30 ° C unter Schütteln für 5 Tage. HINWEIS: BY-2-Kallus wird auf festen Medien zur Langzeitlagerung aufrechterhalten, wie Flüssigkulturen schnell überwuchern wird. Kultur Volumen kann je nach Bedarf eingestellt werden, in der Regel eine 100-ml-Kultur fähig sein wird, dreiunddreißig 6-w des Ladensell-Platten. </li><li> Transfer 2 ml log-Phase BY-2-Kultur zu 98 ml frischem BY-2-Medien und Inkubation für 5-7 Tage bei 28-30 ° C unter Schütteln. Hinweis: Sub-Kultivierung von etablierten Flüssigkulturen können regelmäßig durchgeführt werden, unter Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von 5-7 Tage alten Kulturen, anstatt Inokulation mit Kallus. </li><li> Mischen Sie die Kultur gründlich, wie Zellen sich schnell absetzen und Transfer 6 ml der Zellkultur zu einem 15 ml konischen Boden Zentrifugenröhrchen und lassen Sie die Zellen für mindestens 10 min absetzen. Stellen Sie das gepackte Zellvolumen auf 50% des Gesamtvolumens von Überstand zu entfernen. </li><li> Shake Tube durch Umdrehen und pipettieren 500 ul in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte für die Verdauung. Verwenden Sie weiter Bohrung Pipetten, die Zellen in diesem Stadium zu übertragen, da sie dicht sind und verstopfen Standard-Pipettenspitzen. </li></ol> 2. Isolierung von Protoplasten <ol><li> Schalten Sie alle Komponenten des Robotersystems (Abbildung 1A) und öffnen Sie die Platte mover Prüfvorgänge planen weichWare. Die Task-Scheduling-Programm integriert die Mikromaschine mit den anderen Geräten Übertragung von Platten zwischen den einzelnen Geräten zu ermöglichen. </li><li> Vor dem Experimentieren, definieren Sie die technischen Spezifikationen für die Laborgeräte (zB Platten, Deckel) in das verwendete Protokoll sowie Start- und Endposition für jedes Stück labware, in der Platte Mover Software wie folgt: <ol><li> Klicken Sie auf Setup aus dem Hauptwerkzeugleiste in der Platte Mover Software und wählen Sie das Verwalten von Containertypen Befehl. </li><li> Wenn der Behältertyp wird in der bestehenden Containertyp Bibliothek aufgeführt, dann wählen Sie den entsprechenden Container. </li><li> Wenn der Behältertyp nicht in der vorhandenen Container Typbibliothek aufgeführt wird und klicken Sie auf Hinzufügen eines neuen Containertyp angeben. </li><li> Einen neuen Behältertyp, legen Sie die Dimensionen des neuen Behälters (Höhe, Breite, Stapelabmessungen und Greifer Offset) in den entsprechenden Registerkarten und klicken Sie auf Speichern Nach dem Hinzufügen.<ol><li> Wenn die richtigen Abmessungen des Herstellers nicht verfügbar sind, dann genau bestimmen alle Dimensionen auf den Millimeter genau Sätteln mit. Fehler, die die Behälterabmessungen bei der Messung wird zu einem Ausfall der Platte Mover führen. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 bis 2.2.4.1 für alle Containertypen, die die Platte Mover begegnen. Nach Abschluss dieses Schrittes für alle Labware, ist es notwendig, den Anfang und das Ende Position für jeden Behälter (Schritt 2.2.6) zu definieren. HINWEIS: Für dieses Protokoll die labware beinhaltet die 6-Well-Platte, die Deep-Well-Platte, und die 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte. </li><li> Um die Start- und Endposition jedes Behälters zu definieren, klicken Sie auf die Start / Ende Registerkarte in einem bestimmten Protokoll. Wählen Sie zuerst die Startposition jedes Behälters. Als nächstes überprüfen Sie die Box für Lidded / Unlidded sowohl an der Start- und Endposition. Wiederholen Sie dies für alle Container. HINWEIS: Wenn der Behälter auf einem anderen Stück EQU gelassen werdenipment (anstelle der Platte Mover) der Endstelle kann leer gelassen werden. </li></ol></li><li> Zu diesem Zeitpunkt manuell laden alle Platten in die Ausgangsposition für den gesamten Workflow. Laden Sie die 96-Well-fluoreszierenden Abschirmplatten in Hotel 2, 6-Well-Platten mit BY-2-Zellen in Hotel 3, eine 96 Deepwell-Platte, die für die Transformation verwendet wird, auf die Platte Heizung / Kühler Nest 2 und eine 50 ml konischen Rohr die Enzymlösung (siehe Supplemental Datei, Abschnitt 1.2.2) auf den Multimode Spender enthält. <ol><li> Wenn Transformation in dem Protokoll durchgeführt wird, vorge laden die 96 Deepwell - Platte mit 10 ul von Plasmid - DNA pro Well (1 ug / ul, A 260/280&gt; 1,8), das die OFP - Reporterkonstrukt und brüten auf der Platte Heizer / Kühler bei 4 ° C. Jede Vertiefung wird für eine einzige Transformation verwendet werden, wodurch die Anzahl von Vertiefungen auf der Versuchsaufbau gefüllt abhängen. </li></ol></li><li> Laden Sie alle Lieferungen und Platten auf dem Automated Liquid - Handling - Plattform in den dafür vorgesehenen Stellen und die Position der einzelnen Elemente in der Automatisierungssteuerungssoftware (Abbildung 1B) definieren. <ol><li> Legen Sie eine 96-Well - Platte vorbelastet mit 200 ul 40% PEG in MMg (0,4 M Mannit, 100 mM MgCl 2, 4 mM MES, pH 5,7) in Spalte 1, 200 &amp; mgr; l Propidiumiodid (PI, 1 ug / ml) in Spalte 2, und 200 ul Ethanol in Spalte 3 (Nest 2), und eine Schachtel mit Pipettenspitzen im Nest 8. </li><li> Die Lage des Labware in der automatisierten Liquid - Handling - Plattform - Software, wählen Sie Extras aus dem Menü und klicken Sie auf Labware Editor zu definieren. </li><li> Wählen Sie die Art von labware aus dem Pull - Down - Menü oder definieren einen neuen labware geben Sie die neue Labware - Taste. </li><li> Definieren Sie die Position jedes Stück labware ausgewählt durch das Hauptprotokoll Registerkarte auswählen und auf Konfigurieren Labware. Stellen Sie sicher, dass jedes Stück von Labware auf der automatisierten Liquid-Handling-Plattform platziert istdefiniert, bevor das Protokoll läuft. </li><li> Um die automatisierten Protokolle auslösen, klicken Sie auf das Profil Explorer - Fenster und wählen Sie den Namen des Protokolls ausgeführt werden (Isolierung von Protoplasten, Zellzahl und PEG-vermittelte Transformation). </li><li> Klicken Sie auf Ausführen , um alle Geräte zu initialisieren, die in dem Protokoll verwendet wird. </li><li> Schließlich wird in dem Fenster Arbeits Explorer, klicken Sie auf Arbeitseinheit hinzufügen alle Container / labware im System zu überprüfen und das automatisierte Protokoll beginnen. HINWEIS: Vollständige Beschreibungen der automatisierten Protokolle sind in der Supplemental-Datei enthalten. </li></ol></li></ol> 3. Stellen Sie Standardkurve für Zellzahlen <ol><li> Manuell konzentrieren Protoplasten in einer Konzentration von 1 x 10 6 Protoplasten / ml in einem Volumen von 1 ml. Zentrifuge Protoplasten bei 1.000 xg für 10 min, und entfernt den Überstand. </li><li> manuell hinzufügen 900 &amp; mgr; l 70% Ethanol zu der Protoplastenpellet (bei 4 ° C gehalten)und resuspendieren Sie das Pellet. Inkubieren für 10 Minuten auf Eis Zellen zu fixieren. </li><li> Füge 100 ul PI (1 ug / ml) zu den Protoplasten, die Kerne zu kennzeichnen und den Nachweis durch den Plattenleser. </li><li> Last 80 &amp; mgr; l Flüssigkeit BY-2-Medien in jeder Spalte und Zeile der 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte ab Spalte 2. </li><li> In der Spalte 1 einer 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte, fügen Sie 70 ul Protoplasten und 50 ul BY-2-Medien in jede Vertiefung in der Spalte. </li><li> Die Platte wird in Nest 6 der automatisierten Liquid-Handling-Plattform und führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung. <ol><li> Um eine serielle Verdünnung auf die automatisierten Liquid - Handling - Plattform durchzuführen, klicken Sie auf Wizard Serielle Verdünnungs starten und das Transfervolumen (60 ul), die Anzahl der Mischungen und Volumen (2, 70 &amp; mgr; l), anfängliche Brunnen (Spalte 1, Zeilen AF) einstellen, Verdünnung Brunnen (Spalten 2-11, Reihen AF) und ansaugen und abgeben Eigenschaften (0,5 mm von gut unten). </li><li> Nach der Einstellung der Parameter speichern eind das Protokoll führen. HINWEIS: Da alle Protoplasten mit PI (aufgrund Fixierung von Zellen) markiert sind, wird die Fluoreszenz ist proportional zur Konzentration Protoplasten. </li><li> Nachdem die serielle Verdünnung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus Nest 9 und in den Plattenleser ein und die Standardkurve Protokoll in der Plattenleser Software. HINWEIS: Eine Standardkurve wird dann durch einen Vergleich der Fluoreszenz von PI (Anregung 536 nm / Emission 620 nm) in jeder Vertiefung mit der bekannten Protoplasten Konzentration erzeugt werden. </li></ol></li><li> Nach Abschluss der Leserprotokoll Platte, entfernen Sie die Platte und sammeln Sie alle transgenen Zellen für Autoklaven oder anderen de-Vitalisierung Verfahren wie in Biosicherheit Protokolle definiert &quot;. </li></ol> 4. Die mikroskopische Analyse der Transformation <ol><li> Entfernen Sie Platte mit transformierten Protoplasten (das Produkt der automatisierten Protokolls 3, Supplemental - Datei) von Hotel 1 des Robotersystems. </li><li> Wendeauf inverses Mikroskop, Kamera und Leuchtstofflampe. </li><li> Wählen Sie das 10X-Objektiv für die erste auf den Protoplasten konzentriert, schalten Sie die Halogenlampe, und schließen Sie den Auslöser für die Leuchtstofflampe. </li><li> Lastplatte auf mikroskopisches System und Fokus auf den Protoplasten Hellfeld-. </li><li> Nachdem auf Protoplasten konzentriert, schalten Sie die Halogenlampe, und öffnen Sie den Auslöser für die Fluoreszenzlampe ausgeschaltet. </li><li> Wählen Sie das CY3 / TRITC-Filter-Set für die Visualisierung des pporRFP Proteins durch den transgenen Protoplasten zum Ausdruck gebracht. </li><li> Scannen Sie jede Vertiefung die Anzahl der Protoplasten zur Bestimmung der pporRFP Fluoreszenzmarker exprimieren. </li><li> Berechnen der Transformationseffizienz als die Gesamtanzahl der Protoplasten, die fluoreszierenden Markierung, um die Gesamtanzahl der Protoplasten exprimiert. </li><li> Sammeln Sie alle Platten transgenen Zellen in zugelassenen Biosicherheit Beutel für Autoklaven oder anderen de-Vitalisierung Verfahren enthalten, wie in Biosicherheit Protokolle &quot;definiert. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interesse haben.

Das oben beschriebene Protokoll wurde für Isolierung von Protoplasten, Aufzählung und Transformation mit der BY-2 Tabaksuspensionszellkultur erfolgreich validiert; jedoch könnte das Protokoll leicht an jede Pflanzensuspensionskultur erweitert werden. Derzeit Isolierung von Protoplasten und Transformation wurde in zahlreichen Pflanzen, darunter Mais (Zea Mays) 10, Karotte (Daucus carota) 32, Pappel (Populus euphratica) 33, Traube (Vitis vinifera) 34, Ölpalme (Elaeis guineensis) 35 erreicht , Kopfsalat (Lactuca sativa) 36, Senf (Brassica juncea) 37, Reis (Oryza sativa) 38 und Rutenhirse (Panicum virgatum) 39,40. Während Veränderung der Kultur und Aufschlussbedingungen auftreten von Spezies zu Spezies, in Bezug auf das Protokoll in dieser Arbeit entwickelt, Kulturmedien zu ersetzen oder die Bedingungen für die Grabung zu verändernestion sollte nicht das grundlegende Protokoll ändern. Einzustellen, um die Verdauung erforderlich auf unterschiedliche Arten, Kulturmedien und Enzyme geladen sind durch den Bediener vor der Initialisierung des Protokolls, wodurch diese Komponenten Swapping trivial. Als zusätzlichen Vorteil, ist das Protokoll mehrere Aufschlussbedingungen mit der Ausbeute an Protoplasten durch das System auch auf das Screening gemessen abänderbar. Dies ist ein wesentlicher Bestandteil, da die Verwendung von Low-Cost-Enzyme für die Hochdurchsatz-Anwendungen erforderlich sind, so ist es wichtig, die Menge an Enzymen in Verdauung verwendet zu minimieren. Ähnlich wie bei der Kultur und Verdauung, Modifikationen an dem Transformationsprotokoll würde erforderlich sein, wenn das System für die Transformation von Protoplasten aus verschiedenen Pflanzenarten isoliert Annahme. Eine bedeutende Arbeit wurde auf die Optimierung von PEG-vermittelte Transformation in Pflanzenprotoplasten 16,35, mit einer Vielzahl an Faktoren durchgeführt worden , um die Effizienz der Transformation zu beeinflussen. In der aktuellen work ein limitierender Faktor die Transformationseffizienz war die Größe des binären Testplasmids beeinflussen, 16.028 bp, die für die Zwecke der Modellierung einer genom Bearbeitung Plasmidgröße verwendet wurde. In früheren Studien über PEG-vermittelte Transformation von BY-2-Protoplasten wurde 40-60% Umwandlung erreicht; jedoch verwendet diese Studien kleine 5.000 bp Plasmide 41,42. Die primären Änderungen an PEG-vermittelte Transformation zwischen den Arten gehören , die Konzentration von PEG und MgCl 2, Menge und Konzentration der DNA und Reaktionsdauer. Da die PEG und MgCl &amp; sub2 ; -Lösungen in das System auf der Reagensschicht Platte eingeführt werden, und die DNA wird vorinstalliertes in die Deepwell - Platte können diese Bedingungen leicht modifiziert werden , in dem oben beschriebenen Protokoll. Zusätzlich zu erhöhen oder die Inkubationszeit abnimmt, bei gleichzeitiger Änderung der Mischgeschwindigkeiten können präzise durch die Roboter-Plattform gesteuert werden. Die Strombegrenzung des Transformationsprotokolls ist das FehlenScreenen der Plattenlesegerät unter Verwendung der fluoreszierenden Reporter zu erfassen, aufgrund der geringen Effizienz der PEG-vermittelte Transformation in BY-2-Protoplasten. In anderen Arten, wie Arabidopsis thaliana und Mais 16, PEG-vermittelte Transformation ist 40-90% effizient. In solchen Systemen Trans schnell charakterisiert werden, um den Plattenleser auf dem Roboter. Somit wäre es möglich, Vertiefungen mit positiven Transformanten zu identifizieren, und auch das Niveau der Expression zu quantifizieren. Für Anwendungen, wie beispielsweise Promotor-Screening, würde dieses Merkmal die Nützlichkeit des aktuellen Protokolls zu erhöhen, und wird in späteren Iterationen des Systems hinzugefügt werden. Neben der Optimierung der Transformationseffizienz für die BY-2-Protoplasten, mehrere Modifikationen möglich, die Effizienz und den Gesamtdurchsatz des Systems zu erhöhen. Frühere Studien über die Automatisierung der Protoplasten-Transformation von Protoplasten erlaubt, auf den Boden von Vertiefungen vor der Zugabe zu begleichen warh Lösungen 43. In der aktuellen Protokoll, Protoplasten wurden auf dem Plattenschüttler gemischt, um ein Absetzen zu verhindern und die Protoplasten in der Schwebe halten flachen Boden-Well-Platten verwendet wird. Ferner wird während der Transformation wurden Protoplasten nicht erlaubt in den Deep-Well-Platten zu regeln, um die Belichtung zu PEG zu reduzieren, die toxisch über längere Exposition sein kann. Als solche wurden die Protoplasten ~ 10-fach mit W5 - Lösung verdünnt , wenn sie aus dem Deep-Well - Platte mit dem 96-Loch - Fluoreszenzschirmplatte übertragen, was zu 1,23 x 10 3 ± 4,66 x 10 1 Protoplasten pro Vertiefung. Um die Anzahl von Protoplasten nach der Transformation ein Inkubationsschritt die Protoplasten zu regeln, und der Überstand entfernt, gefolgt von der Zugabe einer kleineren Flüssigkeitsvolumen BY-2-Medien zu ermöglichen, könnte übertragen zu erhöhen zugegeben. Außerdem, wenn eine Plattenbasis Zentrifuge zu dem System hinzugefügt wurde, konnte dieser Schritt schneller erreicht werden. Eine weitere Modifikation, die Funktionalität hinzufügen könnte zu ter System würde die Verwendung eines lebenden / toten Fluoreszenzassay sein, um die Lebensfähigkeit der isolierten Protoplasten vor der Transformation zu bestimmen. In dem aktuellen Protokoll wurde Fluoreszeindiacetat (FDA) als Live-Farbstoff getestet; jedoch verdeckt die BY-2-Protoplasten Hintergrundfluoreszenz der FDA-Signal. Wenn ein stabiler Lebensfähigkeit Farbstoff verwendet wurde, dann könnte die Protoplasten Lebensfähigkeit als das Verhältnis der roten bestimmt werden (PI) zu grün (Calcein AM, etc.) Fluoreszenz und standardisiert ähnlich der Zellzählung Protokoll. Diese Änderungen würden fügen weitere Funktionalität in das System und wird in Zukunft Protokolle aufgenommen werden. Im Hinblick auf die aktuelle Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte, die den Erfolg des Protokolls zu gewährleisten, die befolgt werden müssen. Erstens ist das Alter / Gesundheit der BY-2-Kulturen wesentlich, dass tragfähige Protoplasten zu garantieren für den nachfolgenden Schritten isoliert werden. in Schritt 1.3, Wie von einer log-Phase Kultur in einen frischen Kolben auf eine Übertragung01.50-Verhältnis von Zellen in frisches Medium, und man die Kultur für 5-7 Tage, die maximale Anzahl an lebensfähigen Protoplasten zu wachsen, isoliert werden. Erlauben die Kulturen für kürzere oder längere Laufzeiten mit dem angegebenen Inokulums wachsen wird die Protoplasten-Ausbeute deutlich zu reduzieren, und Versagen der nachfolgenden Protokolle führen. Ein zweiter wichtiger Schritt ist Schritt 1.5, da die Verwendung von Standard-Pipettenspitzen, anstelle der Breit Bohrung Pipettenspitzen angegeben, werden die Spitzen führen zu verstopfen und auf die falsche Volumina führen übertragen werden. Im Hinblick auf den Aufbau des Robot-Systems, die Anordnung der Platten auf dem automatisierten Liquid-Handling-Plattform, Schritt 2.4, ist von entscheidender Bedeutung, mit einem modifizierten Setup den Kopf des Liquid Handler verhindert Erreichen alle Vertiefungen auf der 6-Well-Platte. Aufgrund der Konstruktion der Flüssigkeitshandhabungsplattform automatisiert, muß die Platte mit 6 Vertiefungen in Nest 5, oder Protokolle für dieses Instrument fehl ausgewählt platziert werden. In ähnlicher Weise nicht korrekten Labware in der Platte definierenMover-Software, Schritt 2.2, führt dazu, dass das Instrument zu greifen zu versagen, oder die labware in Beendigung des Protokolls resultierenden fallen. Für den Zellzahl-Protokoll beinhaltet die kritische Schritt der Fixierung der Zellen mit Ethanol, Schritt 3.2. Wenn Zellen, die nicht mit PI vor der Markierung fixiert sind, werden nur nicht lebensfähige Zellen markiert, statt der gesamten Population von Protoplasten werden, und es wird nicht möglich sein, die Anzahl von Protoplasten isoliert zu zählen. Die endgültige kritischer Schritt, Schritt 4.6 beinhaltet die Auswahl der Leuchtstofffilter für die mikroskopische Analyse der Expression des pporRFP Fluoreszenzmarker. Die Verwendung anderer &quot;red&quot; Filtersätze können für die Hintergrundfluoreszenz von Chlorophyll, signifikant das Signal in allen Chloroplasten enthaltenden Protoplasten Erhöhung Berechnung der Transformationseffizienz verhindert wird. Sorgfältig in diesen kritischen Schritte zu den Spezifikationen Einhaltung garantiert die größte Chance für den Erfolg und die Erzeugung der reproduzierbaren Datenet.

In den letzten Jahren hat es erhebliche Impulse auf die Gestaltung von transgenen Kulturen gelegt worden , um verschiedene Krankheiten 1, verleihen Herbizidresistenz 2, verleihen Dürre 3,4 und Salztoleranz 5, verhindern Herbivorie 6, erhöhen Biomasseertrag 7 und verringern Zellwand Widerspenstigkeit überwinden 8. Dieser Trend wurde durch die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge zur Erzeugung transgener Pflanzen Aided, einschließlich Genom-Bearbeitung mit CRISPR und Talens 9 und Gen durch dsRNA - Silencing 10, miRNA 11 und siRNA 12. Während diese Technologien die Erzeugung transgener Pflanzen vereinfacht haben, haben sie erstellt auch einen Engpass, wo die schiere Anzahl der transgenen Pflanzen erzeugt wird, nicht traditionellen Systemen mit gescreent werden, die auf die Pflanzenregeneration verlassen. Im Zusammenhang mit diesem Engpass, während zum Schweigen zu bringen und Genom-Editing-Konstrukte schnell in Pflanzen eingeführt werden kann, sind viele dergezielte Züge nicht den gewünschten Effekt zu erzeugen, die oft erst entdeckt, wenn Pflanzen im Gewächshaus analysiert werden. In dieser Arbeit haben wir ein Verfahren zur schnellen, automatisierten Hochdurchsatz-Screening von Pflanzenprotoplasten entwickelt, die speziell den aktuellen Engpass in der frühen Screening einer großen Anzahl von Genombearbeitung und Gen-Silencing Ziele zu adressieren. Die Verwendung von Protoplasten zu intakten Pflanzenzellen gegenüber, hat mehrere Vorteile für die Entwicklung eines automatisierten Plattform. Zuerst Protoplasten werden aber nach Aufschluss der Pflanzenzellwand isoliert und mit dieser Barriere nicht mehr vorhanden ist , wird die Transformationseffizienz 13 erhöht. In intakten Pflanzenzellen gibt es nur zwei etablierte Methoden zur Transformation, Biolistik 14 und Agrobacterium -vermittelte Transformation 15. Keines dieser Verfahren kann leicht an Liquid-Handling-Plattformen übersetzt werden, wie Biolistik erfordert spezielle Ausrüstung für transformation, während Agrobacterium -vermittelte Transformation erfordert Kokultur und anschließende Entfernung der Bakterien. Weder sind zugänglich für Hochdurchsatzverfahren. Im Falle von Protoplasten wird routinemßig Transformations 16, unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) -vermittelte Transfektion durchgeführt , die nur mehrere Lösungs Austausch erfordert, und ist ideal für Liquid - Handling - Plattformen geeignet. Zweitens, Protoplasten, per Definition, Single-Zellkulturen sind, und damit die mit Verklumpung und Kettenbildung verbundenen Probleme in pflanzlichen Zellkulturen, die nicht in Protoplasten beobachtet. Im Hinblick auf die schnelle Screening eine plattenbasierte Spektrophotometer, Verklumpung von Zellen, oder Zellen in mehreren Ebenen werden in den Erwerb konsistente Messungen zu Schwierigkeiten führen. Da Protoplasten auch dichter ist als die Kulturmedien sind, sedimentieren sie auf den Boden des Wells, um eine Monoschicht bilden, die für plattenbasierte Spektrophotometrie förderlich ist. Schließlich, während Pflanzenzellkulturen sind primarily aus Kallus 17 abgeleitet, Protoplasten können aus einer Anzahl von Pflanzengeweben geerntet werden, zu der Fähigkeit führt die gewebespezifische Expression zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Fähigkeit, Wurzel- oder blattspezifische Expression eines Gens kann sehr wichtig sein, um Phänotyp Vorhersage zu analysieren. Aus diesen Gründen sind die in dieser Arbeit entwickelten Protokolle wurden validiert Protoplasten isoliert von der weit verbreiteten Tabak (Nicotiana tabacum L.) &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) Suspensionskultur mit. Die BY-2 - Suspensionskultur wurde als &quot;HeLa&quot; Zelle von höheren Pflanzen beschrieben worden ist , wegen seiner allgegenwärtigen Einsatz in der molekularen Analyse von Pflanzenzellen 18. Kürzlich wurden BY-2 - Zellen verwendet , um die Effekte der Pflanze zu untersuchen Stressoren 19-22, intrazelluläre Proteinlokalisation 23,24 und Grund Zellbiologie 25-27 der breiten Verwendbarkeit dieser Kulturen in Pflanzenbiologie demonstriert. Ein zusätzlicher Vorteil der BY-2 Kulturen ist dieFähigkeit , die Kulturen mit Aphidicolin zu synchronisieren, was zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit für Genexpressionsstudien führen kann 28. Darüber hinaus wurden für die Extraktion von BY-2 - Protoplasten unter Verwendung von Low-Cost - Enzyme 29,30, als Enzyme traditionell verwendet zur Erzeugung von Protoplasten sind unerschwinglich für Hochdurchsatz - Systeme Methoden entwickelt. Als solches beschriebene Protokoll unter validiert wurde die BY-2-Suspensionskultur verwendet, aber es sollte auf jede Pflanzenzellsuspensionskultur abänderbar ist. Proof-of-Concept - Experimente werden mit einem Orange - Fluoreszenz - Protein (OFP) Reporter - Gen (pporRFP) von den Hartkorallen Porites ausgeführt Porites- 31 unter der Kontrolle des CaMV 35S - Promotors.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td>7000190</td><td></td></tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap microscope camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost cellulase</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase/arabinase</td></tr><tr><td>Linsmaier &amp;amp; Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Formerly Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96-well 1.2 ml deep well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical bottom plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

Im letzten Jahrzehnt gab es ein Wiederaufleben in der Verwendung von Pflanzenprotoplasten gegeben, die von Modellarten reichen Spezies zu beschneiden, für die Analyse von Signalwegen, Transkriptionsregulationsnetzwerke, die Genexpression, Genom-Bearbeitung und Genin. Darüber hinaus wurden erhebliche Fortschritte bei der Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten hergestellt worden, die noch mehr Interesse an der Nutzung dieser Systeme für Pflanzengenom erzeugt hat. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Automatisierung der Isolierung von Protoplasten und Transformation von einem &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) Tabaksuspensionskultur unter Verwendung einer Roboterplattform entwickelt. Die Transformationsverfahren wurden unter Verwendung eines orangefarbenen fluoreszierendes Protein (OFP) Reportergen (pporRFP) unter der Steuerung des Mosaikvirus 35S-Promotor Cauliflower validiert (35S). OFP-Expression in Protoplasten wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie bestätigt. Die Analysen enthalten auch Protoplasten Produktionseffizienz Methoden propidium Jodid. Schließlich wurden Low-Cost-Lebensmittel-Grade-Enzyme für die Protoplasten-Isolierungsverfahren verwendet, wodurch die Notwendigkeit für Labor-Grade Enzyme zu umgehen, die im Hochdurchsatz automatisierte Isolierung von Protoplasten und Analyse zu kostspielig sind. Basierend auf dem Protokoll in dieser Arbeit entwickelt wurde, kann der gesamte Vorgang von Isolierung von Protoplasten zur Transformation durchgeführt werden, in weniger als 4 Stunden, ohne Eingabe vom Bediener. Während das Protokoll in dieser Arbeit entwickelte mit der BY-2-Zellkultur bestätigt wurde, sollten die Verfahren und Methoden auf jede beliebige Pflanze Suspensionskultur / Protoplasten System übersetzbar sein, die Beschleunigung von Pflanzengenomforschung ermöglichen soll.

In der gegenwärtigen Studie variierte die Verdopplungsrate des BY-2 14 bis 18 h in Abhängigkeit von der Temperatur, bei der die Kulturen wurden, im Einklang mit früheren Berichten einer mittleren Zellzykluslänge von 15 Stunden inkubiert. Mit dieser Verdopplungsrate, eine 1: 100 Ausgangs Inokulum wurde verwendet, um Kulturen zu starten, was zu Kulturen mit einem gepackten Zellvolumen (PCV) von 50% in 5-7 Tagen. In dem aktuellen Protokoll, in denen Kulturen in 200 ml Medium gezüchtet wurden, eine PCV von 100 ml wurde in 7 Tagen, die genug Zellen 33 versehen, Platten mit 6 Vertiefungen zu füllen. In Bezug auf die Protoplasten Ausbeute, die Verdauung an den im Protokoll festgelegten Bedingungen erzeugt 4,70 x 10 5 ± 5,77 x 10 3 Protoplasten pro Vertiefung, was zu 2,82 x 10 6 Protoplasten pro 6-Well - Platte (2A). Basierend auf diesen Daten, 214 96-Well-Platten (70 &amp; mgr; l Protoplasten pro Vertiefung) könnte aus einer einzigen Platte mit 6 Vertiefungen Verdauung, mit dem Potential geladen werden for zwei 6-Well-Platten gleichzeitig verdaut werden, wobei die beiden Plattenheizung / Chiller Stationen verwendet. Somit ist die maximale Anzahl von Protoplasten , die während einer einzigen dreistündigen Aufschluss Protokoll erzeugt werden kann , 5.64 x 10 6. Während die Gesamtanzahl der Protoplasten pro Verdau Protokoll erzeugt eine Metrik für das System bereitstellt, ist es auch notwendig, den Verlust in Protoplastenkonzentration zu bewerten als die Protoplasten durch die verschiedenen Schritte des Protokolls übertragen werden. Als solche wurde die Konzentration der Protoplasten nach jedem Übertragungsschritt in dem Protokoll ausgewertet. Nach der Verdauung Protokoll, 1,15 x 10 4 ± 1,35 x 10 2 Protoplasten wurden in jede Vertiefung der 96 tief-Well - Platten übertragen, wenn das Transformationsprotokoll durchführt oder die 96-Well - Fluoreszenzschirmplatte (2B). Sobald das Transformationsprotokoll abgeschlossen wurde, 1,23 x 10 3 ± 4,66 x10 1 Protoplasten wurden auf die Platte mit 96 Vertiefungen übertragen Fluoreszenzscreening (Abbildung 2C). Neben der Anzahl der Protoplasten übertragen, war es wichtig, die Lebensfähigkeit der Protoplasten, um zu bestimmen, um sicherzustellen, dass mehrere Pipettieren Stufen hat der Protoplasten nicht beschädigen. Basierend auf den Ergebnissen aus der Lebensfähigkeitstest, 95,1 ± 0,04% der Protoplasten nach dem Verdau, 92,1 ± 0,06% nach der Übertragung auf den 96-well Fluoreszenz Abschirmblech lebensfähig waren, und 91,7 ± 16,67% nach dem Transformationsprotokoll. Trotz mehreren Pipettierschritten, gab es keinen signifikanten Unterschied (p&gt; 0,44) zwischen irgendeiner der Proben. Zusätzlich zu dieser Maßnahme der Lebensfähigkeit wurde ein Protokoll zur Bestimmung der Konzentration von Protoplasten in jedem Stadium des Verfahrens durch Messen der Gesamtanzahl der Protoplasten, gefärbt mit PI. Wie in 3 gezeigt, wurde eine Standardkurve generated durch die Fluoreszenzintensität für bekannte Konzentrationen von Protoplasten aus dem System zu messen. Die Standardkurve war eine gute Passform (R 2 = 0,967) mit der Gesamtanzahl der Protoplasten , um den Bereich von 0 bis 30.000 Protoplasten pro Vertiefung überspannt. Um die Standardkurve zu validieren, die Fluoreszenzintensität von Proben mit einer bekannten Anzahl von Protoplasten (8.125 und 24.375, berechnet unter Verwendung eines Hämozytometers) erhalten wurde, und die Anzahl von Protoplasten aus der Gleichung der Standardkurve berechnet. Basierend auf diesen Ergebnissen, prognostizierte die Standardkurve 9560 und 28.200 Protoplasten in jeder Vertiefung, 15 und 14% Fehler. Bedenkt man, dass es bei der Messung der Zellzahl unter Verwendung einer Zählkammer auch Variabilität ist, wurde dieser Fehler als akzeptabel erachtet. Zusätzlich zu den Ergebnissen der Zellzahl und Lebensfähigkeit wurde das Transformationsprotokoll erfolgreichen transgenen Zellen in generieren , die OFP exprimieren (Figur 2D - F). Leider verwendet das Protokoll führte zu niedrig, ~ 2%, Transformationseffizienz, aufgrund der großen 16.028 bp binäres Plasmid in dieser Studie verwendet und da das Protokoll nicht spezifisch für die BY-2-Protoplasten optimiert. Optimierung des Transformationsprotokolls, in Bezug auf die Reagentien und Reaktionsbedingungen speziell für die BY-2-Protoplasten, wird erwartet, dass die Transformationseffizienz zu erhöhen, wie in der Diskussion erläutert. In Bezug auf dieses Protokoll wurde das Transformationsverfahren entwickelt, um die Proof-of-Concept-Weg von Isolierung von Protoplasten zur Transformation zu demonstrieren, und war erfolgreich bei der Erreichung dieses Ziels. Nach dem erfolgreichen alle einzelnen Verfahren der Validierung, Metriken wurden für den Zeitverlauf des Protokolls von Isolierung von Protoplasten zur Transformation erhalten. Wie in Figur 4 gezeigt, ist die große Investition von Zeit während der Verdauung der Bühne verbracht, in denen 3 Stunden erforderlich war , for vollständige Verdauung der Zellwand und die Freisetzung der Protoplasten. Während dieses Vorgangs sind 18 Schleifen zwischen dem Plattenschüttler und Plattenheizung / Chiller 1 Inkubationsstation, mit der Platte Mover Bewegen der Platte zwischen den beiden Stationen laufen. Die Transferzeit zwischen dem Plattenschüttler und Plattenheizung / Kühler 1 dauert nur 8,9 Sekunden, und stellt sicher, dass die Mehrheit der Verdauung Verfahren ausgegeben Inkubation und Schütteln. Die Gesamtzeit vom Beginn des Verfahrens Laden der Enzyme durch die Multi-mode Spender abzuschließen beträgt 2,2 min. Insgesamt ist die vollständige Isolierung von Protoplasten Protokoll in 3 Stunden und 22,8 Minuten beendet. Basierend auf diesen Ergebnissen, 88% der Protoplasten-Isolierungsprotokoll ausgegeben verdauen. Nach Beendigung der Protoplasten-Isolierungsprotokoll wird das Transformationsprotokoll begonnen und innerhalb von 27,5 min abgeschlossen. Ähnlich wie bei der Isolierung von Protoplasten-Protokoll, 72% des Transformationsverfahren wird die Reaktion ausgegeben Inkubation. Der einzige andere Schritt in dem Protokolldass eine signifikante Zeitkomponente (&gt; 10% der Gesamtverfahrenszeit) ist die Initialisierung des Protokolls durch das automatisierte Flüssigkeitshandhabungsplattform, die für 14% der Gesamtzeit in dem Verfahren entfallen. Auf diese Weise wird 86% des Protokolls bei der Initialisierung und Inkubation ausgegeben, mit nur 14% der Zeit auf Pipettieren und Transferschritte ausgegeben. Die gesamte Dauer der Isolierung von Protoplasten und Transformation war 3 Stunden, 50 Minuten und 53 Sekunden, ohne externe Eingabe vom Bediener erforderlich. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54300/54300fig1.jpg" /> Abb . 1: Schematische Darstellung der Roboter - Plattform und die Konfiguration der automatisierten Liquid - Handling - Plattform während des Protokolls (A) Das Robotersystem besteht aus drei Plattenstapel / Hotels, die von der Plattenmaschine zugegriffen werden kann. Hotel 1 ist der designierte lidding / delidding Station, 2 Hotel ist die 96-Well-FluoreszenzPlattenstapel und Hotel 3 ist der 6-Well-Plattenstapel. Das System hat zwei Flüssigkeitslader, eine automatisierte Flüssigkeitshandhabungsplattform, und eine Düsenbasis Multimode-Dispenser. Zum Heizen / die Roboterplattform Kühlung hat zwei Platten Heiz- / Kühleinheiten, zusammen mit einem Plattenschüttler, um die Platte zu mischen. Schließlich weist das System einen Monochromator-basierten Plattenlesegerät für die Fluoreszenzmess. Alle Komponenten sind in einem speziell angefertigten Sicherheitswerkbank untergebracht. (B) Startkonfiguration der automatisierten Liquid - Handling - Plattform mit Nest 2 durch das Reagenz Platte belegt und der Spitze Kasten gelegt auf Nest 8. (C) Konfiguration von automatisierten Liquid - Handling - Plattform vor dem Aufruf ein experimentelles Protokoll. Ein Deepwell - Platte auf Nest 4, eine 96-Well - Fluoreszenzschirmplatte befindet sich auf Nest 6 und die 6-Well - Platte , die Protoplasten befindet sich am Nest 5. befindet <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54300/54300fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54300/54300fig1large.jpg" target="_blank">um v</a><html> IEW eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54300/54300fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Bilder von BY-2 - Protoplasten nach jeder Übertragung und nach der Transformation mit dem orangefarbenen fluoreszierenden Protein - Reportergens (A - C) Mikroskopische Aufnahmen von BY-2 - Protoplasten Dichte in 6-Well - Platte, 96-Well - Platte nach der Übertragung von 70. ul aus der 6-Well-Platte, und 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte nach der Transformation. (D) Hellfeldmikroskopische Aufnahme von BY-2 - Protoplasten nach der Transformation. (E) Fluorescent BY-2 - Protoplasten die OFP - Gen exprimiert visualisiert ein Cy3 / TRITC - Filtersatz verwendet wird . (F) Überlagerung von Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der geringen Effizienz der Transformation zu demonstrieren. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54300/54300fig3.jpg" /> Fig . 3: Standardkurve zur Berechnung der Anzahl von Protoplasten Die Anzahl der Protoplasten in ein gut gegeben kann durch Vergleich der Fluoreszenzintensität in willkürlichen Einheiten (AU), um die Gleichung für die Standardkurve berechnet werden. Validierung der Protoplastenzahl wurde zwischen der Standardkurve und Hämozytometer an dem Punkt auf dem Diagramm angegeben, verglichen mit 9561 Protoplasten aus dem Plattenlesegerät identifiziert und 8125 auf dem Hämocytometer gezählt. Insgesamt wurde ein Fehler von 15% zwischen den beiden Techniken gefunden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54300/54300fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54300/54300fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Re 4 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg &quot;/&gt; Abb . 4: Gantt - Diagramm für das beschriebene Verfahren zur Herstellung von BY-2 - Protoplasten und genetische Transformation Die Mehrheit des Protokolls, ~ 3 h wird auf die Verdauung der BY-2 - Zellen waren die Protoplasten zu erzeugen. Laden der Enzymlösung und Inaktivierung erfordern nur 12% der Gesamtverfahrenszeit. In ähnlicher Weise Inkubation der Transformationsreaktion auf dem Plattenschüttler entfallen 72% des Transformationsprotokolls. Insgesamt wird das Verfahren von Isolierung von Protoplasten bis genetische Transformation erreicht ist unter 4 Stunden (3 Stunden, 50 Minuten und 53 Sekunden). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54300/54300fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54300/54300fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ergänzende Datei: Automatisierte Protokolle für die Isolierung von Protoplasten, Zellzählung und PEG-vermittelte Transformation &lt;./ strong&gt; Komplett für den Einsatz in der Roboterplattform entwickelt Protokolle jeder der Aufgaben der oben aufgeführten erreichen in dieser Datei enthalten sind. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54300/Supplemental_File_Revised.docx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54300/Supplemental_File_Revised.docx" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

14.2K Aufrufe.  University of Tennessee, Knoxville.  Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte. 

Serie: A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Forschung

Genetik

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Biochemie

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biologie

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Biotechnik

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

Effiziente Polyethylenglykol (PEG) vermittelten Transformation von der Moss Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Eine einfache Methode zur Isolierung der Sojabohne Protoplasten und Anwendung auf vorübergehende Genexpressionsanalysen

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation or polyethylene glycol (PEG). Previous methods were developed to produce tens of thousands of transfected protoplasts at once. Here,&#160;we describe a straightforward method to isolate and transfect millions of leaf mesophyll protoplasts in maize (Zea mays L.). This streamlined process removes certain common protoplasting steps, such as washing in W5. Additionally, steps such as centrifugation, PEG-mediated transfection, and incubation have been modified to work with a greater number of protoplasts. The ability to express large libraries of plasmid constructs enables genome-scale experiments, such as massively parallel reporter assays in maize.

Here, we present a high-throughput protocol to transiently transfect millions of maize protoplasts for testing large libraries of plasmids in maize mesophyll cells.

Skalierbare Transfektion von Mais-Mesophyll-Protoplasten

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

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Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in