Diese Arbeit wurde durch den Schweizerischen Nationalfonds (Grants Nr. PZ00P2_126430 / 1 und PZ00P2_144595) unterstützt. Prof. C. Leumann ist dankbar für die Bereitstellung der Laborflächen und Geräte, sowie für seine ständige Unterstützung. Frau Sue Knecht ist für fruchtbare Diskussionen.

1. Synthese der modifizierte Nukleosidtriphosphate Der synthetische Ansatz gewählt wurde nach dem von Ludwig und Eckstein entwickelt, da diese Methode in der Regel zuverlässig und führt zu sehr wenige Nebenprodukte (Abbildung 1A) 39 Verfahren. <ol><li> Coevaporate die entsprechend 3&#39;-OAc-Nucleosid (typischerweise 0,1 mmol) zweimal mit wasserfreiem Pyridin (2 ml) und dann unter Vakuum über Nacht trocknen. Zur gleichen Zeit, trocken Tributylammoniumpyrophosphat (0,13 mmol) über Nacht unter Vakuum. </li><li> Lösen Sie das Nukleosid in einem Minimum von trockenem Pyridin (0,2 ml) und fügen trockenem Dioxan (0,4 ml) als Co-Lösungsmittel. Schließlich fügen 2-Chlor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0,11 mmol) und lassen bei Raumtemperatur für 45 Minuten reagieren. Anmerkung: Es ist bemerkenswert, dass besondere Sorgfalt sollte mit dem 2-Chlor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on-Reagenz entnommen werden. Ja sogar Lagerung dieses Reagenz unter Inertgas-Atmosphäre,hier nicht ausreicht, um seine Zersetzung zu verhindern. Somit ist die, die in diesem Zersetzung gebildete weiße Feststoff kann und sollte vor der Verwendung aus abgekratzt werden. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von Tributylammoniumpyrophosphat in trockenem DMF (0,17 ml) und frisch destilliertem Tributylamin (58 ul; Molekularsiebe nie hinzufügen). Hinzufügen der resultierenden Lösung zu dem Reaktionsgemisch (ein weißer Niederschlag erscheint, aber schnell verschwindet) und lassen bei Raumtemperatur für 45 Minuten reagieren. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von Iod (0,16 mmol) in Pyridin (0,98 ml) und H 2 O (20 ul) und zu der Reaktionsmischung, um die P &amp;agr; oxidieren (III)-Zentrum. Die entstehende dunkle Lösung auf Raumtemperatur für 30 min gerührt. </li><li> Verwenden eine 10% ige wässrige Lösung von NaS 2 O 3, die I 2-Überschuß zu löschen. Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum (die Temperatur des Wasserbades des Rotationsverdampfers muss unter 30 ° C gehalten werden). In H 2 O (5 ml) und erlauben dem mixture bei Raumtemperatur für 30 min stehen gelassen, um das zyklische Triphosphat-Rest hydrolysiert. </li><li> Auf dieser Stufe werden die Schutzgruppen in der Regel (dh 3&#39;-OAc und die Gruppen an den Seitenketten der Nukleobase) entfernt. Folglich fügen NH 4 OH (30% in H 2 O, 10 ml) zu dem rohen und rühre 1,5 Stunden bei Raumtemperatur und Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum. </li><li> 2 ml H 2 O und aufgeteilt in 2 Röhren. Hinzufügen von 12 ml einer 2% igen Lösung von NaClO 4 in Aceton und Zentrifuge (1.000 × g) für 30 min. Dieser Vorgang wird noch einmal wiederholt. Diese Ausfällung ermöglicht die Abtrennung der Lösungsmittel und Reagenzien für die Synthese von Triphosphat (die Ausfällung wird) verwendet, wodurch die anschließende RP-HPLC-Reinigung wesentlich vereinfacht. </li><li> Nach Lufttrocknung der ölige Rückstand, notieren Sie eine 31-P-NMR-Spektrum des Rohproduktes (Standardverfahren, siehe auch Liste der Materialien und Abbildung 3) undin 4 ml H 2 O lösen, Anmerkung: Diese Syntheseverfahren konzentriert sich hauptsächlich auf die Erzeugung von modifizierten Desoxynucleosidtriphosphate, aber ein sehr ähnliches Verfahren kann für die RNA-Gegenstücke (einfach durch Verwendung von 2 &#39;, 3&#39;-Bis-O-acetylierten Vorstufen) angewendet werden. </li></ol> 2. HPLC-Reinigung der modifizierte Nukleosidtriphosphate <ol><li> Herstellung einer 1 M Stammlösung von Triethylammoniumbicarbonat (TEAB): 40 <ol><li> Eine Lösung aus 1 Mol Triethylamin (139 ml) in ≈ 600 ml destilliertem und filtriert H 2 O </li><li> Bubble-CO 2 (Trockeneis und über eine Gaswaschflasche) in die Lösung unter kräftigem Rühren, bis ein pH-Wert von 7,6 erreicht ist (dies wird mindestens 10 Stunden dauern). Diese Stammlösung kann im Kühlschrank bis zu einem Monat aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Reinigung: <ol><li> Bereiten Sie zwei Pufferlösungen von der 1 M Lager: 2 L 50 mM TEAB in ultrareinem Wasser (Laufmittel A) einnd 1 l 50 mM TEAB in 50% MeCN (Laufmittel B). Entgasen beide Eluenten unter Vakuum und Rühren für 20 min (Aufmerksamkeit wird, um nicht den pH-Wert durch Entfernen von CO 2 während der Entgasung ändern erforderlich). </li><li> Vorbereitung einer Analyseprobe, indem 10 ul des rohen Triphosphat in 300 &amp;mgr; l destilliertem H 2 O und Injizieren in ein HPLC-System mit einer semi-präparative RP-Säule (C18) ausgerüstet ist und mit einem Gradienten von 0-100% B in 40 min (Abbildung 4). Stellen Sie die HPLC-Programm nach der R t des Triphosphats (was in der Regel der Hauptpeak im Chromatogramm) und das Diphosphat (die einen etwas niedrigeren R t hat). Das rohe Gemisch mit diesen Bedingungen und durch Entfernen frühen Fraktionen, die einige Diphosphat enthalten könnten. </li><li> Vereinen alle Fraktionen, die das Produkt enthalten und gefrierTrocken (die, um die Hydrolyse zu der unerwünschten diphosph Minimierung der Verdampfung am Rotationsverdampfer bevorzugtate). Coevaporate mehrmals mit Reinstwasser (zum Rest Triethylamin aus den Eluenten entfernen). Bewerten Sie die Reinheit der NMR-Triphosphat (beide 1 H-und 31 P-NMR) und MALDI-TOF durch Anwendung von Standardprotokollen (siehe Abbildung 5). Typische Ausbeuten durch Anwendung dieses Protokolls erhaltenen liegen typischerweise im Bereich von 30-70%, abhängig von dem Substrat. </li></ol></li></ol> 3. Primerverlängerungsreaktionen und TdT Polymerisation <ol><li> 5&#39;-Endmarkierung des Primers <ol><li> Mischungs 30 pmol der entsprechenden Primer (z. B. P1, Materialliste) mit 4 ul 10x-Polynukleotidkinase (PNK)-Puffer, 3 &amp;mgr; l γ-[32 P]-ATP, 1 ul PNK und ddH 2 O (für ein Gesamtreaktionsvolumen von 40 ul). Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 30 min und dann wärme deaktivieren Kinase (10 min bei 70 ° C). </li><li> Während der Markierungsreaktion vorbereitenein G10 Sephadex-Säule durch Einstecken einer 1 ml Pipettenspitze mit silanisierten Glaswolle und Füllen der Spitze mit G10-Lösung (10% in ddH2O, autoklaviert). Spin down und dreimal mit 500 ul ddH 2 O und einem letzten Waschen mit 50 ul ddH 2 O. Führen Sie das Reaktionsgemisch durch den G10 (um die freie radioaktive Markierung entfernen). </li><li> Gel reinigen (PAGE 20%) die radioaktiv markierten Primer und erholen sich durch die Anwendung der Andrang und genießen Verfahren (dh die Elution mit 500 ul einer wässrigen Lösung mit 1% LiClO 4 und 1 mm Netto 3 (pH 8) bei 72 ° C für 15 min). Ethanol Niederschlag und G10 entsalzen das eluierte Oligonukleotid. </li></ol></li><li> Primer-Extension-Reaktion <ol><li> Glühen 1 pmol radioaktiv markierten Primer P1, 10 pmol Primer P1 und 10 pmol Vorlage T1 (Materialliste) in 10x Reaktionspuffer (durch den Lieferanten der Polymerase verwendet werden zur Verfügung gestellt), indem Sie den tube in heißem (90-95 ° C) Wasser und durch die Möglichkeit, schrittweise abkühlen auf Raumtemperatur (über 45 min). </li><li> Setzen Sie die Röhrchen auf Eis und fügen Sie (wiederum) die dNTP-Cocktail (die sowohl die modifizierte und die natürlichen Triphosphate, 100 uM Endkonzentration) und 1 U der DNA-Polymerase (Vent (exo -) Klenow, Pwo oder 9 ° N m) und komplett mit Wasser (für eine Gesamtreaktionsvolumen von 20 ul). Inkubieren bei der optimalen Arbeitstemperatur des Enzyms (z. B. 60 ° C für 30 min bei Vent (exo -) verwendet wird). </li><li> In 20 ul-Stop-Lösung (Formamid (70%), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 50 mM), Bromphenolblau (0,1%), Xylencyanol (0,1%)), erhitzen die Proben (95 ° C, 5 min), cool unten (0 ° C), und lösen durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Visualisieren von Phosphor. </li></ol></li><li> TdT Polymerisation <ol><li> Jeweils 7 pmol Einzelstrang-Unmarkierte Primer P2 (Materialliste), 1 pmol radioaktiv markierter Primer in 1 ul TdT-Puffer 10x. </li><li> Setzen Sie die Röhrchen auf Eis und fügen Sie (wiederum) die dNTP-Cocktail (in ausreichender Konzentration zwischen 10 und 200 um liegt) und der Polymerase TdT (4 U). Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. Werden 10 ul der Stop-Lösung, Erwärmen der Proben (95 ° C, 5 min), Abkühlen (0 ° C) und löst durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE 15%). Visualisieren von Phosphor. </li></ol></li></ol> 4. PCR mit modifizierten Nucleosidtriphosphaten <ol><li> Mischen 8 pmol sowohl die Vorwärts-und Rückwärts-Primern mit 0,5 pmol der Template amplifiziert werden. In 10x Reaktionspuffer und die dNTP-Cocktail (für eine 200 uM Endkonzentration), das Glas auf Eis. 1 U der DNA-Polymerase und komplett mit H 2 O auf ein Endvolumen von 20 &amp;mgr; l zu erreichen. Übertragen Sie die Mischung in ein PCR-Röhrchen und führen 30 PCR-Zyklen.</li><li> Verdünnen 6 ul mit 6 ul 2x Saccharose-Ladepuffer und lösen durch Agarose 2%-Elektrophorese (gefärbt mit Ethidiumbromid). Visualisieren von Phosphor. </li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Einbeziehung von Änderungen in Nukleinsäuren ist von Interesse für viele praktische Anwendungen, einschließlich der Entwicklung von Antisense-und Antigen-Mittel 42,43, Kennzeichnung und Funktions Tagging von Oligonukleotiden 41 und bei den Bemühungen um die genetische Alphabet 44-46 ausbauen. Die chemischen Änderungen und Funktionsgruppen werden in der Regel durch die Anwendung von Standard-und automatisierte Festphasensynthese Protokolle in Nukleinsäuren eingeführt. Allerdings müssen die Phosphoramidit-Bausteinen robust zu den eher rauen Bedingungen mit dieser Methode, die wiederum legt eine starke Einschränkung auf die Art der chemischen Funktionalität 47 auferlegt werden. Stattdessen kann der Enzym-vermittelte Polymerisation modifizierte Nukleosidtriphosphate für die Einführung eines breiteren Spektrums von Funktionalitäten, da die einzige Einschränkung ist, dass sie als Substrate für Polymerasen 1,2 handeln. Auch wenn es einen spürbaren Mangel an generally Methodik anwendbar, zuverlässig und robust synthetischen und analytischen Methoden zur Synthese von modifizierten dNTPs entwickelt. Darüber hinaus aufgrund ihrer Natur modifizierte Triphosphate sind sehr empfindlich auf unterschiedliche äußere Bedingungen (zB pH-Wert, Temperatur) und damit ist ein detailliertes Protokoll für ihre Synthese und Charakterisierung von großem Nutzen. Die hier dargestellten Arbeitsablauf beinhaltet die chemische Synthese von modifizierten dNTPs, RP-HPLC-Reinigung, NMR-Analyse und Enzymassays für die biochemische Charakterisierung dieser Nukleosidanaloga. Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Synthese und Charakterisierung modifizierter dNTPs sind die Analyse des Rohproduktes (NMR), die gründliche HPLC-Reinigung, die Analyse des gereinigten Materials, und die Wahl eines geeigneten DNA (RNA)-Polymerase. Für die Synthese der modifizierten dNTPs verwendeten wir den von Ludwig und Eck-Methode,Stein 39, da weniger Nebenprodukte gebildet werden, im Vergleich zu anderen Verfahren, wenn auch auf Kosten eines etwas längeren Syntheseweg. Ferner die RP-HPLC-Reinigung stellt sicherlich die Schwenkstufe des gesamten Syntheseweg, da es zur Trennung der Nukleosiddiphosphate (dNDPs), die häufig stark hemmen DNA und RNA-Polymerasen, 48 zu ermöglichen. Nach Erreichen der Synthese und Reinigung, die Reinheit des resultierenden Triphosphat muss sowohl durch NMR-und MALDI-TOF bewertet, um sicherzustellen, daß keine Hemmung der Polymerase-Diphosphat vorliegt. Die in Fig. 6 gezeigte Inkorporationstest unterstreicht deutlich die Brauchbarkeit dieses Ansatzes. Tatsächlich alle der in diesem repräsentativen Beispiel verwendeten dNTPs zeigen gute Substrate für die DNA-Polymerase (in diesem besonderen Fall Vent (exo -)), da nicht schneller laufen Bändern entsprechend kleinere Fragmente beobachtet werden. BesIden, verträgt das Enzym zwei Substrate mit Carbonsäurereste (dU t P TP (3) und dC Val TP (7)) und die Polymerisation der beiden dNTPs Ergebnisse in einer Oligonukleotid-Lager nicht weniger als 39 weitere negative Ladungen geschmückt. Ein weiteres auffälliges Merkmal ist, dass die Bands aus dem Einbau von modifizierten dNTPs resultierenden oft langsamer elektrophoretische Mobilität zeigen als die natürlichen Kontrollen (vgl. zB Bahnen 11 und 12). Somit Primerverlängerungsreaktionen sind ein leistungsfähigen und einfachen Weg, um die Substratakzeptanz modifizierter dNTPs beurteilen. Darüber hinaus ist die TdT-vermittelte Polymerisation von Triphosphate auf das 3&#39;-Termini der einzelsträngigen Oligonukleotide ein anziehendes Strategie für die Erzeugung von hoch funktionalisierten Nukleinsäuren 49-52. Die in Fig. 7 gezeigten repräsentativen Beispiel zeigt deutlich das Verfahren für Selekting die Funktionalitäten, die durch die Co 2 +-abhängigen TdT 53 toleriert werden. Tatsächlich dU c P TP (1) und dU FP TP (3), die mit der proteinogenen Aminosäure L-Prolin und das Dipeptid ausgestattet sind α-Phe-Pro, jeweils die besten Substrate für die TdT und verursachte Tailing Effizienz, die positiv auf die unmodifizierten dTTP Steuer vergleichen, selbst bei so niedrigen Konzentrationen wie 10 uM (Spuren 1 und 4). Überraschenderweise analogen dU t P TP (2), wo die Prolin-Rest an den Linker Arm in trans Vergleich zu der freien Carbonsäure verbunden ist, ist nicht so gut ein Substrat als cis Gegen seit mehr polydisperse große Oligonukleotide sind nur bei höheren beobachtet dNTP-Konzentrationen (&gt; 100 uM, Spur 2). Darüber hinaus ist der Sulfonamid-modifizierten dNTP 5 eine moderate Substrat für TdT und vergleichbar mit dU <em&gt; t P TP (2) (Spur 3). Zusätzlich dU BPU TP (4), die eine starke Wasserstoffbrücken-spend Motiv trägt, ist ein ziemlich schlechtes Substrat für TdT und die Polymerisationsreaktion scheint indifferent zu der Konzentration des modifizierten dNTP sein. So kann die folgende Reihenfolge der Substratakzeptanz aus 7 ausgelegt werden: dU c P TP (1), dU FP TP (3)&gt; dU t P TP (2), dU Bs TP (5)&gt; dU BPU TP (4 ). Schließlich ist die für Polymerisationsreaktionen unter PCR-Bedingungen unter Verwendung der modifizierten Analoga beschriebenen Verfahren recht ähnlich, daß mit natürlichen dNTPs. Jedoch ist die Verträglichkeit der modifizierten dNTPs mit Polymerase unter diesen Bedingungen von entscheidender Bedeutung für die Erzeugung von High-Density-Funktionalitätenzed Nukleinsäuren 7, insbesondere im Hinblick auf ihre Verwendung in in vitro Selektionsexperimente. Zusammenfassend wurde die Methode für die Synthese und Charakterisierung von modifizierten Nucleosidtriphosphaten betont und die Einrichtung eines solchen Protokolls wird sicherlich in der Entwicklung und Crafting neuartiger Analoga helfen. Gleichzeitig wird das Auftreten eines solchen neuartigen dNTPs die Erzeugung von funktionalisierten Oligonucleotiden zu erleichtern; Insbesondere katalytische Nucleinsäuren.

<html> 5&#39;-Nukleosid-Triphosphate ((d) Hohlstunden) stellen eine Klasse von lebenswichtigen Biomolekülen, die in zahllosen Prozessen und Funktionen, angefangen davon, dass die universelle Währung der Energie, um Regulatoren der Zellstoffwechsel beteiligt sind. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei dieser grundlegenden biologischen Veränderungen, ihre modifizierten Gegenstücke als vielseitiger und leichter Plattform für die Einführung von funktionellen Gruppen in Oligonukleotide, einer Methode, die gut ergänzt die automatisierte Festphasensynthese, die normalerweise angewendet wird 1,2 schoben. Ja, vorausgesetzt, die (d) Hohlstunden können als Substrate für RNA-und DNA-Polymerasen 3, eine Fülle von Funktionsgruppen einschließlich Aminosäuren 4-13, Boronsäuren 14,15, nornbornene 16, diamantartige Rückstände 17, Seitenketten für handeln Organokatalyse 18, Gallensäuren 19 und sogar 20-Oligonukleotide können in Oligonukleotide eingeführt werden. _content &quot;&gt; Darüber hinaus repräsentiert eine günstige Vektor für die Funktionalisierung von Nukleinsäuren können modifiziert dNTPs in SELEX und andere kombinatorische Verfahren der in vitro-Selektion für die Erzeugung von modifizierten katalytischen 21-30 Nukleinsäuren und Aptamere für verschiedene praktische Anwendungen 10 in Eingriff gebracht werden, 31-36. Die zusätzlichen Seitenketten, die durch die Polymerisation der modifizierten dNTPs eingeführt werden, werden gedacht, um den chemischen Raum, die bei einem Selektionsexperiment erforscht werden können und ergänzen die eher schlechte funktionelle Arsenal von Nukleinsäuren 37 zu erhöhen. Trotz dieser attraktiven Eigenschaften und die jüngsten Fortschritte in der Entwicklung der beiden synthetischen und analytischen Methoden gemacht, keine allgemein gültige und hochverzinslichen Verfahren besteht für die Crafting-modifizierter Nucleosidtriphosphaten 2,38. Ziel dieses Protokolls ist es, Licht in die (manchmal) komplizierte Verfahren, die t Schuppeno Die Synthese und biochemische Charakterisierung dieser aktivierten Bausteine ​​(Abbildung 1B). Besonderer Wert wird auf alle synthetischen Details, die oft schwer zu finden oder nicht vorhanden sind in der experimentellen Abschnitte sind aber noch entscheidend für den erfolgreichen Abschluss des synthetischen Weg führt auf die Isolierung von reinem (d) Hohlstunden (Abbildung 1) gegeben werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">tributylammonium pyrophosphate&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P8533</td>
			<td style="width:215px;">Hygroscopic solid, keep under Ar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">324124</td>
			<td>Moisture sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Pyridine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">82704</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Dioxane</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">296309</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">40248</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Acetonitrile&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">90342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tributylamine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">90781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:333px;">ddH2O</td>
			<td style="width:109px;">Milli-Q</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">159220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:333px;">D2O</td>
			<td style="width:109px;">Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:143px;">DLM-4-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Biochemical reagents</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">g-[32P]-ATP</td>
			<td style="width:109px;">Hartmann Analytics</td>
			<td style="width:143px;">FP-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Natural dNTPs</td>
			<td style="width:109px;">Promega</td>
			<td style="width:143px;">U1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:333px;">Vent (exo-) DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">M0257S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">MO210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:333px;">9&#176;Nm DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">MO260S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)</td>
			<td style="width:109px;">Promega</td>
			<td style="width:143px;">M828A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Pwo DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">Peqlab</td>
			<td style="width:143px;">01 01 5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:109px;">Thermo Scientific</td>
			<td>EK0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)</td>
			<td style="width:109px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:143px;">10679.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Agarose</td>
			<td style="width:109px;">Apollo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BIA1177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">G10 Sephadex</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G10120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Urea</td>
			<td style="width:109px;">Apollo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BIU4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300&#197;)</td>
			<td style="width:109px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gene Q Thermal Cycler</td>
			<td style="width:109px;">Bioconcept</td>
			<td style="width:143px;">BYQ6042E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PCR vials</td>
			<td style="width:109px;">Bioconcept</td>
			<td style="width:143px;">3220-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">HPLC system</td>
			<td style="width:109px;">Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>&#196;kta basic 10/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">5&#39;-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">5&#39;-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">5&#39;-GAATTCGATATCAAG P2</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 &#8211; 13330</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleoside triphosphates - from synthesis to biochemical characterization

Die traditionelle Strategie für die Einführung von chemischen Funktionalitäten ist die Verwendung von Festphasensynthese durch Anhängen geeigneter Weise modifizierten Phosphoramidit-Vorläufern zu der entstehenden Kette. Jedoch sind die bei der Synthese und der Beschränkung auf eher kurze Sequenzen verwendeten Bedingungen behindern die Anwendbarkeit dieser Methode. Auf der anderen Seite werden modifizierte Nukleosidtriphosphate Bausteine, die für die leichte Einführung zahlreicher funktioneller Gruppen in Nukleinsäuren, eine Strategie, die den Weg für die Verwendung von modifizierten Nukleinsäuren in einer weitreichenden Palette von praktischen Anwendungen verwendet worden sind, ebnet aktivierten wie funktionelle Tagging und Generierung von Ribozymen und DNAzyme. Eine der größten Herausforderungen liegt in der Komplexität der Methode, die zur Isolierung und Charakterisierung dieser Nukleosid-Analoga. In diesem Video-Artikel, ein ausführliches Protokoll für die Synthese von thes präsentieren wire modifizierten Analoga mit Phosphor (III)-basierenden Reagenzien. Darüber hinaus wird das Verfahren für ihre biochemische Charakterisierung weitergegeben, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Primerverlängerungsreaktionen und TdT Tailing-Polymerisation. Diese detaillierte Protokoll wird für die Verwendung des Handwerks von modifizierten dNTPs und ihre weitere Verwendung in der chemischen Biologie sein.

Geändert Nucleosidtriphosphaten sind verlockend Syntheseziele, da sie ermöglichen die einfache Einführung einer Vielzahl von funktionellen Gruppen in Nukleinsäuren 41. Jedoch ist die Isolierung und Charakterisierung dieser aktivierten Bausteine ​​oft mühsam, offenbart ist. Daher sind die hier gezeigten Ergebnisse gedacht, um eine helfende Hand bieten, um die verschiedenen Schritte innerhalb der zuvor genannten synthetischen und biochemischen Verfahren (Abbildung 1B) zu folgen. Insbesondere Figur 3 zeigt ein typisches rohes 31 P-NMR-Spektrum eines modifizierten dNTP (in diesem speziellen Fall dU BPU TP (4) 18, Fig. 2), wobei die charakteristischen Signale der Phosphorzentren beobachtet werden (dh eine Dublett bei -5,02 (P-γ), ein Dublett bei -10,44 (P α) und einem Triplett bei -20,55 (P β) ppm). Darüber hinaus istignals ergeben für das Diphosphat (zwei Dubletts bei -4,84 und -10,63 ppm) und Monophosphat (Singulett bei -0.18 ppm) Nebenprodukte zusammen mit höheren Phosphate (Signale bei -21,02 und -23,19 ppm) werden immer in dieser Phase beobachtet. Eine erste RP-HPLC-Analyse der rohen Mischung wird auf Fig. 4 (für dU BPU TP (4)), wobei der Hauptpeak (R t = 30,78 min) dem 5&#39;-Triphosphat, während das Hauptnebenprodukt, das 5 &#39;-diphosphat, zeigt eine etwas geringere Retentionszeit (R t = 30,03 min). Schließlich, nach einer gründlichen RP-HPLC-Reinigung, muss das modifizierte dNTP durch NMR-und MALDI-TOF (Fig. 5) gekennzeichnet ist. Sowohl die 1 H-NMR und 31 P-NMR-Spektren sind von entscheidender Bedeutung für die Beurteilung der Reinheit der modifizierten dNTPs, da die Anwesenheit von unerwünschten Di-und Monophosphaten gibt Scheidungssignale. Nach der Gründung der Reinheit der Nukleoside analogen und Beurteilung der Konzentration der Stammlösung entweder mit Masse oder durch UV-Spektroskopie kann das modifizierte dNTP in Primerverlängerungsreaktionen, um dessen Substrataufnahmekapazität durch verschiedene Polymerasen Beurteilung verwendet werden. Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse der Primerverlängerungsreaktionen dU t P TP (2), dA Hs TP (6) und dC Val TP (7) entweder als Einzel Modifikationen (Spuren 5-7) als Kombinationen von zwei modifizierten dNTPs (Bahnen 8-10) oder zusammen zusammen mit dem einsamen Natur dGTP (Bahn 11). Schließlich zeigt Fig. 7 repräsentativ TdT-vermittelte Polymerisationen mit verschiedenen modifizierten dUTP-Analoga. In diesem Zusammenhang dU c P TP (1) und dU FP TP (3) sind die besten Substrate für die TdT (Spuren 1 und 4), da die Rückstand Effizienz vergleichbar<html> oder übertreffen die des natürlichen dTTP (Bahn 6). Stattdessen dU BPU TP (4) (Spur 5) ist ein ziemlich schlechtes Substrat ist in diesem Zusammenhang, da wenig mehr polydisperse großen Oligonukleotiden beobachtet werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51385/51385fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51385/51385fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. A) Ludwig-Eckstein-Ansatz für die Synthese von (Basis-) modifizierte Nucleosid-Triphosphate 39. B) Schematische Darstellung aller für die Synthese und biochemische Charakterisierung der modifizierten dNTPs vor ihrem Einsatz in Anwendungen wie SELEX erforderlichen Schritte. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51385/51385fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier zur Ansicht größeres Bild</a> . &quot;Fo: content-width =&quot; 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; 2. Chemische Strukturen der modifizierten Nukleosidtriphosphate: dU c P TP (1), dU t P TP (2), dU FP TP (3) dU BPU TP (4) dU B TP (5), 18 dA Hs TP ( 6) und dC Val TP (7) 13. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51385/51385fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51385/51385fig3.jpg" width="600px" /> 3. 31 P-NMR-Spektrum (121<html> 0,4 MHz, D 2 O) des rohen Reaktionsgemisches von dU BPU TP (4). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51385/51385fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51385/51385fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51385/51385fig4.jpg" width="600px" /> 4. RP-HPLC-Profil von Roh-dU BPU TP (4): 0-100% Laufmittel B in 40 min, Durchflussrate: 3,5 ml / min (Laufmittel A: 50 mM TEAB in H 2 O; Laufmittel B: 50 mM TEAB in H 2 O / CH 3 CN (1/1)). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51385/51385fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . / 51385fig5.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; 5. Charakterisierung der modifizierten Nukleosidtriphosphat dU B TP (5): A) 31 P-NMR-Spektrum (121,4 MHz, D 2 O, 128 Scans) 18 B) 1 H-NMR-Spektrum (300 MHz, D 2 O, 128 Scans ). C) MALDI-TOF-Spektrum <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51385/51385fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51385/51385fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51385/51385fig6.jpg" width="600px" /> 6. Bild repräsentative Gel (PAGE 15%) der Primer-Verlängerungsreaktionen mit verschiedenen Basis modifizierten dNTP-Analoga Spur 1:. Primer; Spur 2: natürliche dNTPs ohne dUTP; Spur 3: natürliche dNTPs ohne dATP; Spur 4: natürliche dNTPs ohne dCTP; Spur 5: dU &lt;em&gt; t P TP (2); Spur 6: dA Hs TP (6); Spur 7: DC Val TP (7); Spur 8: dA Hs TP (6) und dU t P TP (2); Bahn 9: dA Hs TP (6) und dC Val TP (7); Spur 10: dU t P TP (2) und dC Val TP (7); Spur 11: dU t P TP (2), dA Hs TP (6) und dC Val TP (7); Spur 12:. natürlichen dNTPs <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51385/51385fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51385/51385fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51385/51385fig7.jpg" width="600px" /> Abbildung 7. Bild Gel (PAGE 20%) der TdT Polymerisationsreaktionen mit verschiedenen Basis modifizierte dUTP-Analoga Spur 1:. DU c P TP (1); Spur 2: dU t P TP (2); Spur 3: dU Bs TP (5); Spur 4: dU FP TP (3); Spur 5: dU BPU TP (4); Spur 6: dTTP; Spur 7: Grundierung. Konzentrationen:. 10 uM, 25 uM, 50 uM, 75 uM und 100 uM <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51385/51385fig7highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Das hierin beschriebene Protokoll zielt darauf ab, zu erläutern und verkürzen die zahlreichen Hindernisse in den Weg der komplizierten Weg führt zu modifizierten Nukleosidtriphosphaten. Folglich dieses Protokoll erleichtert sowohl die Synthese dieser aktiviert Bausteine ​​und ihre Verfügbarkeit für die Praxis.

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

nucleoside-triphosphates-from-synthesis-to-biochemical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

17.0K Aufrufe.  University of Bern.  Das hierin beschriebene Protokoll zielt darauf ab, zu erläutern und verkürzen die zahlreichen Hindernisse in den Weg der komplizierten Weg führt zu modifizierten Nukleosidtriphosphaten. Folglich dieses Protokoll erleichtert sowohl die Synthese dieser aktiviert Bausteine ​​und ihre Verfügbarkeit für die Praxis. 

Serie: Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Forschung

Chemie

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Synthese und Charakterisierung von funktionalisierten Metall-organische Gerüste

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Metal-free Synthesis of Ynones from Acyl Chlorides and Potassium Alkynyltrifluoroborate Salts

Ynones are a valuable functional group and building block in organic synthesis. Ynones serve as a precursor to many important organic functional groups and scaffolds. Traditional methods for the preparation of ynones are associated with drawbacks including harsh conditions, multiple purification steps, and the presence of unwanted byproducts. An alternative method for the straightforward preparation of ynones from acyl chlorides and potassium alkynyltrifluoroborate salts is described herein. The adoption of organotrifluoroborate salts as an alternative to organometallic reagents for the formation of new carbon-carbon bonds has a number of advantages. Potassium organotrifluoroborate salts are shelf stable, have good functional group tolerance, low toxicity, and a wide variety are straightforward to prepare. The title reaction proceeds rapidly at ambient temperature in the presence of a Lewis acid without the exclusion of air and moisture. Fair to excellent yields may be obtained via reaction of various aryl and alkyl acid chlorides with alkynyltrifluoroborate salts in the presence of boron trichloride.

The goal of this manuscript is to demonstrate a straightforward method for the preparation of ynones from acyl chloride and potassium alkynyltrifluoroborate salt starting materials. The one-pot reaction proceeds rapidly in the presence of boron trichloride without exclusion of air and moisture.

Metallfreie Synthese von Inonen von Acylchloriden und Kalium Alkynyltrifluoroborate Salze

Ynones are a valuable functional group and building block in organic synthesis. Ynones serve as a precursor to many important organic functional groups ...

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

Die Synthese, Charakterisierung und Reaktivität von einer Serie von Ruthenium<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Komplexe

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

Synthesis, Characterization, and Functionalization of Hybrid Au/CdS and Au/ZnS Core/Shell Nanoparticles

Plasmonic nanoparticles are an attractive material for light harvesting applications due to their easily modified surface, high surface area and large extinction coefficients which can be tuned across the visible spectrum. Research into the plasmonic enhancement of optical transitions has become popular, due to the possibility of altering and in some cases improving photo-absorption or emission properties of nearby chromophores such as molecular dyes or quantum dots. The electric field of the plasmon can couple with the excitation dipole of a chromophore, perturbing the electronic states involved in the transition and leading to increased absorption and emission rates. These enhancements can also be negated at close distances by energy transfer mechanism, making the spatial arrangement of the two species critical. Ultimately, enhancement of light harvesting efficiency in plasmonic solar cells could lead to thinner and, therefore, lower cost devices. The development of hybrid core/shell particles could offer a solution to this issue. The addition of a dielectric spacer between a gold nanoparticles and a chromophore is the proposed method to control the exciton plasmon coupling strength and thereby balance losses with the plasmonic gains. A detailed procedure for the coating of gold nanoparticles with CdS and ZnS semiconductor shells is presented. The nanoparticles show high uniformity with size control in both the core gold particles and shell species allowing for a more accurate investigation into the plasmonic enhancement of external chromophores.

The synthesis of uniform gold nanoparticles coated with semiconductor shells of CdS or ZnS is performed. The semiconductor coating is conducted by first depositing a silver sulfide shell and exchanging the silver cations for zinc or cadmium cations.

Synthese, Charakterisierung und Funktionalisierung von Hybrid Au / CdS und Au / ZnS Kern / Schale-Nanopartikel

Plasmonic nanoparticles are an attractive material for light harvesting applications due to their easily modified surface, high surface area and large ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Synthese und Charakterisierung von supramolekularen Kolloid-

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and validated for the quantification of extracellular purine nucleotides and nucleosides produced by purified chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells under different culture conditions. The chromatographic separation of adenosine 5&#39;-monophosphate (AMP), adenosine (ADO) and inosine (INO) is performed at RT on a silica-based, reversed-phase column that is used for polar compound retention. The method includes a binary mobile phase, which consists of 7 mM ammonium acetate and acetonitrile with a flow rate of 1.00 ml/min. The eluates are monitored using a Photodiode Array UV detector set at 260 nm. A standard calibration curve is generated to calculate the equation for the analytical quantification of each purine compound. System control, data acquisition and analysis are then performed. Applying this protocol, AMP, INO and ADO elute at 7, 11 and 11.9 min, respectively, and the total run time for each sample is 20 min. This protocol may be applied to different cell types and cell lines (both suspension and adherent), using culture media as matrix. The advantages are easy and fast sample preparation and the requirement of a small amount of supernatant for analysis. Furthermore, the use of a serum-free medium allows skipping the protein precipitation step with acetonitrile that impacts the final concentration of purine compounds. One of the limitations of the method is the requirement of the equilibration column run before each single sample run, making the total run time of the experiment longer and preventing high throughput screening applications.

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single molecule level. An electrostatic self-assembly and covalent fixation (ESA-CF) process is used for the synthesis of the cyclic poly(tetrahydrofuran) (poly(THF)). The diffusive motion of individual cyclic polymer chains in a melt state is visualized using single molecule fluorescence imaging by incorporating a fluorophore unit in the cyclic chains. The diffusive motion of the chains is quantitatively characterized by means of a combination of mean-squared displacement (MSD) analysis and a cumulative distribution function (CDF) analysis. The cyclic polymer exhibits multiple-mode diffusion which is distinct from its linear counterpart. The results demonstrate that the diffusional heterogeneity of polymers that is often hidden behind ensemble averaging can be revealed by the efficient synthesis of the cyclic polymers using the ESA-CF process and the quantitative analysis of the diffusive motion at the single molecule level using the MSD and CDF analyses.

A protocol for the synthesis and characterization of diffusive motion of cyclic polymers at the single molecule level is presented.

Synthese cyclischer Polymere und Charakterisierung ihrer Diffusionsbewegung im geschmolzenen Zustand auf der Einzelmolekülebene

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe aims at lowering the band gap of imogolite, an insulator with the chemical formula (OH)3Al2O3SiOH, and at modifying its adsorption properties towards azo-dyes, an important class of organic pollutants of both wastewater and groundwater.
Fe-doped nanotubes are obtained in two ways: by direct synthesis, where FeCl3 is added to an aqueous mixture of the Si and Al precursors, and by post-synthesis loading, where preformed nanotubes are put in contact with a FeCl3&#8226;6H2O aqueous solution. In both synthesis methods, isomorphic substitution of Al3+ by Fe3+ occurs, preserving the nanotube structure. Isomorphic substitution is indeed limited to a mass fraction of ~1.0% Fe, since at a higher Fe content (i.e., a mass fraction of 1.4% Fe), Fe2O3 clusters form, especially when the loading procedure is adopted. The physicochemical properties of the materials are studied by means of X-ray powder diffraction (XRD), N2 sorption isotherms at -196 &#176;C, high resolution transmission electron microscopy (HRTEM), diffuse reflectance (DR) UV-Vis spectroscopy, and &#950;-potential measurements. The most relevant result is the possibility to replace Al3+ ions (located on the outer surface of the nanotubes) by post-synthesis loading on preformed imogolite without perturbing the delicate hydrolysis equilibria occurring during nanotube formation. During the loading procedure, an anionic exchange occurs, where Al3+ ions on the outer surface of the nanotubes are replaced by Fe3+ ions. In Fe-doped aluminosilicate nanotubes, isomorphic substitution of Al3+ by Fe3+ is found to affect the band gap of doped imogolite. Nonetheless, Fe3+ sites on the outer surface of nanotubes are able to coordinate organic moieties, like the azo-dye Acid Orange 7, through a ligand-displacement mechanism occurring in an aqueous solution.

Here, we present a protocol to synthesize and characterize Fe-doped aluminosilicate nanotubes. The materials are obtained by either sol-gel synthesis upon addition of FeCl3&#8226;6H2O to the mixture containing the Si and Al precursors or by post-synthesis ionic exchange of preformed aluminosilicate nanotubes.

Synthese und Charakterisierung von Fe-dotierten Aluminosilikatgerüststoffe Nanoröhrchen mit Enhanced Electron leitenden Eigenschaften

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Enzymatische Kaskade Reaktionen für die Synthese von chirale Alkohole Aminosäure L-Lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...