Wir danken Amayra Hernandez-Vega und Philippe Alexandre Pouille für die Teilnahme an die Grundlage für diese Protokolle einrichten. Wir danken auch der Molecular Imaging Plattform vom IBMB-PCB, Xavier Esteban und Mitglieder des Labors für kontinuierliche Unterstützung. Das konsolidierte Gruppen Programm der Generalitat de Catalunya und DGI und Consolider Zuschüsse aus dem Ministerium für Wirtschaft und die Wettbewerbsfähigkeit von Spanien, EMB und DN unterstützt diese Arbeit.

Alle Protokoll-Schritte, die unten beschriebenen Anweisungen Tierbetreuung unserer Institutionen.
(1) Zebrafisch-Kultur
<ol><li>Züchten Sie und pflegen Sie Erwachsene Zebrafisch unter Standardbedingungen. Hinweis: AB und TL Wildtyp-Embryonen wurden für diese Studie verwendet.</li>
	<li>Sammeln Sie Embryonen zu und wachsen sie in E3 Embryo mittlere24bei 28,5 ° C. Inszenieren sie nach Morphologie als zuvor beschriebenen19.</li>
</ol>(2) Rasterkraftmikroskopie
<ol><li>Manuell Dechorionate inszeniert Zebrafisch-Embryonen (aller Altersgruppen nach individuellen Interessen). Entfernen Sie Chorions mit zwei dünnen und scharfen Pinzetten (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Das Chorion mit einer Pinzette greifen und es mit anderen Zangen eine Träne machen. Dann hält das Chorion in einer Region entgegengesetzt zu der des Risses, den Embryo vorsichtig durch die Öffnung schieben.</li>
		<li>Führen Sie die Dechorionation unter einen sezierenden Stereomikroskop mit einem einstellbaren Bereich der Vergrößerung von 8 X bis 50 X.</li>
	</ol></li>
	<li>Montieren Sie die Embryonen für AFM
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 2 % Agarose im Embryo Medium und füllen Sie einer 35-mm-Petrischale damit. Lassen Sie es zu festigen. Machen Sie kleine Löcher von 1,5 mm Durchmesser (doppelt so groß wie Embryo) und ca. 350 µm Tiefe (Hälfte der Embryo Größe) mit dünnen Pinzette in die Agarose-Bett.</li>
		<li>Legen Sie die Embryonen in die Pokes gemacht in der Agarose-Schicht und versichern Sie, dass sie im Ort durch die Verbreitung rund um eine Lösung von 0,5 % niedrige Agarose im Embryo Medium schmelzen. Gießen Sie diese Lösung, um nur die Embryonen in den Löchern befestigen.</li>
		<li>Bevor die niedrigen Schmelzpunktes Agarose bei Raumtemperatur erstarrt, drehen Sie die Embryonen in einer Weise, dass die Region von Interesse von AFM sondiert werden nach oben (Abbildung 1A) konfrontiert sein wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Untersuchen Sie die Embryonen von AFM
	<ol>
<li>Suchen Sie und Bild die Embryos in der Petrischale mit einem 20 X Objektiv in einem Inverted Atomic Force Microscope (siehe Tabelle der Materialien25) bei Zimmertemperatur (23-24 ° C). Hinweis: Die Embryonen sind lebendig gehalten, inmitten der Embryo Medium und an die Agarose-Bett.</li>
		<li>Sondieren Sie die Eigelb Zellenoberfläche gegossen Embryonen mit sphärischen Polystyrol-Kügelchen von 4,5 µm im Durchmesser befestigt, ein Freischwinger mit einem nominalen Federkonstante von 0,01 N/m. Peak to Peak Amplitude der Freischwinger Schwingung auf 5 µm und seine Frequenz von 1 Hz eingestellt.</li>
		<li>Sammeln Sie Daten für jede Region in verschiedenen Positionen und in mehrere Embryonen als eine Routine für die Mittelung der Daten getestet werden. Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt ist fünf Positionen befindet sich in der Mitte und an den Ecken eines Quadrats µm 10 µm X 10 Steuerung Freischwinger mit XY Piezo-Aktuatoren der AFM Mikroskop zu untersuchen. Bildgebung und Datenerhebung dauerte rund 20 Minuten pro Embryo. Datenaufzeichnung in verschiedenen Regionen der Embryo Eigelb Zellenoberfläche, z.B.die Vegetal Pfosten oder verschiedene Regionen in der Nähe der EVL Zellen Rand (Abbildung 1 b und 1 C), geht nur durch den Einsatz von unterschiedlicher Proben unterschiedlich orientierte.</li>
	</ol></li>
	<li>Kräfte zu berechnen
	<ol>
<li>Messen Sie die vertikale Verschiebung der AFM Cantilever (Z) mit DMS-Sensoren mit Piezo-Aktuatoren und ihre Ablenkung (d) mit einem Quadranten Photodiode durch die optische Hebel-Methode mit dem Mikroskop-Steuerungs-Software gekoppelt (siehe Tabelle der Materialien ( 25).</li>
		<li>Verwenden Sie die Neigung einer gewonnenen Daten aus einer bloßen Region von einem Glas Deckgläschen d-Z-Kurve, um die Korrelation zwischen der Photodiode Signal und die Cantilever-Auslenkung (d) zu kalibrieren. Hinweis: Die gemessene vertikale Verschiebung entspricht die Cantilever-Durchbiegung und die Steigung stellt die Ablenkung Empfindlichkeit der optischen Hebel26.</li>
		<li>Folgern Sie, dass die Freischwinger Federkonstante (k) von den thermischen Fluktuationen27wie oben beschrieben.</li>
		<li>Berechnen Sie die Einrückung der Probe (h) als: h = (Z - Z-c) -(d - daus)          (1) Hinweis: Hier Zc ist die Position der Kontaktstelle und daus ist der Offset der Fotodiode.</li>
		<li>Berechnen Sie die Kraft (F) auf der Cantilever als: F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie die Spannung des Kortex in Bezug auf eine Flüssigkeit-Ballon-Modell, bestehend aus einer Elastikschicht kortikalen Spannung Tc umschließt eine zähe Flüssigkeit. In diesem Modell für kleine Vertiefungen (im Vergleich zur Größe des Embryos), steigt Kraft proportional4,28 als: F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3) Hinweis: Hier Rb ist der Radius des Wulstes und e R ist der Radius des Embryos. Für Zebrafish Embryos wie der Radius des Embryos (400 µm) zwei Größenordnungen größer ist als die des Wulstes (2,25 µm), ist kann diese Gleichung als angenähert werden: F = 4π Tc h (4)<ol>
<li>Berechnen Sie die Spannung Kraft-Einrückung (F-h) Kurven in jeder Embryo Eigelb Zelle Region für fünf verschiedene Punktmessungen.</li>
		<li>Tc für jede F-h -Kurve durch nichtlineare kleinste-Quadrate passend zu berechnen. Für statistische Analysen, die kortikale Spannung Tc berechnet aus den verschiedenen F-h Kurven gemittelt werden muss.</li>
	</ol></li>
	<li>Die viskoelastischen Eigenschaften (Rheologie) des Kortex mittels niedrigen Amplitude messen (100 nm) Multifrequenz Schwingungen bei AFM bestehend aus sinusförmigen Wellen mit unterschiedlichen Frequenzen25.
	<ol>
<li>Eine effektive komplexen Modulus g*(ƒ) im Frequenzbereich von Kraft Einzug Kurven als zu berechnen: g * (f) = [F(f) / h(f)]- Ifb (5) hier i ist die imaginäre Einheit und F(f) und h(f) sind die Frequenzspektren (f) der Kraft und der Einzug. b ist die Korrektur für das zähflüssige ziehen auf der Cantilever entzogen die Schwingungen auf die Oberfläche aufgetragen.</li>
		<li>Separate g*(ƒ) in realen und imaginären Teile wie: g * (Ƒ) = g' (f) + Ig'' (f)          (6) Em > g'(f) ist der Elastizitätsmodul und ist ein Maß für die elastischen Energie gespeichert und wiederhergestellt pro Zyklus der Schwingung. g'' (f) ist der viskosen Modulus, die Konten für die Verlustleistung.</li>
		<li>Berechnen Sie die Tangente Verlust, sorgt für einen Index von fest-wie (< 1) oder Flüssigkeit-wie (> 1) Verhalten des Materials, wie: g'' (f) / g"(f)          (7) Hinweis: Mit dieser Art der Messung ist es möglich, Parameter zu extrahieren angibt wie Viskose und wie elastisch der sondierten Material ist. Obwohl b leicht von der Entfernung des Endes des Nadelträgers an die Oberfläche hängt, angesichts der sehr niedrige Werte von g´´ ausgestellt durch das Eigelb (siehe unten Abbildung 2D ), kleine Abweichungen in b haben einen vernachlässigbaren Einfluss in die Messungen29.</li>
	</ol></li>
</ol>(3) Particle Tracking Microrheology
<ol><li>
Führen Sie Partikel Mikroinjektion in die Eigelb-Zelle
	<ol>
<li>Fertigen Sie maßgeschneiderte Mikronadeln mit einem horizontalen Mikropipette Puller und Kapillare Borosilikatglas (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Bereiten Sie Mikronadeln, die einen Außendurchmesser von 1,00 mm, einen Innendurchmesser von 0,58 mm und einer Länge von 10 cm mit Puller-Einstellungen haben: Druck: 500; Hitze: 510; Ziehen: 65; Geschwindigkeit: 25; Zeit: 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vorbereiten einer Injektion Petrischale Platte durch die Schaffung von geraden Einzug Bahnen in einem 1 % Agarose im Embryo mittlere Bett mit benutzerdefinierten gemacht Formen (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Drehen Sie die Formen um und legen Sie sie auf das flüssige Agarosegel und entfernen Sie den Schimmel zu, sobald das Gel verfestigt hat. Pipette die Embryonen in die Nuten von der Form in der Agarose unter einen sezierenden Stereomikroskop bei 1,2 X Vergrößerung gemacht. Hinweis: Die Breite und das Design der Werkzeuge ermöglichen die Embryonen selbst ausrichten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vor der Injektion fast vollständig entfernen Sie das Medium, um die Injektion zu erleichtern (die Oberflächenspannung verhindert, dass der Embryo/Chorion festhalten an der Nadel, wenn es nach der Injektion zu entfernen).</li>
		<li>Microinject fluoreszierende Nanopartikel (Radius einer = 100 nm, siehe Tabelle der Materialien) verdünnt in Wasser (1:1 000) im pflanzlichen Teil der Embryo Eigelb Zelle (Abb. 3A).</li>
		<li>Passen Sie die Mikropipette mit Präzision Mikromanipulatoren und injizieren Sie die Perlen mit einer automatischen Microinjector mit Zeit und Druck-Regler (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie den Druck zwischen 10 und 20 Psi.</li>
		<li>Vor der Injektion der Wulst Lösung, kalibrieren Sie das Volumen zu injizieren (0,5 nL) durch Messung der Tröpfchengröße geliefert durch die Microinjector mit einem 1 x 0,01 mm Bühne Mikrometer (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Beschäftigen Sie eine Vergrößerung von 1,6 X in den sezierenden Stereomikroskop, die Embryonen während der Injektionen zu visualisieren, die bei Raumtemperatur durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Das viskoelastische Verhalten das Eigelb durch thermische Fluktuationen Aufzeichnung zu bewerten
	<ol>
<li>Dechorionate die microinjected Embryonen wie in Schritt 2.1 und eingebettet in eine 0,5 % niedrige Schmelz-Punkt Agarose im Embryo mittlere Lösung bei 30 ° C. Anschließend übertragen Sie sie auf Glasplatten unten (siehe Tabelle der Materialien) und orientieren Sie und schieben Sie sie auf das Deckglas, wenn die Agarose noch flüssig ist. Hinweis: Wenn die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt, können die Embryonen abgebildet werden.</li>
		<li>Legen Sie die Embryonen in die unteren Glasplatten auf der Bühne von einem konfokalen umgekehrtes Mikroskop 2 h nach Mikroinjektion montiert. Die Aufnahmen der Nanopartikel für 26 s bei einer Sampling-Rate von 25 Hz mit einer 63 X Objektiv bei Raumtemperatur in einer invertierten confocal Mikroskop beschäftigt die standard kommerzielle Mikroskop-Software (Pixelgröße = 166 nm, Bilder, die alle 40 ms).</li>
		<li>Berechnen Sie die Position der Partikel Zentroiden zu und definieren Sie ihre Flugbahnen im Laufe der Zeit mit dem TrackMate-Plugin von open Source Software ImageJ (Abb. 3 b).</li>
		<li>Berechnen Sie die zweidimensionale mittlere quadratische Verschiebung (MSD) jedes Partikels mit maßgeschneiderten Software6,30 als: < ΔR2 (τ) > = < [X(t + τ) - X(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8) Hinweis: Hier ist t die verstrichene Zeit und die zeitliche Verzögerung. In einer reinen viskose Flüssigkeit steigt die MSD umgekehrt mit Viskosität (ν) nach der Stokes-Einstein-Beziehung: < ΔR2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9) wobei T die Absolute Temperatur ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. 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Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte oder andere Interessenkonflikte.

Hier zeigen wir, dass die Materialeigenschaften und einige biomechanischen Parameter der Zebrafisch Eigelb Zelle während der Epiboly von AFM und Nanopartikel Microrheology leicht geschätzt werden können.
Während AFM, zum Abrufen von rheologischer Eigenschaften von Zellen und Geweben in physiologischen Bedingungen4,5,25,28 beschäftigt war, haben hier wir ein Prot...

Die physikalischen Grundsätze der biomechanischen Kontrolle der morphogenetischen Prozesse sind weitgehend undefiniert. Während biomechanische Untersuchungen auf molekularer und zellulärer Ebene erhebliche an Schwung, ist die Erforschung der biomechanischen Parameter der Ebene der Gewebe/Organismus in seiner Kindheit. Hydrodynamische Regression1 oder Video-Kraft-Mikroskopie2 Forscher, aktive und passive Kräfte, während der Laser Mikrochirurgie3oder weniger aufdringlich Rasterkraftmikroskopie (AFM) dissoziierten Zellen4 unterscheiden können oder in vivo 5 oder Nanopartikel Microrheology6 erlauben die Vorfreude der mechanischen Eigenschaften und Reaktionen des Gewebes.
AFM ist eine dreidimensionale topographische Technik mit hoher atomarer Auflösung Oberflächenrauhigkeit und Compliance aus der Durchbiegung der Freischwinger Tipps beim Kontakt mit einem sondierten Oberfläche7zu lösen. Verschiedene Methoden mit AFM wurden entwickelt, um Oberflächeneigenschaften, einschließlich der Messung von Reibung, Adhäsionskräfte und viskoelastischen Eigenschaften verschiedener Materialien zu untersuchen. AFM hat vor kurzem ein mächtiges Werkzeug zum Abrufen von Informationen auf die mechanischen Eigenschaften von biologischen Proben entwickelt. AFM kann insbesondere nicht-invasiv der komplexe Schubmodul aus einzelnen Zellen extrahieren, durch die Anwendung von oszillierender Vertiefungen mit einem Mikro Spitze an einem Freischwinger von bekannten Biegung konstant8befestigt. Dadurch können wir die daraus resultierenden Kräfte abzuleiten. Doch AFM ist nicht eindeutig und verschiedene Methoden erlauben extrahieren Daten rheologischen und mechanischen Eigenschaften von einzelnen Zellen (z. B. Mikropipette streben9, magnetische Zytometrie (MTC)10verdrehen oder einachsigen Zug- 11Tests).
Die Anwendung dieser neuartigen Methoden komplexe morphogenetischen Prozesse ist jedoch nicht einfach. Die größten Herausforderungen bei der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften des embryonalen Gewebe sind die kleinen (µm bis mm), weich (in den 102 - 104 -Pa-Bereich) und Visco-elastische (entstehen auf zeitabhängige Phänomene) Natur der materiellen12. Es ist daher wichtig, die Methoden zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften (Steifigkeit, Viskosität, Adhäsion) auf den konkreten Fall von Embryonen und entwickelnden Organismen anzupassen. Zwei wichtige Punkte müssen berücksichtigt werden bei der Analyse der rheologische Ansätze zur Entwicklung zu studieren: aufdringlich Störungen zu vermeiden und gute Erreichbarkeit. In diesem Szenario zeigen Mikropipette Aspiration, MTC und Zugprüfung Einschränkungen. Im ersten Fall könnte die hohe Verformung, die eine Zelle leidet seine physiologischen und mechanischen Eigenschaften9ändern. Im zweiten Fall könnte die Notwendigkeit, sich fest das experimentelle Gewebe auf ein Substrat um sicherzustellen, dass die Spannungen angewendet das Zellskelett lokal verformen auch Auswirkungen auf die Zellen der Aktivierungsstatus und daher in ihrer mechanischen Eigenschaften10 bringen. . Letzte, einachsigen Zug-Ansätze werden durch die Geometrie der Entwicklung von Organismen und Zugänglichkeit11begrenzt.
AFM scheint für das Studium der Entwicklungsprozesse besser geeignet sein, wie es die Untersuchung von biologischen Proben direkt in ihrer natürlichen Umgebung ohne umständliche Probenvorbereitung ermöglicht. Darüber hinaus wie Dissoziation des embryonalen Gewebe in der Regel schwierig ist, bietet die geringere Größe der AFM Sonden ein hohes Maß an Vielseitigkeit ohne Einschränkung bei der Wahl der Art des Mediums (wässrige oder nichtwässrigen), Probentemperatur oder chemische Zusammensetzung der Probe. AFM ist vielseitig genug, um auf große Domänen angewendet werden und Zeitskalen und zum Abrufen von Eigenschaften von Gewebe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder physiologischen Bedingungen beschäftigt. Gesamten nativen Gewebe wie Arterien13 oder Knochen14 untersucht worden sind, aus Sicht der topographischen und in einigen Fällen, wie der Sklera, mechanische Eigenschaften wurden auch abgerufen am15. Topographie ist auch in live ermöglicht die Visualisierung von zum Beispiel Zelle Umlagerung während Morphogenese Xenopus16Embryonen untersucht worden. Letzten, umfassenden Stichprobe Vorbereitung Protokolle wurden entwickelt, um mechanische Parameter zu bestimmen, während verschiedene Entwicklungsprozesse. Nanoindentation Karten wurden auf native fixierten Gewebeschnitten für die Küken embryonalen Verdauungstrakt11generiert; Kleber und mechanische Eigenschaften für einzelne Ektoderm, Mesoderm und Entoderm Progenitor-Zellen isoliert von gastrulating Zebrafish Embryos4abgerufen; Steifigkeit Messungen für die Epiblast und primitive Streak auf Explantaten von Vogelgrippe Embryonen17; und ein eindeutiges Muster von Steifigkeit Gradienten direkt im embryonalen Gehirn von Xenopus5definiert.
Annäherung an einfach zugänglichen morphogenetischen Prozesse kann ein erheblicher Qualitätssprung für die Anwendung von AFM für die Erkundung der Embryonalentwicklung entstehen. Zebrafisch-Epiboly ist ein wesentlicher und konservierte Ereignis, in dem verschiedene Geweben auf engstem Raum kugelförmig um den Ausbau der Blastoderm in wenigen Stunden direkte koordinieren. Zu Beginn der Zebrafisch Epiboly (sphärische Bühne) deckt eine oberflächliche Schicht von Zellen, die umhüllende Schicht (EVL), eine halbkugelförmige Kappe von Blastomeren auf die Tier-Pole des Embryos sitzt auf einer massiven Eigelb syncytial Zelle zentriert. Epiboly besteht aus den kortikalen pflanzlichen Ward Ausbau der EVL die tiefen Zellen (DCs) das Blastoderm und die äußere Schicht der syncytial Eigelb Zelle (E-YSL) um den Dotter. Epiboly endet mit der Schließung der EVL und die DCs Vegetal Pfosten18,19,20. Wie und wo Kräfte während Epiboly generiert werden und wie sie weltweit gekoppelt sind, ist nicht noch klar,1,21.
Hier beschreiben wir im Detail wie AFM zu folgern, dass passive mechanische Gewebeeigenschaften während Epiboly Progression im Zebrafisch Eigelb in VivoZelle angewendet. Dazu haben wir kleine Mikrosphären mit AFM Kragarmen als Sonden verbunden beschäftigt. Dies ermöglicht den Abruf von präzise lokale Informationen innerhalb der Zelloberfläche ungleichmäßige Eigelb und Zug Steigungen und ihre Dynamik im Laufe der Zeit zu studieren. Alternative AFM nähert sich z. B. die Verwendung von Keil Kragarme22, wird nicht Lokaldaten Render, die präzise genug ist. Die Keil-Technik, die sehr sorgfältige Handhabung Fähigkeiten, um einen Keil größer als die Größe der Stichprobe am Ende des Nadelträgers kleben erfordert, eignet sich nicht zum sondieren Embryo (~ 2-fach größer als die Länge des Nadelträgers) Mechanik.
Modellierung und Charakterisierung der viskoelastischen Eigenschaften der Zellen in qualitativer und quantitativer Hinsicht ermöglicht ein besseres Verständnis für die Biomechanik. Aus biomechanischer Sicht ist es wichtig zu verstehen, Epiboly und nicht nur Nachfrage wissen über Messungen der kortikalen Spannung und Dynamik, die durch AFM extrahiert werden können; so gibt es Bedarf an Informationen über die biophysikalischen Eigenschaften des Gewebes. Um diese Informationen zu extrahieren, eine Vielzahl von Zelle Rheologie Techniken wurden entwickelt, in den Jahren um verschiedene Zelltypen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen23charakterisieren. Dazu gehören AFM, MTC und optische Pinzette (OT). Diese Methoden sind jedoch unzureichend für mesoskopische Analysen auf der Ebene der Embryonen oder Organen nachgewiesen worden. Als Alternative haben wir erfolgreich Nanopartikel-Tracking Microrheology6 für in Vivo rheologischen Messungen angepasst. Diese Technik analysiert die Brownschen Verschiebungen einzelner Partikel und schließt lokale mikromechanische Eigenschaften.
Zusammen AFM und Nanopartikel Microrheology erlauben die Definition der kortikalen Zug Dynamik und internen mechanischen Eigenschaften von Eigelb während Epiboly. Diese Informationen unterstützt voll und ganz eine Modell in dem anisotropen Stress entwickelt sich als Folge der Unterschiede in der Verformung Antwort von der EVL und die Eigelb zytoplasmatischen Schicht (YCL) zu den isotropen Actomyosin Kontraktion des E-YSL Kortex ist wichtig für net Richtungsbewegung der EVL und Epiboly Progression1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope (AFM)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>-</td>
			<td>Any commercialized AFM could be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8016.00</td>
			<td>Casting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>Securing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Z-MOLDS</td>
			<td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si3N4 cantilever</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &#181;m diameter and k=0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>FluoSpheres F8811,</td>
			<td>For tracking nanorheology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillary glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100TF-4</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td>Manipulating the micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet Express</td>
			<td>Controlling injection time and pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Analyzing AFM and particle tracking data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>AB and TL wild type</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>FST</td>
			<td>29025-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Aufklärung der Faktoren, die die räumlich-zeitliche Organisation der sich entwickelnden Gewebe direkt ist einer der Hauptgründe für die Verwendung in der Studie der Entwicklung. Verschiedene Thesen behaupten, wichtige Beiträge zum Verständnis der mechanischen Eigenschaften von Zellen und Geweben in ihrer raumzeitlichen Organisation in verschiedenen Entwicklungs- und morphogenetischen Prozessen gewesen zu sein. Jedoch wegen des Mangels an zuverlässige und zugängliche Tools zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo, war Überprüfung dieser Hypothesen schwierig. Hier stellen wir Ihnen Methoden beschäftigt Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Teilchen verfolgen mit dem Ziel, die mechanischen Eigenschaften der intakten Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Epiboly ist eine frühe konservierten Entwicklungsprozess, dessen Studie durch die Transparenz des Embryos erleichtert wird. Diese Methoden sind einfach zu implementieren, zuverlässig und vielseitig einsetzbar, da sie aufdringliche Interventionen überwinden, die Gewebe Mechanik beeinflussen könnten. Eine einfache Strategie wurde für die Montage von Proben, AFM-Aufnahme und Nanopartikel-Injektionen und Nachverfolgung angewendet. Dieser Ansatz macht diese Methoden leicht anpassbar an andere Entwicklungsstörungen Zeiten oder Organismen.

Kortikale Spannung Messungen Für jeden Messpunkt wurden fünf Kraft-Weg (F-Z)-Kurven von AFM erworben, durch Rampen der Cantilever bei 1 Hz mit einer Spitze-Spitze-Amplitude von 5 µm (Geschwindigkeit = 10 µm/s) bis zu einer maximalen Einbuchtung von ~ 2 µm. Dieses Verfahren dauerte weniger als 20 min und war nicht betroffen von Epiboly fortschreiten. Jede experimentelle Bedingung wurde in mindestens 5 Embryonen getestet.
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AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Aufrufe.  Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.

Serie: AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient utilization by avian embryos during development. Fertilized Japanese quail eggs were incubated at 37 &#176;C for 5 days and then yolk sac membranes (YSM) were collected to establish the EEC culture system. We isolated the embryonic endoderm layer from YSM, and sliced the membrane into 2 - 3 mm pieces and partially digested with collagenase before seeding in 24-well culture plates. The EECs proliferate out of the tissue and are ready for cell culture studies. We found that the EECs had typical characteristics of YSM in vivo, for example, accumulation of lipid droplets, expression of sterol O-acyltransferase and lipoprotein lipase. The partial digestion treatment significantly increased the successful rate of EEC culture. Utilizing the EECs, we demonstrated that the expression of SOAT1 was regulated by the cAMP dependent protein kinase A related pathway. This primary Japanese quail EEC culture system is a useful tool to study embryonic lipid transportation and to clarify the role of genes involved in mediating nutrient utilization in YSM during avian embryonic development.

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Primäre Endodermal Epithelial Cell Culture aus dem Dottersack-Membran der japanischen Wachtel Embry

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Wirksamkeit der Luft Stripping in zwei Lachsfische Fisch Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss) und Bachforelle (Salmo Trutta Morpha Fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...