Das konfokale Mikroskop wurde mit Mitteln von US National Science Foundation (NSF), Grant #DBI-0722569 gekauft. Die Forschung wurde durch die US nationale Institute der Gesundheit/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) Grant #GM085290 und US-Department of Defense (DOD) Grant #W81XWH-16-1-0466 verliehen an r.m. Brewster unterstützt. E. Vital wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu UMBC vom Howard Hughes Medical Institute durch die Pre-College und Undergraduate Science Education Program, #52008090 zu gewähren. S.p. Brown wurde unterstützt durch eine US of Education GAANN Fellowship, ein Meyerhoff Graduate Fellowship von NIH/NIGMS Grant #GM055036 und eine Forschung Assistentenstelle finanziert durch die US DOD Grant #W81XWH-16-1-0466 finanziert.

<ol>
	<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).</li><li>Conde, C., C&#225;ceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Kaverina, I., Straube, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+migration+by+dynamic+microtubules.">Regulation of cell migration by dynamic microtubules.</a> Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).</li><li>Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+nucleation+by+&#947;-tubulin+complexes.">Microtubule nucleation by &#947;-tubulin complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).</li><li>Howard, J., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+fluctuation+and+switching+at+microtubule+plus+ends.">Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).</li><li>Schulze, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+stable+populations+of+microtubules+in+cells.">Dynamic and stable populations of microtubules in cells.</a> J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).</li><li>Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+microtubules:+Tyrosinated+and+nontyrosinated+alpha+tubulin+are+distributed+differently+in+vivo.">Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo.</a> Cell. 38 (3), 779-789 (1984).</li><li>Li, R., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+polymer+polarity:+how+the+cytoskeleton+builds+a+polarized+cell.">Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).</li><li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+for+monitoring+in+vivo+microtubule+structures.">A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).</li><li>W&#252;hr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos.">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).</li><li>Tran, L. D., Hino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+at+the+vegetal+cortex+predict+the+embryonic+axis+in+zebrafish.">Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish.</a> Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).</li><li>Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+chemical+modulation+of+spastin-dependent+axon+outgrowth+in+zebrafish+embryos+indicates+a+role+for+impaired+microtubule+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegia.">Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia.</a> Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).</li><li>Yoo, S. K., Lam, P. -. Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).</li><li>Andersen, E. F., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+movements+in+vivo+correlate+with+specific+neurite+formation+downstream+of+LIM+homeodomain+transcription+factor+activity.">Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity.</a> Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).</li><li>Lee, S. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+microtubule+and+actin+cytoskeleton+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly.</a> Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).</li><li>Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+and+post-translational+modification+of+microtubules+during+cellular+morphogenesis.">Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis.</a> BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).</li><li>Magiera, M. M., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16+-+Investigating+Tubulin+Posttranslational+Modifications+with+Specific+Antibodies.">Chapter 16 - Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies.</a> Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).</li><li>Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polarity+protein+Pard3+is+required+for+centrosome+positioning+during+neurulation.">The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation.</a> Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).</li><li>Westermann, S., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+regulate+microtubule+function.">Post-translational modifications regulate microtubule function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).</li><li>Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+protein+1b+is+required+for+shaping+the+neural+tube.">Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube.</a> Neural Develop. 11, 1 (2016).</li><li>Nam, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tau,+a+microtubule+associated+protein,+in+Drosophila+photoreceptor+morphogenesis.">Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis.</a> Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).</li><li>Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -. B., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+release+from+the+centrosome+in+migrating+cells.">Microtubule release from the centrosome in migrating cells.</a> J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).</li><li>Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+nucleation+and+anchoring+at+the+centrosome+are+independent+processes+linked+by+ninein+function.">Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function.</a> J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).</li><li>Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+function+for+the+centrosomal+protein+NEDD1+in+zebrafish+development.">An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development.</a> Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Lateral+Mounting+of+Zebrafish+Embryos:+Analysis+of+Spinal+Cord+Development.">Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development.</a> JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).</li><li>F&#214;ldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+scanning+confocal+fluorescence+microscopy:+an+overview.">Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview.</a> Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2010)</li><li>. Z-functions - ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Z-functions">https://imagej.net/Z-functions</a> (2017)</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Derzeit gibt es viele Methoden für imaging-MT-Dynamik in der frühen Entwicklung der Zebrafisch, von live Imaging tagged Moleküle bis hin zu Immunolabeling der Gewebe11,12,13,14behoben. MTs in einer einzelnen Zelle in dynamischen oder stabile Staaten existieren können, zwar Epithelisierung ein Prozess in dem MTs schrittweise im Laufe der Zeit stabilisiert werden. Mit Hilfe von Markern für stabile und dynamische MTs bietet eine Möglichkeit, dieses Phänomen zu visualisieren. Die hier vorgestellte Methode nutzt die Macht der 3-d imaging-Software, den Übergang von dynamischen, stabile MT-Populationen in einem Querschnitt von Zebrafish embryonale Gewebe zu quantifizieren. Im Protokoll Nr. 2wird die Methode verwendet eine verschiedene Bevölkerung der im Entstehen begriffenen MTs beschriften und die Keimbildung und das Wachstum Überstunden zu folgen.
MTs sind notorisch schwierig zu Bild in ihrem nativen Zustand aufgrund ihrer Neigung zur depolymerisieren. Somit ist die Schlüsselkomponente dieser Methode schnelle Fixierung der MTs in der gesamten Embryo. Dies geschieht durch die Fixierung bei physiologischen Temperaturen starten und verwenden einen Puffer, der sowohl die MTs stabilisiert und die Durchlässigkeit des Embryos erhöht. Die Fixierzeit ist auch wichtig, da die verkürzten Fixierung zu verhaften MTs Fehler auftritt, während übermäßige Fixierung Epitope, Antikörperbindung stören überdecken kann. Die vorgeschlagenen Fixierzeit von 3-4 h arbeitet mit Embryonen, die in der Mitte des Gastrulation bis zu 24 h nach Befruchtung sind. Embryonen gegen jüngere Ende der Zeitskala für näher zu 3 h festzusetzen während ältere Embryonen die gesamte 4 h brauchen können. Sogar mit richtigen Fixierung werden die MTs mit der Zeit depolymerisieren, so schneiden und Immunolabeling innerhalb einer Woche der Festsetzung auftreten müssen.
Sobald das Gewebe richtig fixiert ist, können Probleme mit Immunolabeling auftreten. Das häufigste Problem gestoßen wurde armen Durchdringung durch das Zentrum des Gewebes, vor allem, wenn zu viele Abschnitte in den gleichen Brunnen ausgebrütet werden. Erhöhung der Konzentration von den primären Antikörper und Inkubation Zeit für primäre und sekundäre Antikörper, zusammen mit den steigenden Reinigungsmittel um Permeabilisierung der Embryonen zu verbessern, werden die meisten Immunolabeling Probleme lindern. Wenn die Antikörper-Kennzeichnung durch Fixierung Probleme oder Immunolabeling fehlschlägt, ist es möglich, die Ursache zu ermitteln, durch die Untersuchung des Antikörpers labeling Muster. Schlechte Fixierung führt zu intensiven Kennzeichnung in der Membran und Kennzeichnung im Zytoplasma diffundieren, während übermäßige Fixierung führt schwach bezeichnen, die MT Architektur behält. Schlechte Penetration des Antikörpers, erscheint jedoch als Bereiche in der Mitte des Gewebes ohne Kennzeichnung.
MT Bildern in einer sinnvollen Weise zu analysieren ist abhängig von hoher Bildqualität. MT Länge in 3-d zu erfassen, sollte die Z-Schritt-Mindestgröße für das Ziel und die numerische Apertur möglich verwendet werden. Hier gezeigten Bilder wurden mit einem 63 X Öl auftauchen Ziel mit 1,4 numerischer Apertur produzieren die folgenden erfasst: Pixel = 240 nm, Z-Schritt = 0,1 µm, Z-Stack-Größe = 16.252 µm. Denn die Breite der einzelnen MT 25 nm, etwa 10 mal unten die Grenze der Auflösung für ein Lichtmikroskop, diesem metrischen lässt sich nicht genau gemessen mit dieser Technik. Stattdessen können nur MT Längen gleich oder größer als die minimale Pixelgröße erreichbar in allen drei Dimensionen gemessen werden. Linie und/oder Rahmen im Durchschnitt kann die MT-Signal-Definition verbessern. MT-Analyse sollte für hochwertige Abschnitte reserviert werden. Während Gewebe mit schlechter Fixierung abgebildet und analysiert werden kann, milde Overfixation können ausgeglichen werden, indem man sorgfältig die Laserintensität und um das schwache Signal zu erkennen und gleichzeitig eine gute Dynamik gewinnen. Schlechte Antikörper eindringen, kann zwar nicht optimal, durch Begrenzung der Bildaufnahme auf gut gekennzeichneten Regionen, was zu imaging einen dünneren Abschnitt (ca. 5-10 µm) korrigiert werden. Hoher Hintergrund von der Etikettierung kann kompensiert werden, indem Sie die Filtereinstellungen anpassen. Wenn irgendwelche dieser Anpassungen vorgenommen werden, ist es jedoch notwendig, um sicherzustellen, dass die Filter-Schwelle akzeptabel auf jeder Ebene des Z-Stack.
3-d-Bildanalyse-Software ermöglicht den Experimentator, MT Länge, Fläche, Winkel, Fülle und andere Metriken im 3D-Raum fixierte Gewebe Abschnitte zu quantifizieren. Die hier beschriebene Methode bietet Richtungen für solche Daten mit im Handel erhältlichen Software zu erhalten. Jedoch können die Filterung Module Public Domain-Software erweitert mit entsprechenden Plugins/Makros, Analyse für alle zugänglich zu machen oder angepasst. Raw-Bilder muss vor der Analyse thresholded zu vermeiden, einschließlich Hintergrund und unspezifische Signale in der Quantifizierung. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, und Daten werden in eine praktikable Kalkulationstabelle übertragen, können viele Rückschlüsse aus dem Datensatz erfolgen. Die hier vorgenommenen Berechnungen gehörte Glu-Tubulin Streifen pro β-Tubulin Streifen oder das Verhältnis der stabilen MTs zu total MTs wo ' 1 ' steht, dass die gesamte MT Zytoskeletts in einen ROI stabilisiert wurde. Wenn der Experimentator möchte ihre quantitative Daten ergänzen erzeugen eine polierte tagged Image-Dateiformat (TIFF) ist Bild mit Maßstabsleisten mühelos mit 3-d-Bildanalyse-Software.
Dieser Test erlaubt die funktionelle Analyse von Proteinen in MT Versammlung, in Vivoverwickelt. Wenn Immunolabeling auf Schnittserien abwechselnd durchgeführt wird, könnte dieses Protokoll verwendet werden, um dynamische und stabile MTs in der gleichen Embryo zu studieren. In der Zukunft ermöglichen Modifikationen wie erhöhte Reinigungsmittel oder veränderte einbetten Winkel den Einsatz dieser Methoden für ältere Embryonen und ein breiteres Spektrum von anatomischen Fragen.

Mikrotubuli (MTs) sind Polymere von α und β-Tubulin, die in linearen Protofilaments zusammenbauen, von denen mehrere kombinieren, um eine hohle Röhre1,2bilden. MTs sind polarisierte Strukturen, mit schnell wachsenden plus enden und minus enden, die an die Centrosome oder andere Mikrotubuli-organizing Center (MTOC)3verankert sind langsamwüchsig. De novo MT-Bildung wird durch Keimbildung bei der γ-Tubulin-Ring-Komplex (γ-TURC), bietet eine Vorlage für MT Montage4eingeleitet. In einer bestimmten Zelle können zwei Populationen von MTs, die wiederum über unterschiedlich unterschieden werden. Dynamische MTs erforschen ihre zelluläre Umgebung durch den Wechsel zwischen Phasen von Wachstum und Schrumpfung in einem Prozeß bekannt als dynamische Instabilität5. Im Gegensatz zu dynamischen MTs stabile MTs nicht wachsen und haben eine längere Halbwertszeit als dynamische MTs6.

Jahrzehntelanger Forschung in Zellbiologie hat eine anspruchsvolle Reihe von Tools zur Untersuchung MT Struktur und Funktion zur Verfügung gestellt und führte zu einen großen Körper des Wissens über diese Zellskelett Elemente. Zum Beispiel MTs spielen eine zentrale Rolle bei der Einrichtung und Wartung der Zellpolarität, die nicht nur auf ihre innere Polarität, sondern auch für die differenzielle subzelluläre Verteilung der Stall im Vergleich zu dynamischen MTs7, ist 8. dagegen weit weniger versteht sich über MT Architektur und Funktion in komplexere dreidimensionale (3D) Umgebungen, z. B. vertebrate Embryos, teilweise wegen der Herausforderung von imaging-MT Zytoskeletts mit hoher Auflösung. Trotz dieser Einschränkung die jüngsten Generation der GFP exprimierenden transgene Linien dieses Label MTs oder transiente Expression fluoreszent markiert MT Marker erhöht hat unser Verständnis von der dynamischen Veränderungen, die MTs zu unterziehen und ihre zellulären und Rolle des Zebrafish Embryos. Das Gesamtnetz der MT kann abgebildet in transgenen Linien in die Tubulin ist entweder direkt beschriftet9 oder Tubulin Polymere mit MT-assoziierte Proteine indirekt gekennzeichnet sind Doublecortin-Like-Kinase (Dclk) oder Ensconsin (EMTB)10, 11. Andere Linien (und Konstrukte) erzeugt wurden, die Bewertung der MT innere Polarität durch gezielt beschriften MT plus enden aktivieren oder Centrosome verankert minus enden11,12,13, 14. die Macht dieser Werkzeuge liegt in der Fähigkeit, MT Dynamik im Leben, zu studieren Organismen zu entwickeln. Solche Studien haben gezeigt, zum Beispiel die räumliche und dynamische Verteilung der MTs in bestimmten Zellpopulationen, die Ausrichtung der mitotischen Spindeln im Gewebe Morphogenese (ein Indikator für die Ebene der Zellteilung), durchläuft die Polarität des MT-Polymers Bezug auf Prozesse wie Zelle Dehnung und Migration, und MT Wachstumsrate von Komet Geschwindigkeit9,13,15bestimmt. Die Begrenzung dieser Werkzeuge ist, dass sie nicht ohne weiteres zwischen stabiler und dynamischer MT Bevölkerungsgruppen diskriminieren.

Zeichnung aus der reichen Zelle Biologie Literatur, werden Immunolabeling Methoden, um stabile und dynamische MTs des Zebrafish Embryos Bild hier beschrieben, sind die Verwendung von transgenen Linien ergänzen. Der weit verbreiteten Einsatz solcher Immunolabeling Methoden in der Zebrabärbling wurde durch die Schwierigkeit MT Integrität zu bewahren, während des Verfahrens Fixierung etwas behindert. Protokoll Nr. 1 beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling insgesamt, dynamisch, und stabile MTs in Querschnitte der entwickelnden Zebrafisches Hinterhirn. Darüber hinaus ist eine einfache Methode, die Verwendung von kommerziell verfügbaren Software beschrieben, um diese MT-Populationen zu quantifizieren. Stabile MTs unterscheiden sich von dynamischen MTs basierend auf mehrere post-translationalen Modifikationen von α-Tubulin, wie Acetylierung und Detyrosination, die auf stabile MTs über Zeit16,17ansammeln. Im Zebrafish Embryos tritt Acetylierung auf ciliary und axonalen MTs aber nicht auf stabile Interphase MTs18, die Nützlichkeit dieses Markers auf eine Teilmenge der stabilisierten MTs zu begrenzen. Im Gegensatz dazu scheint Detyrosination auf allen stabilen MTs im Zebrafish Embryos18auftreten. Diese Post-translationale Modifikation stellt die Carboxy-Terminal Glutaminsäure α-Tubulin (Detyrosinated Tubulin)18 und mit Anti-Glu-Tubulin19detektiert werden. Obwohl Detyrosination bevorzugt auf stabile MTs auftritt, zeigt experimentelle Beweise, dass dieser Post-translationale Modifikation zurückzuführen, sondern als eine Ursache für MT Stabilität16. Die gegenseitige MT Bevölkerung, bestehend aus dynamischen MTs zeichnet sich mit einem Antikörper, anti-Tyr-Tubulin, erkennt, dass speziell die Tyrosinated Form von α-Tubulin19. Nach Immunolabeling mit diesen Markern und konfokale Bildgebung kann die Quantitative Analyse von MTs (Länge, Anzahl und relative Häufigkeit) in definierten Regionen des entwickelnden Neuralrohrs durchgeführt werden. Eine optimierte Methode ist hier für die Durchführung dieser Analyse mit 3-d-Bildverarbeitung Software zur Verfügung gestellt. Diese Methode kann auf Fragen bezüglich Morphogenese und der Einrichtung oder Reifung der Zelle Polarität20angewendet werden. In der Tat, die Ausarbeitung von polarisierten Arrays von stabilen MTs begleitet viele entwicklungspolitische Veranstaltungen, darunter Photorezeptor Morphogenese21, Epithelisierung von Zellen in den Entwicklungsländern Neuralrohr18 und Axon Bildung8.

Protokoll Nr. 2 beschreibt eine in-Vivo -Adaption eines Zelle Biologie Assays MTs Analyse während ihrer Versammlung Phase (Keimbildung/Anchorage und Wachstum)22,23. Im Entstehen begriffenen MTs sind kernhaltige an die Centrosome und anschließend an subdistal Anhängsel der Mutter Zentriol23verankert. Eine Methode, um entstehende MT nachwachsen nach Depolymerisation analysieren wird beschrieben. Dieses Protokoll enthält Informationen über die Nocodazole Behandlung, MTs, das Medikament Auswaschung Verfahren und der Nachbehandlung Erholungsphase depolymerisieren. MT nachwachsen wird in regelmäßigen Abständen überwacht.s Post Auswaschung von Immunolabeling mit Markierungen für insgesamt MTs (anti-β-Tubulin) neben Marker für die Centrosome (anti-γ-Tubulin) und Kern (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)), nach den allgemeinen Verfahren, die im Protokoll Nr. 1beschrieben. Der MT Depolymerisation Schritt dieses Protokolls ist wichtig, da es ermöglicht die Beurteilung der de Novo MT Wachstum als Erweiterung der bereits vorhandenen MTs. Diese Technik unterscheidet sich somit von anderen veröffentlichten Verfahren, MT Wachstumsraten (in Abwesenheit der Depolymerisation) zu messen, durch die Verwendung einer plus Spitze Markers wie Ende bindende Protein 3 verschmolzen zu grün fluoreszierendes Protein (EB3-GFP), wie im Tran Et Al.gezeigt, 2012-11. Darüber hinaus dieser Assay eignet sich besonders für die Analyse von Embryonen in de Novo MT Baugruppe defekt wie die zuvor gemeldeten NEDD1 Mutanten in der Rekrutierung von γ-Tubulin, das Centrosome beeinträchtigt ist, was zu unvollständig Bildung des Neuralrohrs und neuronale Defekte24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td style="width:177px;">IBI scientific</td>
			<td style="width:159px;">IB70050</td>
			<td style="width:373px;">Only used for embedding. 
			 
			Prepare 4% LMP agarose 
			by heating a solution of&#160; 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave 
			until polymerized. Keep warm on a 50 &#730;C hot plate with the cap secured</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">Used to treat petridishes.&#160;&#160; Prepare 1% agarose 
			by heating a solution of&#160; 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave 
			until polymerized.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">487928-10MG</td>
			<td style="width:373px;">Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots.&#160; Store at -20 &#730;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">8% Formaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:159px;">157-8-100</td>
			<td style="width:373px;">Aliquot and store at -20 &#730;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Kpipes</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P7643</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">NaCl</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">S7653</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">T3253-500G</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">KCl</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9333-500G</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C5080</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">NP-40</td>
			<td style="width:177px;">American Bioanalyticals</td>
			<td style="width:159px;">AB01424</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">EGTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">E3889-25G</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">MgCl2</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2670-500G</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">S26-100ml</td>
			<td style="width:373px;">Aliquot and store at -20 &#730;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">BP1605</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Triton-x</td>
			<td style="width:177px;">American Bioanalyticals</td>
			<td style="width:159px;">AB02025</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P5147-1G</td>
			<td style="width:373px;">make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 &#730;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Anti-Fade mounting medium</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:159px;">P10144</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DAPI</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:159px;">D1306</td>
			<td style="width:373px;">Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 &#181;l DAPI stock&#160; with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 &#730;C for months.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:207px;">Mouse anti-&#946;-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Developmental studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:159px;">E7</td>
			<td style="width:373px;">1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Rabbit anti-&#947;-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Genetex</td>
			<td style="width:159px;">GTX113286</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Rabbit anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Genetex</td>
			<td style="width:159px;">GTX108784</td>
			<td style="width:373px;">1/1000*</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Rabbit anti-detyrosinated-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">AB3201</td>
			<td style="width:373px;">1/200-1/1000*&#160; Titrate antibody with first use of new lot.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Rabbit anti-tyrosinated-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">ABT171</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Mouse anti-centrin</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">04-1624</td>
			<td style="width:373px;">1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Goat 488 anti-rabbit</td>
			<td style="width:177px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:159px;">A11008</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Goat 594 anti-rabbit</td>
			<td style="width:177px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:159px;">A11012</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Goat 594 anti-mouse</td>
			<td style="width:177px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:159px;">A11005</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Goat 488 anti-mouse</td>
			<td style="width:177px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:159px;">A11001</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Vibratome</td>
			<td style="width:177px;">Vibratome</td>
			<td style="width:159px;">1500</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Forceps</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">555227F</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:177px;">Cell treat</td>
			<td style="width:159px;">229693</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">35 mm petri dish</td>
			<td style="width:177px;">Cell treat</td>
			<td style="width:159px;">229638</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">50 ml falcon tube</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-432-22</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Woven nylon mesh 70 um</td>
			<td style="width:177px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:159px;">B0043D1SZG&#160;</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Micropipette</td>
			<td style="width:177px;">Gilson</td>
			<td style="width:159px;">F123602</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">NC-999363-9</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Aquarium sealant</td>
			<td style="width:177px;">Amazon.com, by MarineLand</td>
			<td style="width:159px;">Silicone Sealer 1 oz (Tube)&#160;</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Ring stand</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-675BO</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Microbore PTFE Tubing, 0.022&#34;ID</td>
			<td style="width:177px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:159px;">WU-06417-21</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Modeling clay</td>
			<td style="width:177px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:159px;">Sargent Art 22-4000</td>
			<td style="width:373px;">Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Clamp</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-215-466</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">60ml syringe</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-820-11</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Embryo medium (E3)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">34.8 g NaCl 
			1.6 g KCl 
			5.8 g CaCl2&#183;2H2O 
			9.78 g MgCl2&#183;6H2O 
			 
			To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Blocking Solution</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">50 ml TBS-NP-40 
			2.5 ml normal goat serum 
			1 g BSA 
			625 &#181;l Triton-X</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">TBS-NP-40 (pH 7.6)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">155 mM NaCl 
			10 mM Tris HCl 
			0.1% NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">2x MAB (pH6.4)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">160 mM KPIPES 
			10 mM EGTA 
			2 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Commercial 3-D Image processing Software</td>
			<td style="width:177px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:159px;">Volocity (V 6.2)</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Dry block heater&#160;</td>
			<td style="width:177px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">12621-108</td>
			<td style="width:373px;">Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ12</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">SP5</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Flat embedding mold</td>
			<td style="width:177px;">emsdiasum.com</td>
			<td style="width:159px;">BEEM 70904-01</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Public domain image processing software</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td style="width:159px;">ImageJ (V 1.5)</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:532px;">* Success varies by lot number</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of immunolabeling to analyze stable, dynamic, and nascent microtubules in the zebrafish embryo

Mikrotubuli (MTs) sind dynamisch und fragile Strukturen, die schwierig zu Bild in Vivo, insbesondere in vertebrate Embryonen sind. Immunolabeling Methoden werden hier beschrieben, um verschiedene Populationen von MTs in den Entwicklungsländern Neuralrohr des Zebrafish Embryos zu analysieren. Während der Fokus auf Nervengewebe befindet, ist diese Methodik breit anwendbar auf andere Gewebe. Die Verfahren sind für früh zur Mitte-Somitogenesis-Embryonen (1 Somiten zu 12 Somiten), aber sie zu einer Reihe von anderen Stufen mit relativ geringfügigen Anpassungen sind optimiert. Das erste Protokoll stellt eine Methode zur Bewertung der räumlichen Verteilung der stabile und dynamische MTs und eine Quantitative Analyse dieser Populationen mit Bildverarbeitungs-Software. Dieser Ansatz ergänzt vorhandene Tools Bild Mikrotubuli Dynamik und Verteilung in Echtzeit, mit transgenen Linien oder transiente Expression tagged Konstrukte. Solche Werkzeuge sind in der Tat sehr nützlich, aber sie nicht ohne weiteres zwischen dynamischen und stabilen MTs unterscheiden. Die Möglichkeit, Bild und analysieren diese ausgeprägte Mikrotubuli Populationen hat wichtige Implikationen für Verständnis Mechanismen Zelle Polarisation und Morphogenese. Das zweite Protokoll beschreibt eine Technik, um im Entstehen begriffene MTs gezielt zu analysieren. Dies wird erreicht durch die Erfassung der de Novo Wachstumseigenschaften der MTs im Laufe der Zeit nach Mikrotubuli Depolymerisation mit dem Medikament Nocodazole und eine Erholungsphase nach Medikament auswaschen. Diese Technik noch nicht auf das Studium der MTs in den Zebrafish Embryos angewendet, sondern ist ein wertvoller Test zur Untersuchung der in Vivo -Funktion von Proteinen in die Mikrotubuli Montage verwickelt.

Analyse der stabile und dynamische MTs mit immunolabeling In Protokoll Nr. 1ist die Verteilung der MT Sub-Populationen während der frühen (neuronale Kiel) und späten Neuralrohr (neuronale Stab) Entwicklungsstadien offenbart, mit Glu-Tubulin und Tyr-Tubulin als Marker für stabile und dynamische MTs, beziehungsweise. Dynamische MTs überwiegen in dem Hinterhirn Stadium der neuronalen Kiel (4-5 Somiten) (Abbildung 2A-D). Als der Kiel in der neuronalen Stab (11. / 12. Somiten), eine Stufe der erweiterten Epithelisierung entwickelt sind qualitativ weniger MTs immunreaktiven mit dem Tyr-Tubulin-Antikörper (Abbildung 2E-H), vor allem in der ventralen Stab. Im Gegensatz dazu Glu-Tubulin ist verstreut und punktförmige während der neuronalen Kiel (Abbildung 3A-D), aber ist in der ventralen neuralen Stab entlang MT Traktate (Abbildung 3E-H) angereichert. Pfeilspitzen zeigen spezifische MT-Bündel oder Strukturen wo Kennzeichnung erhöht.
Obwohl Anti-Glu-Tubulin und Tyr-Tubulin Antikörper in der gleichen Wirtsarten (verhindert eine doppelte Kennzeichnung Experiment) hergestellt wurden, zeigen diese Ergebnisse, dass stabile und dynamische MT Marker nur selten in der Zebrafisch Hinterhirn überschneiden. Erstens hat die ventrale neurale Rute stabiler (Abbildung 3F) als dynamische (Abbildung 2F) MTs. Die Trendwende in der dorsalen neuralen Rod, konsistent mit einem Modell der Zebrafisch gebildet Neurulation, in dem die dorsale Gewebe dynamische bleibt, bis das Neuralrohr ist,20. Zweitens während mitotische Spindeln voll und ganz mit dem Tyr-Tubulin-Antikörper in der neuronalen Kiel (Abbildung 2D, Pfeilspitzen), nur die Basis der Spindel, deckungsgleich mit dem Centrosome gekennzeichnet sind ist mit der Stabilität Marker beschriftet Glu-Tubulin ( Abbildung 3 D, Pfeilspitzen). Β-Tubulin Immunfluoreszenz, üblich, beide Assays, informiert den Experimentator der Verteilung der alle MTs und bietet eine Grundlage, um unspezifische Kennzeichnung zu entlassen.
Messobjekte mit 3-d-Bildanalyse-Software ergibt sich eine große Menge von Daten, die in eine praktische Tabelle (Tabelle 2) organisiert werden können. Länge, Anzahl und Flächenmessungen zu machen, verwenden wir nur eine Teilmenge der Daten, die zur Analyse zur Verfügung steht. Eine der Komponenten der Daten, die wir weiter nicht zu analysieren ist die Anzahl der identifizierten Objekte. Diese Nummer wird als eine interne Qualitätskontrolle verwendet, da die Zahl nicht zwischen unterschiedlich sollten wie Abschnitte und das Verhältnis der Kerne zu MTs in Einzelbehandlung Zustand ähnlich bleiben sollte. Ein Ausreißer ist ein Indikator, der entweder die Analyse mit angepassten Filter erneut ausgeführt werden soll oder das Bild ist zu schlecht mit der Bezeichnung um zu analysieren. Daher sollten alle Ausreißer Bilder mit angepassten Einstellungen Korsen werden. Die Ausreißer Abschnitt sollte geprüft werden, auf Anzeichen von schlechter Kennzeichnung oder physischen Schaden, die ungewöhnliche Objekt zählt führen können. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, und kontrollierte Qualität, nützlicher Informationen aus wiederhergestellt werden kann die Rohdaten wie durchschnittliche Länge von insgesamt MTs und stabile MTs oder das Verhältnis der stabilen MTs zu total MTs (Tabelle 3). Zusätzlich zu diesen Messungen erhalten viele andere Kennzahlen mit der 3-d-Bildanalyse-Software, die verwendet werden, um Rückschlüsse auf die MTs oder ihre Beziehung zu anderen Zellstrukturen (Kern, Centrosome, etc.) zu zeichnen.
De novo MT-Montage-assay Die Nocodazole Behandlung depolymerizes MTs was diffuse Kennzeichnung (Abbildung 4A, 4-D und 4 G). Wie die MTs nachwachsen, kann sie reichen von der Centrosome (Abbildung 4B, 4E, und 4 H), jedoch dies nicht offensichtlich in einer Ebene durch ihre nicht-planaren Flugbahnen (Abbildung 4C, 4F, und 4I). Dennoch, einige Bildanalyse-Software sind in der Lage Messlängen in 3-d, so dass eine Bewertung der MT Wachstum nach der Nocodazole auswaschen (Tabelle 4). Eine wichtige Beobachtung, die aus dem Dataset in Tabelle 4 gewonnen werden kann ist, dass die mittlere Länge der MTs scheint im Laufe der Zeit nach der Nocodazole-Auswaschung in allen Regionen des Neuralrohrs analysiert. Wie oben erwähnt, bieten andere Arten von Metriken von 3-d-Bildanalyse-Software erhalten zellularen Kontext um die MT-Daten (z. B. Verhältnis von MTs pro Kern) zu interpretieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Darstellung der Auswaschung Vorrichtung zur de novo MT Montage Assay. Der Einschub ist eine Nahaufnahme des durchströmten Gerätes gemacht aus Mesh in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen, schneiden Sie längs eingeklebt. Das Netz teilt die Durchfluss-Gerät so, dass mehrere Gruppen gleichzeitig verarbeitet werden können. Während des Gebrauchs Embryo Medium wird hinzugefügt, um die Spritze und fließt langsam durch die Schläuche, durchströmten Gerät, die eine ständige Spülung für alle Versuchsgruppen zu füllen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Verwendung von Immunolabeling zum dynamischen MTS Bild Dechorionated Embryonen wurden in geeigneten Phasen (4-5 in A-D und 12-13 Somiten E -h), quer geschnitten, durch das Hinterhirn und Immunolabeled mit Antikörpern gegen β-Tubulin (grün in A und E) behoben. alle MTs und Tyrosinated α-Tubulin (rot in B und F) markieren, um dynamische MT Populationen zu offenbaren. Hochdynamische MTs in den fusionierten Bildern (C, G) und ihre höheren Vergrößerungen (D, H) als Bereiche ersichtlich wo Gelbes Etikett sichtbar (Pfeilspitzen in D, H) ist. Skalieren von Balken = 25 µm (A-C und E-G) und 10 µm (D und H). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig3.jpg"> 
FIgure 3: Einsatz von Immunolabeling zu stabilen MTS. Bild Dechorionated Embryonen wurden behoben, durch das Hinterhirn und Immunolabeled auf geeigneten Stufen (4-5 Somiten in A -D und 12-13 Somiten E -h) geschnitten. Stabile MTs sind beschriftet mit Antikörpern gegen die Detyrosinated Form von α-Tubulin (Glu-Tubulin) (rot in B und F) während der gesamten MTs mit einem allgemeinen β-Tubulin-Antikörper (grün in A und E) visualisiert wurden. Rote und gelbe Signale in zusammengeführten Bildern (C, G) und ihrer höheren Vergrößerungen (D, H) repräsentieren Bereiche der hohen MT Stabilität (Pfeilspitzen in D, H). Skalieren von Balken = 25 µm (A-C und E-G) und 10 µm (D und H). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Verwendung von Immunolabeling zum Bild der im Entstehen begriffenen MTS. Dechorionated Embryonen wurden am 4. und 5. Somiten fixiert und quer durch das Hinterhirn geschnitten. Abschnitte wurden Immunolabeled mit β-Tubulin (D, E, und F) anlässlich der wachsenden MTs und γ-Tubulin (A, Bund C), die Keimbildung Punkt/Centrosome zu markieren. Eine dorsale Region des Neuralrohrs ist boxed in (A, D; B, E und C-F) und bei höherer Vergrößerung gezeigt (G, H, ich, beziehungsweise), Kerne (DAPI, blau), Centriolen (γ-Tubulin, rot) und insgesamt zu offenbaren MTs (β-Tubulin, grün). Weiße Pfeilspitzen: NS1 MTs und Centriolen; gelbe Pfeilspitzen: die zweite Zentriol einer Zelle sichtbar ist. Skalieren von Balken = 25 µm (A-F) und 10 µm (G-ich). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55792/55792table1.jpg"> 
Tabelle 1: Standardeinstellungen Sie für das Filtern von Objekten in 3-d-Bildanalyse-Software.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/55792/55792table2.jpg"> 
Tabelle 2: repräsentative Rohdatensatz mit 3-d-Bildanalyse Software analysieren stabile MTs erzielt. Jede Spalte entspricht Messungen aus einem einzigen Abschnitt. Min: kleinste Maß; Max: größte Messung; SD: Standardabweichung; SE: Standardfehler.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/55792/55792table3.jpg"> 
Tabelle 3: Beispiele für Datasets, die 3-d beigezogen werden kann Bild Analysesoftware zur Quantifizierung von stabilen MTs. Wählen Sie Messungen der mittleren Länge von insgesamt (β-Tubulin) und stabil (Glu-Tubulin) MTs berechnet, indem der Durchschnitt der mittleren Skelett Länge für das entsprechende Schild aus allen Proben (siehe Tabelle 2) und das Verhältnis der Stall um MTs (Gesamt Glu-Tubulin Streifen pro β-Tubulin Streifen) berechnet, indem die Anzahl der durchschnittlichen β-Tubulin dividiert durch die durchschnittliche Anzahl der Glu-Tubulin.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/55792/55792table4.jpg"> 
Tabelle 4: Beispiele für Datasets, die 3-d-Bildanalyse-Software zur Analyse entnommen werden kann de novo MT-Montage. Repräsentative Ergebnisse aus der de Novo MT Assembly experimentieren, Vergleich der Datensätze erhalten für drei Mal Wiederherstellungspunkte (1, 5 und 10 min) nach Nocodazole auswaschen. Für jeden Zeitpunkt sind Messungen für nukleare Graf, Centriolen (γ-Tubulin Puncta), Anzahl der insgesamt MTs (β-Tubulin Streifen) gezeigt für ausgewählte Regionen von den abgebildeten (Querschnitt des entwickelnden Neuralrohrs) analysiert.

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Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Immunolabeling Methoden für die unterschiedliche Populationen von Mikrotubuli in das sich entwickelnde Gehirn Zebrafisch Analyse werden hier beschrieben, die sind breit anwendbar auf andere Gewebe. Das erste Protokoll beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling stabile und dynamische Mikrotubuli. Das zweite Protokoll stellt eine Methode zum Bild und speziell im Entstehen begriffenen Mikrotubuli zu quantifizieren.

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Aufrufe.  University of Maryland, Baltimore County. Immunolabeling Methoden für die unterschiedliche Populationen von Mikrotubuli in das sich entwickelnde Gehirn Zebrafisch Analyse werden hier beschrieben, die sind breit anwendbar auf andere Gewebe. Das erste Protokoll beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling stabile und dynamische Mikrotubuli. Das zweite Protokoll stellt eine Methode zum Bild und speziell im Entstehen begriffenen Mikrotubuli zu quantifizieren.

Serie: Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Myelinisierung Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Wirksamkeit der Luft Stripping in zwei Lachsfische Fisch Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss) und Bachforelle (Salmo Trutta Morpha Fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...