Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ernst Und Berta Grimmke Stiftung und die Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (DOG) unterstützt.

Die experimentellen Verfahren dieser Studie wurden durch die Animal Care Ausschuss des Landes Rheinland-Pfalz, Deutschland genehmigt. Tierbetreuung entsprach der institutionellen Richtlinien and The Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augenheilkunde und Vision Forschung. Nach der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche wurden die Tiere behandelt. Männliche C57BL/6J Mäuse (The Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, USA) im Alter von 3 bis 4 Monate waren für die Experimente verwendet. Tiere waren unter Standardbedingungen (Temperatur 23 ± 2 ° C, Luftfeuchtigkeit Bereich 55 ± 10 % und 12 h hell/dunkel-Zyklen) untergebracht und hatten Zugang zu standard-Maus Chow und Wasser Ad Libitum.
1. Isolierung der Maus Retina
<ol><li>Legen Sie die Dissektion Instrumente auf dem Vorbereitungstisch und prüfen Sie, ob alle Instrumente ermöglichen eine schnelle Zubereitung abgeschlossen sind.</li>
	<li>Die Maus durch CO2 Inhalation zu opfern.</li>
	<li>Enthaupte die Maus mit Stahl Schere, Schädel-Sagitally in zwei Hälften, die mit der gleichen Schere schneiden und entfernen Sie die Haut und das Gehirn mit Auge Schere (Abbildung 1).</li>
	<li>Die Schädelknochen lassen nur den augenhöhlenknochen mithilfe Auge Schere abgeschnitten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Umlaufbahn in eine Dissektion Schale mit eiskalten Krebs-Henseleit-Puffer.</li>
	<li>Halten Sie die Dissektion Gericht auf Eis oder ändern Sie den Puffer alle 10 Minuten.</li>
	<li>Schneiden Sie die augenhöhlenknochen mit Auge Schere und entfernen Sie vorsichtig die Augapfels zusammen mit dem orbital Gewebe mit Typ 4 Präzision Pinzetten und Student Vannas Frühjahr Scheren (Abbildung 2).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Harderian Drüse, Bindegewebe und die extraokularen Muskeln mit Typ 5 Präzisions-Pinzetten und Vannas kapsulotomie Scheren, kümmert sich nicht um die Hauptniederlassung der Augenarterie beschädigen.</li>
	<li>Verbinden Sie orbital Zweige von der Augenarterie und schließlich das proximale Ende der wichtigste Zweig der Augenarterie mit 10: 0 Nylon Fäden (Abbildung 3).</li>
	<li>Übertragen des Augapfels in eine Petrischale mit 70 % igem Ethanol für 10 s mit 4 Präzisions-Pinzette geben. Setzen Sie des Augapfels wieder in die Dissektion Gericht und ersetzen Sie den Puffer mit frischen Krebs-Lösung zu. Die Hornhaut wird nach Ethanol Exposition weißlich erscheinen.</li>
	<li>Punktieren Sie die periphere Hornhaut mit einem 30 Gauge-Nadel und sezieren Sie die Hornhaut mit einer Schere Vannas kapsulotomie. Schonend Iris Gewebe geschnitten Sie ab, legen Sie eine scharfe Spitze der Vannas kapsulotomie Schere zwischen der Aderhaut und der Netzhaut und der Aderhaut und Lederhaut abgeschnitten. Lassen Sie einige skleralen Gewebe rund um den Sehnerv (Abbildung 4).</li>
</ol>2. Montage der Netzhaut in der Perfusion Kammer
Hinweis: Die Perfusion Kammer zur Netzhaut arteriola Experimente ist hausgemacht. Es besteht aus einem transparent Reservoir mit einem ein- und Abfluss Rohr (Abbildung 5). Einem Ende ein Silikonschlauch wird auf den Boden der Kammer mit Klebstoff Histoacryl und das andere Ende an ein Dreiwege Hahn befestigt geklebt. Schließen Sie eine Spritze mit frischen Krebs-Puffer, der drei-Wege-Hahn und füllen Sie das Rohr mit Puffer.
<ol><li>Nehmen Sie ein Glas Mikropipette mit einem Nadelhalter und schieben Sie es in das Ende des Rohres an der Unterseite der Perfusion Kammer. Dann brechen Sie die Spitze der Mikropipette mit Typ 4 Scheren, ein Trinkgeld von 100 µm Durchmesser zu erhalten.</li>
	<li>An der Spitze der Mikropipette konzentrieren Sie und spülen Sie es über die Spritze mit dem Schlauch verbunden. Darauf achten Sie, dass die Kapillare nicht durch Trümmer verdeckt ist. Im Falle einer Okklusion entfernen Sie, spülen Sie den Schlauch und fügen Sie ein weiteres Mikropipette.</li>
	<li>Füllen Sie die Perfusion Kammer mit kalten Krebs Puffer und setzen Sie die Kammer unter dem Stereo-Mikroskop.</li>
	<li>Legen Sie eine transparente Kunststoff-Plattform in der Perfusion Kammer. Diese Plattform hat eine Einrückung von 1,8 mm Breite für den Sehnerv und der Augenarterie und befindet sich an zwei Stahlseilen von 1,6 mm Durchmesser. Legen Sie dann einen Edelstahl-Ring von 2,8 mm Innendurchmesser und 4,0 mm Außendurchmesser auf die Plattform.</li>
	<li>Übertragen der Netzhaut mit dem Sehnerv und angehängten Augenarterie aus der Dissektion Kammer in die Perfusion Kammer äußerst vorsichtig mit einem Löffel. Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung Dehnung des Gewebes, wie es möglicherweise nachteilig auf das Experiment.</li>
	<li>Der genähten Teil das proximale Ende der Augenarterie abgeschnitten, legen Sie zwei vorgeformte Schleifen von 10-0-Nylon-Naht auf der Mikropipette und cannulate der Augenarterie mit der Mikropipette. Binden Sie die Arterie, die Mikropipette (Abbildung 6) und platzieren Sie die Netzhaut auf die transparente Plattform Pinzette fein-Punkt.</li>
	<li>Schonend reißen Sie der vorderen Linse Capsula mit zwei feinen Spitze Pinzette auf, ziehen Sie die Linse heraus und schneiden Sie die ganze Linse Capsula mit Microscissors.</li>
	<li>Anschließend stellen Sie vier radiale Einschnitte in die Netzhaut Hälfte der Strecke von der Pars Plana des Sehnervs und legen Sie einen Edelstahl-Ring auf die Netzhaut, es unten zu befestigen. Die Netzhaut ist nun bereit für das Experiment (Abbildung 7).</li>
</ol>3. Vorbereitung der retinalen Arteriolen für das Experiment
<ol><li>Ort der Perfusion Kammer unter einem Lichtmikroskop. Das Ziel ist eine 100 X Eintauchen in Wasser Objektiv.</li>
	<li>Verbinden Sie die beiden Schläuche für in - und out - flow mit einer pericyclic Pumpe und zirkulieren Sie die Kammer mit Krebs-Puffer mit 95 % O2 Sauerstoff und Kohlensäure mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Verwenden Sie einen Durchfluss zwischen 100 und 120 mL/min.</li>
	<li>Schließen Sie den Silikonschlauch, welche an die Mikropipette angeschlossen ist, an ein Reservoir Silikon Schlauch über ein drei-Wege-Hahn. Dann füllen Sie den Tank mit Krebs Puffer bis zu einer Höhe 50 mm Hg entspricht aber noch nicht die drei-Wege-Absperrhahn geöffnet.</li>
	<li>Schauen Sie durch die Ziele des Mikroskops und Fokus auf der retinalen Oberfläche. Suche nach Blutgefäßen oder roten Blutkörperchen. Es ist möglich, dass die Blutgefäße vollständig manchmal nur einige rote Blutkörperchen sichtbar sind zusammengebrochen sind.</li>
	<li>Wenn ein Blutgefäß gefunden wird, darauf konzentrieren und die drei-Wege-Hahn öffnen. Der Durchmesser des Gefäßes sollte sofort erhöhen und die roten Blutkörperchen bewegen entweder Zentrifugal, ob es eine arteriola, oder centripetally im Falle einer Venole. Die Arteriolen sind kleiner im Durchmesser im Vergleich zu Venolen der gleichen Größenordnung.</li>
	<li>Wenn ein Blutgefäß mit einem gut sichtbaren Wand gefunden ist, kann es für Experimente, die nach einer gasgleichgewichtherstellung von 30 min (Abbildung 8) eingesetzt werden. Zur Zeit der Gleichgewichtherstellung entwickeln die Arteriolen nur schwach inneren Ton, was zu weniger als 10 % der luminalen durchmesserreduzierung.</li>
</ol>4. Durchführung des Experiments
<ol><li>Testen Sie die Tragfähigkeit der Schiffe mit der Thromboxan mimetischen 9,11-Dideoxy-9α, 11α-Methanoepoxy Prostaglandin F2α (U46619), indem es zu den Bad-Lösung. Dieser Agent verengt Maus retinalen Arteriolen um ca. 50 % von Ruhestellung Durchmesser bei Konzentrationen von ≥ 10-6 M.</li>
	<li>Sobald das Schiff tragfähige bestätigt wird, waschen Sie die Agonisten aus dem Bad durch die Umwälzpumpe und liefern Sie frische Krebs Puffer in die Wanne.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+ocular+blood+flow,+glaucoma,+and+diabetic+retinopathy.">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li><li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy.">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li><li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma.">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li><li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+:+smaller+vessels,+bigger+insight.">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells.">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li><li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux,+velocity,+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye.">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles.">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries.">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li><li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha(1)B+-adrenoceptor+subtype+mediates+adrenergic+vasoconstriction+in+mouse+retinal+arterioles+with+damaged+endothelium.">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Die Messung der vaskulären Antworten in der Maus Netzhaut ist schwierig, aufgrund der geringen Größe der Netzhautgefäße. Mit der vorgestellten Technik sind retinale Arteriolen durch übertragbare Lichtmikroskopie visualisiert. Dies ist möglich, weil die isolierte Netzhaut lichtdurchlässig ist. Der Vorteil des Verfahrens ist die hohe optische Auflösung. Die berechnete räumliche Auflösung beträgt 11 px/µm. Allerdings ist die echte Auflösung für das optische System, das weißes Licht verwendet, zwischen 200 und 300 nm, die durch die Beugungsgrenze Abbe erläutert wird. Da die erste Niederlassung der retinalen Arteriolen Maus einen Innendurchmesser von 20 bis 30 µm hat, sind Änderungen der Durchmesser von ca. 1 % nachweisbar mit diesem System. Entfällt der zusätzliche technische Geräte oder fluoreszierende Farbstoffe wie in anderen Studien berichtet, kleine retinalen Arteriolen5,6,7zu visualisieren. Ein Nachteil der Technik ist die lange Vorbereitungszeit, die zwischen 90 bis 120 min durch ausgebildete Ermittler ist. Wenn die Vorbereitungszeit 180 min überschreitet, beginnt die Endothelfunktion abgeschwächt werden.
Es gibt mehrere große wichtige Schritte in dieser Technik. Erstens ist es wichtig, gründlich alle retrobulbären arterielle Zweige verbinden. Wenn Ligatur unvollständig ist, retinale Arteriolen werden nicht durch Leckage unter Druck. Zweitens, das Eintauchen in Ethanol für 10 s vor der Eröffnung des Augapfels ist wichtig, die glatte Muskulatur Reaktivität von der Augenarterie zu deaktivieren. Wir bereits unter Beweis gestellt, dass eintauchen für 10 s in 70 % igem Ethanol komplett deaktiviert die Augenarterie Glattmuskel8. Im Gegensatz dazu dürften retinale Arteriolen Ethanol, direkt betroffen sein, da sie durch die bulbärer Wand geschützt sind. Wenn dieser Schritt ausgelassen wird, beeinflussen durchmesserwechsel in der Augenarterie die Durchblutung der Netzhaut. Reaktivität von der Augenarterie ist der Hinweis deutlich von der retinalen Arteriolen in Reaktion auf den gleichen Agonist9,10abweichen. Drittens: vermeiden Sie Torsion von der Augenarterie. Vor allem bei der Montage der Netzhaut Vorbereitung auf die Plattform, kann der Augenarterie verdreht werden Okklusion des Lumens führt. Darüber hinaus prüfen Sie sorgfältig, dass die Spitze der Glas-Kapillare nicht verschlossen ist, um Druckbeaufschlagung der retinalen Arteriolen zu ermöglichen. Wir empfehlen nicht mehr als drei aufeinander folgende Konzentration-Wirkungs-Kurven in der gleichen retinalen Vorbereitung durchführen weil wir beobachtet, dass Antworten auf Acetylcholin schwächer wurde, wenn die Konzentration-Wirkungs-Kurven für mehr als drei Mal wiederholen. Aber möglicherweise gibt es Unterschiede in Bezug auf die Reproduzierbarkeit der Konzentration-Wirkungs-Kurven abhängig von den Agenten angewendet und sollte daher individuell geprüft werden.
Wir pharmakologische Wirkstoffe Extraluminally in unseren Studien angewendet, obwohl Intraluminal Perfusion mit einem Servo Steuerung Pumpe auch möglich ist. Da die Technik erlaubt es, um für lokale Mechanismen der vaskulären Reaktivität in der Netzhaut von kleinen Labortieren wie Mäuse und Ratten zu messen, können die Vorteile der Gene-targeting Technologie mithilfe genetisch veränderter Tiere mit dieser Methode zugegriffen werden .

Störungen im retinalen Durchblutung haben in der Pathogenese der verschiedenen augenfälligen Krankheiten, z. B. Diabetische Retinopathie und Hypertensive Retinopathie Glaukom1,2,3verwickelt. So Studien zur Messung der vaskulären Reaktivität in der Netzhaut sind wichtig, um die Pathophysiologie dieser Krankheiten zu verstehen und entwickeln neue Behandlung nähert.
Durch die Möglichkeit der Genmanipulation im murinen Genom ist die Maus eine weit verbreitete Tiermodell für Studien des Herz-Kreislauf-System4geworden. Jedoch wegen der geringen Größe der Netzhautgefäße (≤ 30 µm) ist Messung der vaskulären Reaktivität in der Maus Netzhaut anspruchsvoll. Z. B. stereomicroscopic Techniken zur in Vivo Messung sind in ihrer optischen Auflösung begrenzt und erlauben daher nur zum Erkennen von Änderungen im Durchmesser oder Blut fließen in kleinen Blut von weniger als ≤ 30 µm Durchmesser bei der Ausstattung mit genau Weitere anspruchsvolle Geräte wie ein confocal Mikroskop mit Fluoreszenzfarbstoffen oder die Adaptive Optik Scannen Licht Ophthalmoskop5,6. Darüber hinaus ändert sich die Interpretation der in Vivo Messungen zur Ermittlung lokaler signalisieren, dass Mechanismen in retinalen Blutgefäßen durch Anästhetika, verwechselt werden können in systemischen Blutdruck und der Einfluss des retrobulbären Blutgefäße.
Daher entwickelten wir eine Methode zur Messung der Reaktionen der Netzhautgefäße Maus mit hochauflösenden optischen ex Vivo. Die enthaltenen erlaubt Visualisierung der retinalen Arteriolen über übertragen Lichtmikroskopie. Diese Methode, die auch bei Ratten verwendet werden kann, bietet Zugriff auf die Vorteile der Gene targeting-Technologie in okulären Gefäßforschung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steel Scissors</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3576.1</td>
			<td>1x 140 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19390</td>
			<td>1x straight, 10.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH68.1</td>
			<td>2x type 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>2x type 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas capsulotomy scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>19760</td>
			<td>1x straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td>1x curved,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Needle Holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-17500</td>
			<td>1x curved, 120 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305128</td>
			<td>1x 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries (for producing micropipettes)</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-1211</td>
			<td>1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Suture</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>198001</td>
			<td>1x 10-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>1x 35 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td>1x 100 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discofix C</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16500C</td>
			<td>10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl adhesive</td>
			<td>B. Braun Surgical, S.A.</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyclic pump&#160; (CYCLO II)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>EP76.1</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Vanox-T AH-2)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera (TK-C1381)</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K928.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0965.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9,11-dideoxy-9&#945;,11&#945;-methanoepoxy prostaglandin F2&#945; (U-46619)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo

Vaskuläre Insuffizienz und Veränderungen in der normalen retinalen Durchblutung gehören zu den Hauptfaktoren für die Pathogenese der verschiedenen Anblick-bedrohlichen okuläre Erkrankungen wie Diabetische Retinopathie, Hypertensive Retinopathie und Glaukom. Netzhaut mikrovaskuläre Vorbereitungen sind daher entscheidende Instrumente zur physiologischen und pharmakologischen Studien, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen abzugrenzen und zu Design-Therapien für Krankheiten. Trotz der breiten Verwendung von Mausmodellen in Augenheilkunde sind Studien über die Netzhaut vaskuläre Reaktivität knapp in dieser Spezies. Ein wesentlicher Grund für diese Diskrepanz ist die anspruchsvolle Isolierungsmaßnahmen aufgrund der geringen Größe der diese Netzhautgefäße, die ~ ≤ 30 µm luminalen Durchmesser. Um das Problem der direkten Isolation dieser Netzhaut mikrogefäßen für funktionelle Studien zu umgehen, haben wir eine Isolation und Vorbereitung Technik, die ex-Vivo -Studien der retinalen Vasoactivity Maus in der Nähe von physiologischen Bedingungen ermöglicht . Obwohl die vorliegenden experimentellen Vorbereitungen speziell auf die Maus retinalen Arteriolen beziehen werden, kann diese Methode leicht zu mikrogefäßen von Ratten eingesetzt werden.

U-46619 produziert Konzentration abhängig Vasokonstriktor Antworten in retinalen Arteriolen von Wildtyp Mäusen C57Bl/6J Hintergrund. Bei einer Konzentration von 10-6 M war die Reduktion der luminalen Durchmesser ≈50 % aus ruhenden Durchmesser. Abbildung 9A zeigt eine repräsentative Konzentration-Wirkungs-Kurve von einem retinalen arteriola. In Arteriolen mit U46619 preconstricted evozierte kumulative Gabe von Acetylcholin Konzentration abhängig Erhöhungen der luminalen Durchmesser ≈25 % vom preconstricted Durchmesser bei 10-5 M, bezeichnend für einen intakten Gefäßendothels ( Abbildung 9 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig1.jpg"> Abbildung 1: Präparation des Schädels Maus. Haut auf dem Kopf der enthaupteten Maus wird entfernt, um die Augen und die Augenhöhle verfügbar zu machen. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig2.jpg"> Abbildung 2: Isolierung von Globe und Orbital Augengewebe. Die augenhöhlenknochen wurde mit Auge Schere und des Augapfels zusammen mit Retrobulbären Gewebe geschnitten und Sehnerv wurden sorgfältig isoliert. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig3.jpg"> Abbildung 3: die Augapfels und Vorbereitung von der Augenarterie. Sobald das umliegende orbital Gewebe mit feinen Microscissors seziert wurden, der Augenarterie sorgfältig ausgesetzt war und ihre kleine Äste mit 10: 0 Nylon Monofile Fäden ligiert. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig4.jpg"> Abbildung 4: Dissektion der okulären Strukturen. Um die Netzhaut zu visualisieren, wurden die Sklera und Uvea mit Vannas kapsulotomie Schere seziert. Einige skleralen Gewebe um den Sehnerv wurde zur Vermeidung von Beschädigungen der Augenarterie gelassen. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig5.jpg"> Abbildung 5: Orgel Kammer für Echtzeit-Videomikroskopie. Die Kammer war hausgemacht. Es bestand aus einer Petrischale mit 100 mm Durchmesser mit einem Rohr in und out - flow. Die Rohre wurden mit Histoacryl Kleber geklebt. Extern sauerstoffreiches und kohlensäurehaltige Krebs-Henseleit-Puffer wurde durch eine Peristaltische Pumpe über diese Rohre verteilt. Einem Ende ein Silikonschlauch klebte an der Unterseite der Kammer und das andere Ende an ein Dreiwege Hahn befestigt. Am Ende des Rohres wurde ein Glas Mikropipette mit einer Spitze von 100 µm eingesetzt, dienten zur Kanülierung der Augenarterie. Über den Silikonschlauch, die ophthalmologische Zirkulation war unter Druck, indem ein Silikonschlauch mit Krebs Puffer auf ein Niveau entspricht 50 mm Hg. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig6.jpg"> Abbildung 6: Kanülierung der Augenarterie. Der Augenarterie war mit Glas Mikropipette kanülierte und mit einer 10-0-Nylon-Naht vernäht. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig7.jpg"> Abbildung 7: Kanülierung der Augenarterie. Nach dem Platzieren der Netzhaut auf die transparente Plattform, das Objektiv mit dem kapselsacks entfernt wurde, wurden vier radiale Einschnitte in die Netzhaut und Edelstahl Ring von 2,8 mm Innendurchmesser und 4,0 mm Außendurchmesser wurde gelegt auf die Netzhaut an die b Ottom. Die Netzhaut war bereit für das Experiment. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig8.jpg"> Abbildung 8: Visualisierung der Netzhautgefäße. Eine beispielhafte retinalen arteriola mit roten Blutkörperchen im Inneren.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig9.jpg"> Abbildung 9: funktionelle Studien mit Videomikroskopie. Repräsentative Konzentration-Wirkungs-Kurven von einem einzigen retinalen arteriola. (A) Konzentration-Wirkungs-Kurve für den Vasokonstriktor, U46619 (10-9 bis 10-6 M), und (B) für die Endothel-abhängige Vasodilatator, Acetylcholin (10-8 bis 10-5 M). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Viele Vision-bedrohlichen okuläre Erkrankungen gehen einher mit dysfunktionalen retinalen mikrogefäßen. Daher ist die Messung der retinalen arteriola Antworten wichtig, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für Maus retinalen arteriola Isolation und Vorbereitung zur Bewertung der Auswirkungen von vasoaktive Substanzen auf vaskuläre Durchmesser.

Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

7.1K Aufrufe.  University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz. Viele Vision-bedrohlichen okuläre Erkrankungen gehen einher mit dysfunktionalen retinalen mikrogefäßen. Daher ist die Messung der retinalen arteriola Antworten wichtig, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für Maus retinalen arteriola Isolation und Vorbereitung zur Bewertung der Auswirkungen von vasoaktive Substanzen auf vaskuläre Durchmesser.

Serie: Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Forschung

Medizin

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an extended perfusion period is challenging. We have added the kidney to our previous ex vivo perfused liver experiment model to reproduce a more accurate physiological state for prolonged experiments without using live animals. Five intact livers and kidneys were retrieved post-mortem from sacrificed pigs on different days and perfused for a minimum of 6 hr. Hourly arterial blood gases were obtained to analyze pH, lactate, glucose and renal parameters. The primary endpoint was to investigate the effect of adding one kidney to the model on the acid base balance, glucose, and electrolyte levels. The result of this liver-kidney experiment was compared to the results of five previous liver only perfusion models. In summary, with the addition of one kidney to the ex vivo liver circuit, hyperglycemia and metabolic acidosis were improved. In addition this model reproduces the physiological and metabolic responses of the liver sufficiently accurately to obviate the need for the use of live animals. The ex vivo liver-kidney perfusion model can be used as an alternative method in organ specific studies. It provides a disconnection from numerous systemic influences and allows specific and accurate adjustments of arterial and venous pressures and flow.

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Study of the animal organ physiology can be achieved by performing an experimental ex vivo perfusion system. The addition of a porcine kidney, as a homeostatic organ to our previously developed ex vivo liver perfusion model can be a principal step to achieve a better physiological environment.

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

Echokardiographische Messung rechtsventrikulärer diastolischer Parameter in der Maus

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...