Wir möchten Dr. Hesham Abdelbary für die Bereitstellung von menschlichen chirurgischen Proben für die Daten in Abb. 2 dargestellt danken.

1. Tissue Verarbeitung <ol><li> Für beste Ergebnisse sollte dieses Protokoll unter Verwendung von frisch isolierten Gewebe in DMEM-Medium hinterlegt, welches 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycin-Lösung und 0,1% Amphotericin B-Lösung unmittelbar nach der Operation vor der Verarbeitung sein. Ist dies nicht möglich ist, können Gewebe über Nacht in diesem Medium belassen werden bei 4 Grad vor der Verarbeitung. </li><li> Vor der Verarbeitung der Probe, sterilisieren Metall Pinzette und Einweg-Klingen durch Hinterlegung sie in einem 70% igem Ethanol-Lösung für mindestens 5 Minuten. Ferner einen 24-Well-Platte mit 2 ml DMEM Medium mit 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycin-Lösung und 0,1% Amphotericin B. </li><li> Sammeln Sie die Gewebeprobe in einer laminaren Strömung Zellkultur Kapuze mit sterilisierten Pinzetten und Hinterlegung des Gewebes in einen leeren 15 cm Petrischale, halten den Deckel auf der Seite, sterile Seite nach oben. </li><li> In der Zellkultur Kapuze, mit einem 2 mm Biopsiestanze auf verschiedenen Kernen aus einer Vielzahl von Regionen innerhalb des Gewebes, wie in Abbildung 1 zu erhalten. Kaution die Kerne in den Deckel der 15 cm Petrischale mit Hilfe der Pinzette, so dass genügend Platz zwischen den einzelnen Kern, so dass sie leicht entlang der horizontalen Achse geschnitten werden. </li><li> Split jeder Kern in 4 sogar Quartale mit einem sterilisierten Rasierklinge wie in Abbildung 1. </li><li> Mit einer Pipettenspitze, legte jeder Kern Quartal von einem bestimmten Kern in ein anderes auch von A1 bis A4, wie in Abbildung 1, die bereits mit 1,5 ml DMEM mit 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycin-Lösung und 0,1% Amphotericin B-Lösung . Wiederholen Sie für jeden Kern. Dies sollte repräsentative Probenahme des Tumors, bei gleichzeitiger Minimierung der Verzerrungen in einem bestimmten und / Zustand. Zur besseren Darstellung, erhöhen Sie die Anzahl der Kerne. </li></ol> 2. Beurteilung der Lebensfähigkeit des Gewebes <ol><li> Nach Gewebe Verarbeitung, fügen Sie 25 &amp;mgr; l Alamar blue gut # A1 und A2 # wie in Abbildung 1 dargestellt und Inkubation für 1 Stunde bei 37 Grad in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation mit Alamar-Blau, entfernen Sie 3 mal 100 ul von jedem A1 und A2 gut und Transfer zu 6 verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Lesen Sie das Signal mit Hilfe eines Fluoreszenz-Reader (530 Anregung, 590 Emission) und halten die Daten für Ihre Unterlagen. </li><li> Nach Alamar blue-Signal gelesen worden ist, übertragen Sie alle Stücke von Gewebe mit Hilfe einer Pipettenspitze aus gut A1 bis C1, die enthält DMEM, 10% FBS + PS + AmphoB. Achten Sie darauf, eine übermäßige Menge an Medien und A1 übertragen. </li><li> Infect Brunnen A3 und A4 mit jeweils 10 6 PFU der GFP-exprimierenden und Luciferase-exprimierenden Vaccinia-Virus in 25 ul Medium verdünnt. Nun A2 kann mit einem Virus, das drückt jedem Transgen auch gar keine infiziert werden. </li><li> 72 Stunden später, fügen Sie 25 ul Alamar blue in die Vertiefungen C1 und D1 und wiederholen Sie Schritt 2.2 </li></ol> 3. Visualisierung von GFP Transgenexpression durch Fluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Entfernen Sie alle Zellkulturmedien für die Gewebestücke, um eine gute Fluoreszenz Bilder zu machen. </li><li> Mit Hilfe eines Fluoreszenz-fähigen Dissektionsmikroskop, zunächst einen Phasenkontrast Bild an eine geeignete Auflösung </li><li> Wechseln Sie zur Fluoreszenz-Modus und nehmen Sie ein Bild mit der entsprechenden Filter auf das Transgen von Interesse zu visualisieren, in diesem Fall GFP. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Filter für eine andere Wellenlänge als bisher eine mögliche aus, dass das Transgen von Interesse (wie RFP), um ein Bild der Hintergrundfluoreszenz zu </li></ol> 4. Visualisierung von Luciferaseexpression mit einem In-vivo-Bildgebung System (IVIS) <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die IVIS initialisiert wird, bevor Sie beginnen. </li><li> In Brunnen A4 und B4, mit 5 ul der Luciferin-Substrat 10 mg / ml, gut mischen und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Stellen Sie die IVIS Exposition wurde auf 5 Sekunden und nehmen Sie ein Bild von Ihrem Brunnen. Wenn das Bild gesättigt ist, mit geringeren Belichtungszeit zu wiederholen. Wenn es kein Signal, erhöhen Sie die Belichtungszeit. </li><li> Mit dem IVIS Imaging-Software, können Sie entfernen Hintergrund mit dem Signal von gut B4 und wählen Sie die Region von Interesse für die Lumineszenz-Signal zu quantifizieren. </li></ol> 5. Die Beurteilung Virustiter durch Plaque-Assay <ol><li> Vor der Quantifizierung virale Titer, muss Gewebe zunächst homogenisiert, um Viruspartikel freisetzen. Dies kann einige Monate später in den infizierten Gewebeproben durchgeführt werden bei -80 </li><li> Wiegen der Probe, die homogenisiert mit Hilfe eines analytischen Maßstab werden muss. In diesem Fall werden wir die Probe aus und A2 gesammelt. </li><li> Legen Sie das Gewebe in einem 5 ml Polystyrol Rundboden-Falcon-Röhrchen und 1 ml PBS. Homogenisieren des Gewebes mit einem Gewebe-Homogenisator. Falls nötig, speichern das Homogenat bei -80 für die Bewertung der viralen Titer zu einem späteren Zeitpunkt. </li><li> Um Titer Vaccinia-Virus, erste Platte 1 Million U2OS Zellen in einer 6-Well-Platte und inkubieren bei 37 Grad über Nacht, 5% CO 2 feuchtenified Inkubator, so dass sie ca. 95% erreicht Konfluenz des folgenden Tages. </li><li> Verwenden Sie serumfreien Medien serielle Verdünnungen von Virus zu tun, achten Sie darauf, Spitzen zwischen jeder Verdünnung Schritt zu ändern. Typischerweise wir 1 in 10 Verdünnungen und verwenden 100 ul in 900 ul zu übertragen. Wie viele Verdünnungen gemacht werden, hängt von den zu erwartenden Virusausbeute. </li><li> Nach Herstellung der Verdünnungen, entfernen Sie die Medien über die plattierten U20-Zellen fügen Sie dann 500 ul der verdünnten Virus Lager (für jede Verdünnung), um die U2OS Zellen zu infizieren. Inkubieren Sie die Zellen für 1 Stunde Minuten bei 37 Grad Celsius in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li><li> Während dieser Zeit aufwärmen 2 X konzentriert DMEM mit 20% FBS und die 3% CMC-Lösung in einem 37 Grad Wasserbad. </li><li> Nach dem 1 Stunde Inkubation, entfernen Sie die Medien über infizierte U2OS Zellen. 1:1 mischen Volumen von 3% CMC: 2X DMEM, 20% FBS zusammen und verwenden 2 ml dieser Mischung in jede Vertiefung der infizierten Zellen U2OS decken. </li><li> Put-Zellen wieder in eine 37 Grad 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für weitere 48 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden, 2 ml Methanol-Essigsäure Fixativ auf dem CMC-Overlay in jede Vertiefung und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten in einer Zellkultur Kapuze. </li><li> Entsorgen Sie die feste Auflage und waschen Rest aus der Brunnen mit Leitungswasser. </li><li> Stain der festen U2OS Zellen mit 2ml einer Coomassie-Blau-Lösung pro Well und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur bei geringer Geschwindigkeit auf einem Schüttler. </li><li> Entfernen Sie die Coomassie aus den Vertiefungen Fleck und waschen Sie die Teller mit Leitungswasser. Lassen Sie sich mit Deckel für etwa eine Stunde trocknen lassen. </li><li> Die resultierende virale Plaques können leicht sichtbar in Abbildung 2c. Die Platten können auf unbestimmte Zeit in diesem Stadium gespeichert werden. </li><li> Count-Plaques bei der Verdünnung, wo zwischen 10 und 100 Plaques sichtbar sind. </li><li> Multiplizieren Sie die Anzahl der Plaques durch die Verdünnung verwendet gezählt und multiplizieren Sie die resultierende Zahl durch 2 zu einem Titer in PFU / ml zu erhalten. Zum Beispiel, wenn 25-Plaques in den Brunnen, wo ein Millionen-fachen Verdünnung verwendet wurde gezählt werden, ist der Titer der ersten unverdünnten Probe 25 von 1 Million von 2 oder 50 Millionen PFU / ml multipliziert. Weitere teilen diese Zahl durch das Gewicht zunächst für die Probe-Titer in PFU / g Bericht zu messen </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Um genau zu bestimmen, ob ein chirurgisch gewonnenen normal / Tumorgewebe Probe ist oder nicht infizierbaren mit dem Virus, muss man zuerst sicherstellen, dass die Gewebeprobe mindestens lebensfähig ist. Abb. 1A zeigt, dass die Rentabilität beurteilt werden kann mit einem metabolischen Farbstoff (Alamar blue) und dass sowohl Normal-und Tumorgewebe bleiben können metabolisch aktive über einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden sein. Dies deutet darauf hin, dass Gewebe kultiviert ex vivo kann die virale Replikation zu unterstützen. Ein wesentlicher Vorteil von onkolytischen Viren ist, dass sie konstruiert werden können, um therapeutische oder Imaging Transgene exprimieren. Abb. 2D-E zeigt, dass GFP oder Luciferase aus dem Gewebe infiziert ex vivo nachgewiesen werden können, weiter unterstützen, dass diese Gewebe lebensfähig und auch infizierbaren sind. Obwohl erhöhte Transgenexpression ist in der Regel mit viralen Replikation assoziiert, bedeutet dies nicht zwangsläufig zu einer produktiven viralen Lebenszyklus, die Selbst-Verstärkung und Verbreitung, die vermutlich für therapeutische Aktivität wichtig ist, führt gleichzusetzen. Aus diesem Grund ist es notwendig, festzustellen, ob mehr Viren als das, was verwendet wurde, um zunächst zu infizieren das Gewebe hergestellt wird. Abb. 2B zeigt, dass auf virale Quantifizierung durch Plaque-Assay, mehr Viren nach 72 Stunden Infektion erhalten dann Gewebe unmittelbar nach der Infektion gesammelt. Insgesamt zeigen diese Daten, die chirurgisch exzidiert Tumorgewebe bleiben können in der Zellkultur lebensfähig für einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden, während welcher Zeit die virale Replikation unterstützt werden kann. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Übersicht über die Gewebeentnahme / Schneiden Protokoll. Gewebeprobe wird durch das Entfernen mehrerer 2 mm-Kerne, die anschließend in vier Viertel, die zufällig in die Vertiefungen A1-A4 verteilt sind unterteilt verarbeitet. Die Farbcodes zeigen die Reagenzien in jedem gut genutzt. Die grau unterlegten Felder in den Brunnen stellen jedes Quartal seit 6 einzelne Kerne dargestellt. Das Gewebe in gut A1 ist es, einen neuen Brunnen (C1) mit den Medien nach dem ersten Alamar-Blau Lesen übertragen. Eine zweite Lesung ist am Ende der 72 Stunden Inkubation mit Viren durchgeführt. Wells A4 und B4 werden mit Luciferin nach dem 72 Stunden Inkubationszeit nach der Infektion ergänzt <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Die Lebensfähigkeit und infectability der Patienten Gewebeproben. A) Tissue Lebensfähigkeit von Alamar-Blau-Signal bei 2 Stunden und 72 Stunden nach der Sammlung gemessen. Y-Achse repräsentiert die leere korrigiert Alamar-Blau-Signal. B) Titer von Vaccinia-Virusgesammelt pro Gramm Gewebe-Proben 2 und 72 Stunden nach der Infektion. C) Beispiel von Vaccinia-Virus-Plaques auf U2OS Zellen nach Coomassie-Färbung. D) Lumineszenz-Signal von Patienten VV-Luciferase-infiziertem Gewebe erhalten aufgenommen mit IVIS. E) Fluoreszenzmikroskopie Bilder der Patient Gewebeprobe mit VV-GFP infiziert.

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Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die Beschaffung frischen Gewebeprobe. Wenn die Probe in der Zellkultur nach einer langen Wartezeit am OP-Saal in einem ungeeigneten Medien (zB PBS) gestellt, kann dieser Kompromiss Gewebeviabilität und verhindern infectability. Zu beachten ist, normales Gewebe naturgemäß anfälliger für diese Effekte als Tumorgewebe. Ein weiterer kritischer Punkt ist, wie viele Kerne werden verwendet, um das Gewebe und die Konsistenz ihrer Größe Probe. Inkonsistenzen in der Größe wird die Variabilität in Patientenproben führen, da Faktoren wie Hypoxie und infectectable Oberfläche schwanken abhängig von der Größe der Kerne und Kern-Viertel. Während dies teilweise durch Verwendung von Gewebe Aufschnittmaschinen gelöst werden kann, ist ein Vorteil der hier vorgestellten Verfahren, dass es relativ einfach ist, weniger anfällig für Verschmutzung und breit anwendbar auf eine Vielzahl von Gewebearten, darunter weich oder zähflüssig Geweben, die nicht leicht zugänglich sind das Gewebe schneiden. Bemerkenswert ist, kann die Anzahl der Kerne erhöht werden, um bessere Gewebe-Darstellung zu erhalten. Auch die Kerne in mehrere Teile (zB 5-8) geschnitten werden, um andere potenzielle Assays unterzubringen parallel wie DNA, RNA oder Protein-Extraktion durchgeführt werden. Allerdings wird die Anzahl der Stücke, in denen die Kerne, um reproduzierbare Größen geschnitten werden kann, auf die tatsächliche Größe der Kerne, die durch die Verwendung unterschiedlicher Größe Entkernern geändert werden können, hängen. Optional ist ein Weg, um Hilfe zu erhalten reproduzierbar große Gewebestücke auch die Länge der Kerne mit einem Lineal vor einer weiteren Unterteilung in kleinere Stücke. Das Protokoll kann natürlich geändert werden, um andere Viren beherbergen, und wir haben festgestellt, dass Gewebe können lebensfähig sein und unterstützt die Replikation für bis zu 6 Tage. Das Protokoll kann weiter auf Messungen von anderen viral-Ausdruck Transgene einschließlich cytrokines erweitert werden. Nach der Infektion kann Gewebe auch in Paraffin für weitere Schnitte und Färben von immunhistochemischen Methoden, die zur weiteren Verfeinerung des Gewebes Histologie ermöglicht und wie sie sich auf virale Infektion 10-12 eingebettet werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Hohe Glukose DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> NorthBio Inc. </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B-Lösung </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Verwenden Sie bei 0,1% </td></tr><tr><td> Pennicilin-Streptomycin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Verwenden Sie bei 1% </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin Kaliumsalz </td><td> Molecular Imaging Products </td><td> D-Luciferin Kaliumsalz 1g </td><td> Resuspendieren in PBS bei 10 mg / ml und Filter auf 0,22 um Filter </td></tr><tr><td> MEM Pulver </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Machen Sie in der Hälfte der vorgeschlagenen Volumen von 2X MEM und Filter auf 0,22 um Filter vor der Verwendung der </td></tr><tr><td> Carboxymethylcellulose (CMC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Machen Sie eine 3% ige Lösung in VE-Wasser und Autoklaven. Beachten Sie, dass Pulver kann einige Zeit dauern resuspendieren </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mm Biopsiestanze </td><td> Miltex </td><td> MX-33 bis 31 </td><td></td></tr><tr><td> Double Edge Prep Blades </td><td> Personna Medical Care </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Mikroskop disection </td><td> Leica </td><td> Modell M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> In-vivo-Imaging-System (IVIS) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> IVIS ® 200 Serie </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Tearor </td><td> Biospec Produkte </td><td> Modell 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses

Onkolytischer Viren (OVS) sind neuartige Therapeutika, die selektiv in replizieren und zu töten Tumorzellen 1. Mehrere klinische Studien zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Vielzahl von Plattformen, darunter onkolytischen HSV, Reovirus, und Vaccinia OVS als Behandlung für Krebs sind derzeit im Gange 2-5. Ein wesentliches Merkmal von onkolytischen Viren ist, dass sie genetisch verändert werden kann, um Reporter Transgene, die es möglich, die Infektion von Gewebe durch Mikroskopie oder Bio-Lumineszenz-Imaging 6,7 visualisieren macht auszudrücken. Dies bietet einen einzigartigen Vorteil, da es möglich ist, Geweben von Patienten ex vivo vor der Therapie zu infizieren, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen onkolytischer Virotherapie 8 zu ermitteln. Zu diesem Zweck ist es wichtig, angemessen Gewebeprobe für Gewebe Heterogenität zu kompensieren und zu bewerten Gewebeviabilität, insbesondere vor der Infektion 9. Es ist auch wichtig, um die virale Replikation mit Reporter Transgene, wenn sie von den onkolytischen Plattform sowie durch direkte Titration von Geweben nach der Homogenisierung, um zwischen abortive und produktive Infektion zu unterscheiden zu folgen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, diese Probleme anzugehen und hierin beschrieben 1. Die Probenahme und der Vorbereitung von Tumorgewebe für die Zellkultur 2. Die Beurteilung der Lebensfähigkeit des Gewebes mit dem metabolischen Farbstoff Alamar blue 3. Ex-vivo-Infektion von kultivierten Gewebe mit Vaccinia-Virus, die entweder GFP oder Luciferase 4. Nachweis der Transgenexpression durch Fluoreszenzmikroskopie oder mit einem In-vivo-Imaging System (IVIS) 5. Die Quantifizierung der Virus durch Plaque-Assay. Diese umfassende Methode hat mehrere Vorteile wie etwa eine einfachere Gewebe Verarbeitung, Entschädigung für die Gewebe-Heterogenität, die Kontrolle der Lebensfähigkeit des Gewebes und Diskriminierung zwischen abortive Infektion und Knochen fide Virusreplikation.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Onkolytischen Viren sind für Krebstherapeutika vielversprechend. Die Fähigkeit, die infectability von Live-Gewebeproben von Patienten vor der Behandlung erhalten zu ermitteln ist ein einzigartiger Vorteil dieses therapeutischen Ansatzes. Dieses Protokoll beschreibt, wie das Gewebe für die Prozess-<em&gt; Ex vivo</em&gt; Infektion mit onkolytischen Virus und nachfolgende virale Quantifizierung.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

12.6K Aufrufe.  Ottawa Hospital Research Institute (OHRI). Onkolytischen Viren sind für Krebstherapeutika vielversprechend. Die Fähigkeit, die infectability von Live-Gewebeproben von Patienten vor der Behandlung erhalten zu ermitteln ist ein einzigartiger Vorteil dieses therapeutischen Ansatzes. Dieses Protokoll beschreibt, wie das Gewebe für die Prozess- Ex vivo Infektion mit onkolytischen Virus und nachfolgende virale Quantifizierung.

Serie: Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Forschung

Medizin

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarterial Verwaltung von onkolytischen Viren für lokoregionale von Orthotopische HCC bei Ratten

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

Muttermilch fördert Wachstum der Enteroids: ein Ex-Vivo -Modell der Zellproliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...