Este trabalho foi apoiado por concessões do und Ernst Berta Grimmke Stiftung e da Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (cão).

Os procedimentos experimentais deste estudo foram aprovados pelo Animal conta Comissão de Renânia-Palatinado, Alemanha. Cuidados com animais em conformidade com as orientações institucionais e a associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisa. Animais foram tratados de acordo com a directiva da União Europeia 2010/63/UE para experiências em animais. Masculinos camundongos C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Porto da barra, ME, EUA), com 3-4 meses de idade foram utilizados para os experimentos. Os animais estavam alojados em condições normais (temperatura de 23 ± 2 ° C, umidade gama 55 ± 10% e 12 h ciclos de claro/escuro) e tinham acesso ao mouse padrão chow e água ad libitum.
1. isolamento da Retina do rato
<ol><li>Coloque os instrumentos de dissecção na mesa de preparação e verificar se todos os instrumentos são completos para permitir uma rápida preparação.</li>
	<li>Sacrifica o mouse por inalação de CO2 .</li>
	<li>Decapitar o mouse com uma tesoura de aço, corte sagitally o crânio em duas metades, usando o mesmo par de tesouras e retire a pele e o cérebro usando tesouras de olho (Figura 1).</li>
	<li>Corte o osso do crânio para deixar somente o osso orbital usando tesouras de olho.</li>
	<li>Transferi a órbita em um prato de dissecação com gelada tampão Krebs-Henseleit.</li>
	<li>Mantenha o prato de dissecação no gelo ou altere o buffer de cada 10 min.</li>
	<li>Corte o osso orbital usando tesouras de olho e remova cuidadosamente o globo de olho, juntamente com o tecido orbital usando pinças de precisão 4 tipo e estudante Vannas para primavera (Figura 2).</li>
	<li>Remova cuidadosamente a glândula Harderian, tecido conjuntivo e os músculos extraoculares usando pinças de precisão 5 tipo e Vannas para Capsulotomia, tomando cuidado para não danificar o principal ramo da artéria oftálmica.</li>
	<li>Ligate orbitais ramos da artéria oftálmica e, eventualmente, a extremidade proximal do principal ramo da artéria oftálmica usando suturas de Nylon 10-0 (Figura 3).</li>
	<li>Transferi o globo de olho em uma placa de Petri contendo etanol a 70% para 10 s usando tipo 4 pinças de precisão. Coloque o prato de dissecação do globo do olho e substituir o buffer com solução de Krebs fresca. A córnea aparecerá esbranquiçada após exposição ao etanol.</li>
	<li>Perfurar a córnea periférica com uma agulha de 30 calibre e dissecar a córnea usando Vannas para Capsulotomia. Cortar o tecido da íris suavemente, coloque uma ponta afiada das Vannas para Capsulotomia entre a coroide e retina e cortou a coroide e a esclera. Deixe algum tecido scleral em torno do nervo óptico (Figura 4).</li>
</ol>2. montagem da Retina na câmara de perfusão
Nota: A câmara de perfusão utilizada para experimentos de arteríola retinal é feito em casa. Consiste em um reservatório transparente com um tubo dentro e vazão (Figura 5). Uma extremidade de um tubo de silicone está colada ao fundo da câmara com adesivo de histoacryl e a outra extremidade anexado a uma torneira de três vias. Conecte uma seringa com solução tampão de Krebs fresco para a torneira de três vias e preencher o tubo com buffer.
<ol><li>Leve uma micropipeta de vidro com um porta-agulha e empurre-a para a extremidade do tubo na parte inferior da câmara de perfusão. Então quebre a ponta da micropipeta com tesouras tipo 4 para obter uma gorjeta de 100 µm de diâmetro.</li>
	<li>Concentre-se na ponta da micropipeta a e eliminá-la através da seringa conectada ao tubo. Cuide-se que o capilar não é obstruído por detritos. Em caso de oclusão, removê-lo, lave o tubo e inserir mais uma micropipeta.</li>
	<li>Encha a câmara de perfusão com frio tampão Krebs e colocar a câmara sob um microscópio estéreo.</li>
	<li>Coloque uma plataforma de plástico transparente para a câmara de perfusão. Esta plataforma tem um recuo de 1,8 mm de largura para o nervo óptico e artéria oftálmica e é colocada em dois fios de aço de diâmetro de 1,6 mm. Em seguida, coloque um anel de aço inoxidável de diâmetro 2,8 mm e 4,0 mm diâmetro externo para a plataforma.</li>
	<li>Transferi a retina com o nervo óptico e artéria oftálmica anexada da câmara de dissecação na câmara de perfusão com extremo cuidado, usando uma colher. Este passo é importante para evitar a potencial alongamento dos tecidos, como pode ser prejudicial para o experimento.</li>
	<li>Cortar a parte suturada da extremidade proximal da artéria oftálmica, coloque duas alças pré-formadas de sutura de nylon 10-0 para a micropipeta e Canule a artéria oftálmica com a micropipeta. Amarrar a artéria para a micropipeta (Figura 6) e coloque a retina para a plataforma transparente usando pinças-multa-ponto.</li>
	<li>Delicadamente te abrir a capsula de lente anterior com duas pinças de ponta fina, retire a lente e cortar a capsula de lente inteira usando micro-tesouras.</li>
	<li>Posteriormente, fazer quatro incisões radiais na retina metade a distância entre a pars plana para o nervo óptico e coloque um anel de aço inoxidável na retina para corrigi-lo para o fundo. A retina está agora pronta para o experimento (Figura 7).</li>
</ol>3. preparação de arteríolas da retina para o experimento
<ol><li>Coloque a câmara de perfusão sob um microscópio de luz. O objetivo é uma lente de objetiva de imersão de água X 100.</li>
	<li>Conectar as duas tubulações para em - e out - flow para uma bomba pericíclica e circulam na câmara com tampão Krebs oxigenado com 95% O2 e carbonatadas com 5% CO2 a 37 ° C. Use uma taxa de fluxo entre 100 e 120 mL/min.</li>
	<li>Conecte o tubo de silicone, que é conectado com a micropipeta, um reservatório do silicone mangueira através de uma torneira de três vias. Em seguida, encher o reservatório com tampão Krebs para uma altura correspondente a 50 mm Hg, mas não abra a torneira de três vias ainda.</li>
	<li>Olhe através dos objectivos do microscópio e foco na superfície da retina. Busca de vasos sanguíneos ou células vermelhas do sangue. É possível que os vasos sanguíneos são completamente recolhidos, às vezes apenas que algumas células vermelhas do sangue são visíveis.</li>
	<li>Quando um vaso sanguíneo encontra-se, concentre-se nele e abra a torneira de três vias. O diâmetro do vaso deve aumentar imediatamente e os glóbulos vermelhos também mover centrifugamente, se for uma arteríola, ou centripetamente em caso de uma Vénula. As arteríolas são menores em diâmetro, em comparação com vênulas da mesma ordem.</li>
	<li>Uma vez que encontra-se um vaso sanguíneo com uma parede bem visível, pode ser empregado para experiências após um período de equilíbrio de 30 min (Figura 8). Durante o período de equilíbrio, as arteríolas desenvolvem apenas fraco tom intrínseco, resultando em menos de 10% de redução de diâmetro luminal.</li>
</ol>4. realizando o experimento
<ol><li>Teste a viabilidade dos navios com o tromboxano mimética 9,11-dideoxy-9, 11α-methanoepoxy prostaglandina F2α (U46619), adicionando-o para a solução de banho. Este agente contrai as arteríolas retina do rato por cerca de 50% do diâmetro de repouso em concentrações ≥ 10-6 M.</li>
	<li>Uma vez que o navio está confirmado viável, lave o agonista fora da banheira pela bomba de circulação e fornecer fresco tampão Krebs para o banho.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+ocular+blood+flow,+glaucoma,+and+diabetic+retinopathy.">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li><li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy.">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li><li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma.">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li><li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+:+smaller+vessels,+bigger+insight.">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells.">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li><li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux,+velocity,+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye.">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles.">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries.">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li><li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha(1)B+-adrenoceptor+subtype+mediates+adrenergic+vasoconstriction+in+mouse+retinal+arterioles+with+damaged+endothelium.">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li></ol>

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

A medição das respostas vasculares na retina do rato é um desafio devido ao pequeno tamanho de vasos da retina. Com a técnica apresentada, arteríolas retina são visualizadas por microscopia de luz transmitida. Isso é possível, porque a retina isolada é translúcida. A vantagem da técnica é a alta resolução óptica. A resolução espacial calculada é 11 px/µm. No entanto, a resolução real para este sistema óptico que utiliza a luz branca é entre 200 e 300 nm, que é explicado pelo limite de difração de Abbe. Desde o primeiro ramo de arteríolas retina do rato tem um diâmetro interno de 20 a 30 µm, variações do diâmetro de aproximadamente 1% são detectáveis com este sistema. Não há nenhuma necessidade de dispositivos técnicos adicionais ou corantes fluorescentes conforme relatado em outros estudos Visualizar pequenas arteríolas retina5,6,7. Uma desvantagem da técnica é o tempo de preparação longa, que é entre 90 a 120 min por investigadores treinados. Se o tempo de preparação excede 180 min, a função endotelial começa a ser atenuado.
Existem várias etapas críticas principais nesta técnica. Em primeiro lugar, é importante para ligate minuciosamente todos os ramos arteriais de retrobulbar. Se a ligadura é incompleta, arteríolas retina não irão ser pressurizadas devido ao escapamento. Em segundo lugar, a imersão em etanol por 10 s antes de abrir o globo de olho é importante para desactivar a reatividade do músculo liso da artéria oftálmica. Demonstramos anteriormente que imergindo por 10 s em 70% etanol desativa completamente a artéria oftálmica músculo liso8. Em contraste, arteríolas retina são susceptíveis de ser diretamente afetadas pelo etanol, já que eles estão protegidos pela parede bulbar. Se essa etapa for omitida, variações do diâmetro na artéria oftálmica podem influenciar a perfusão da retina. Digno de nota, a reatividade da artéria oftálmica marcadamente pode diferir do que arteríolas da retina em resposta ao mesmo agonista9,10. Em terceiro lugar, evite a torção da artéria oftálmica. Especialmente durante a preparação da retina para a plataforma de montagem, a artéria oftálmica pode tornar-se torcido, resultando em oclusão do lúmen. Além disso, verificar cuidadosamente que a ponta do vidro capilar não é obstruída para habilitar a pressurização das arteríolas da retina. Nós sugerimos para não executar mais de três curvas concentração-resposta consecutivos na mesma preparação da retina, porque observamos que respostas à acetilcolina tornou-se mais fracas quando repetindo as curvas concentração-resposta por mais de três vezes. No entanto, podem haver diferenças em relação a repetibilidade das curvas concentração-resposta dependendo o agente aplicado e, assim, devem ser testadas individualmente.
Nós aplicamos extraluminally agentes farmacológicos em nossos estudos, embora intraluminal perfusão usando uma bomba de controle de servo também é possível. Uma vez que a técnica permite medir local mecanismos de reatividade vascular na retina de animais de pequeno laboratório, incluindo camundongos e ratos, as vantagens da tecnologia de gene-alvo com o uso de animais geneticamente modificados podem ser acessadas com esse método .

Distúrbios na perfusão da retina têm sido implicados na patogênese de várias doenças oculares, como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e glaucoma1,2,3. Assim, estudos que visam medir a reatividade vascular na retina são importantes para compreender a fisiopatologia dessas doenças, e desenvolver novo tratamento se aproxima.
Devido à possibilidade de manipulação genética no genoma murino, o mouse tornou-se um modelo animal utilizado para estudos do sistema cardiovascular4. No entanto, por causa do pequeno tamanho dos vasos sanguíneos da retina (≤ 30 µm), medição de reatividade vascular na retina do rato é um desafio. Por exemplo, stereomicroscopic técnicas para a medição na vivo são limitadas em sua resolução óptica e, portanto, só permitem exatamente detectar alterações no fluxo de diâmetro ou sangue no sangue pequeno de menos de 30 µm de diâmetro ≤ quando equipado com dispositivos adicionais de sofisticados, tais como um microscópio confocal usando corantes fluorescentes ou a óptica adaptativa digitalização luz oftalmoscópio5,6. Além disso, a interpretação das medições na vivo vista identificar locais sinalização mecanismos nos vasos da retina podem ser confundidos por anestésicos, altera na pressão arterial sistêmica e a influência dos vasos sanguíneos de retrobulbar.
Portanto, nós desenvolvemos um método para medir respostas de rato dos vasos sanguíneos da retina com alta resolução óptica ex vivo. A técnica apresentada neste documento permite visualização das arteríolas retina através de transmitidas microscopia de luz. Esse método, que também pode ser usado em ratos, fornece acesso às vantagens do gene segmentação tecnologia na investigação vascular ocular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steel Scissors</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3576.1</td>
			<td>1x 140 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19390</td>
			<td>1x straight, 10.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH68.1</td>
			<td>2x type 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>2x type 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas capsulotomy scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>19760</td>
			<td>1x straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td>1x curved,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Needle Holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-17500</td>
			<td>1x curved, 120 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305128</td>
			<td>1x 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries (for producing micropipettes)</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-1211</td>
			<td>1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Suture</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>198001</td>
			<td>1x 10-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>1x 35 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td>1x 100 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discofix C</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16500C</td>
			<td>10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl adhesive</td>
			<td>B. Braun Surgical, S.A.</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyclic pump&#160; (CYCLO II)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>EP76.1</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Vanox-T AH-2)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera (TK-C1381)</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K928.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0965.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9,11-dideoxy-9&#945;,11&#945;-methanoepoxy prostaglandin F2&#945; (U-46619)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo

Insuficiência vascular e alterações na perfusão retiniana normal estão entre os fatores principais para a patogênese de várias doenças oculares visão em risco, tais como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e, possivelmente, glaucoma. Portanto, preparações microvasculares da retina são ferramentas cruciais para estudos fisiológicos e farmacológicos delinear os mecanismos fisiopatológicos subjacentes e a concepção terapias para as doenças. Apesar da ampla utilização de modelos de rato em pesquisa oftálmica, estudos sobre a reatividade vascular da retina são escassos nesta espécie. Das principais razões para esta discrepância é os desafiante procedimentos de isolamento devido ao tamanho pequeno destes vasos sanguíneos da retina, que é ~ ≤ 30 µm de diâmetro luminal. Para contornar o problema de isolamento direto destes microvessels da retina para estudos funcionais, estabelecemos uma técnica de isolamento e preparação que permite ex vivo estudos de vasoactivity da retina do rato sob condições fisiológicas perto . Embora as preparações experimentais presentes irão se referir especificamente as arteríolas retina do rato, esta metodologia prontamente pode ser empregada para microvessels de ratos.

U-46619 produziu respostas vasoconstritor dependente da concentração em arteríolas da retina de ratos do selvagem-tipo do fundo C57Bl/6J. Em uma concentração de 10-6 M, diminuição do diâmetro luminal foi ≈50% do diâmetro de descanso. Figura 9A mostra uma curva concentração-resposta representativa de uma arteríola retinal. Em arteríolas preconstricted com U46619, cumulativa administração de acetilcolina evocados dependente da concentração aumenta no diâmetro luminal para ≈25% do diâmetro preconstricted em 10-5 M, indicativo de um endotélio vascular intacta ( Figura 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig1.jpg"> Figura 1: dissecação do crânio rato. Pele sobre a cabeça decapitada do mouse é removida para expor os olhos e a cavidade orbital. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig2.jpg"> Figura 2: isolamento do tecido do globo e orbital do olho. O osso orbital foi cortado com uma tesoura de olho e o globo de olho, juntamente com os tecidos retrobulbar e nervo óptico foram cuidadosamente isoladas. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig3.jpg"> Figura 3: O Globo do olho e preparação da artéria oftálmica. Uma vez que os tecidos circunvizinhos orbitais foram dissecados com bem micro-tesouras, a artéria oftálmica foi cuidadosamente exposta e seus pequenos ramos ligados com suturas de monofilamento de nylon 10-0. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig4.jpg"> Figura 4: dissecção das estruturas oculares. Para visualizar a retina, a esclera e Úvea foram dissecados com Vannas para Capsulotomia. Alguns tecidos scleral em torno do nervo óptico foi abandonado para evitar danos da artéria oftálmica. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig5.jpg"> Figura 5: câmara de órgão para microscopia de vídeo em tempo real. A câmara foi feita em casa. Ela consistia de uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro com um tubo em e out flow. Os tubos foram colados com adesivo de histoacryl. Externamente oxigenado e carbonatada tampão Krebs-Henseleit foi divulgado por uma bomba peristáltica através destes tubos. Uma extremidade de um tubo de silicone foi colada ao fundo da câmara e a outra extremidade anexado a uma torneira de três vias. No final do tubo, foi inserida uma micropipeta de vidro com uma ponta de 100 µm, que serviu para a canulação da artéria oftálmica. Através do tubo de silicone, a circulação de Oftalmologia foi pressurizada através do preenchimento de um tubo de silicone com tampão Krebs para um nível correspondente a 50 mm Hg. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig6.jpg"> Figura 6: canulação da artéria oftálmica. A artéria oftálmica foi canulada com micropipeta de vidro e suturada com uma sutura de nylon 10-0. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig7.jpg"> Figura 7: canulação da artéria oftálmica. Depois de colocar a retina para a plataforma transparente, foi removida a lente com o saco capsular, quatro incisões radiais feitas na retina e um aço inoxidável de anel de 2,8 mm de diâmetro interno e 4,0 mm de diâmetro exterior foi colocado a retina para corrigi-lo para o b ottom. A retina então estava pronta para o experimento. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig8.jpg"> Figura 8: visualização de vasos da retina. Uma arteríola retinal exemplar com células vermelhas do sangue dentro.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig9.jpg"> Figura 9: estudos funcionais usando vídeo microscopia. Curvas de resposta de concentração representativo de uma única arteríola retinal. (A) curva concentração-resposta para o vasoconstritor, U46619 (10-9 a 10-6 M) e (B) para o endotélio-dependente vasodilatador, acetilcolina (10-8 a 10-5 M). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

preparation-steps-for-measurement-reactivity-mouse-retinal-arterioles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

7.1K visualizações.  University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz. Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex Infecção Vivo de tecido vivo com Vírus Oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Medicina

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an extended perfusion period is challenging. We have added the kidney to our previous ex vivo perfused liver experiment model to reproduce a more accurate physiological state for prolonged experiments without using live animals. Five intact livers and kidneys were retrieved post-mortem from sacrificed pigs on different days and perfused for a minimum of 6 hr. Hourly arterial blood gases were obtained to analyze pH, lactate, glucose and renal parameters. The primary endpoint was to investigate the effect of adding one kidney to the model on the acid base balance, glucose, and electrolyte levels. The result of this liver-kidney experiment was compared to the results of five previous liver only perfusion models. In summary, with the addition of one kidney to the ex vivo liver circuit, hyperglycemia and metabolic acidosis were improved. In addition this model reproduces the physiological and metabolic responses of the liver sufficiently accurately to obviate the need for the use of live animals. The ex vivo liver-kidney perfusion model can be used as an alternative method in organ specific studies. It provides a disconnection from numerous systemic influences and allows specific and accurate adjustments of arterial and venous pressures and flow.

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Study of the animal organ physiology can be achieved by performing an experimental ex vivo perfusion system. The addition of a porcine kidney, as a homeostatic organ to our previously developed ex vivo liver perfusion model can be a principal step to achieve a better physiological environment.

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

Mensuração ecocardiográfica dos parâmetros diastólicos do ventrículo direito no mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

Preparação de grânulos de Gushukang (GSK) para experimentos in vivo e in vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...