Ich danke Dr. Vincent Seutin für seine ständige Unterstützung, Telle Gillissen und Laurent Massotte für hervorragende technische Unterstützung, Drs Jean Defourny und Sandra Ormenese für Ratschläge mit dem konfokalen Mikroskop, Dr. Jacques Destiné für das Geschenk des zweiten Axopatch 200B-Verstärker, der GIGA-Imaging Plattform für für kritische Lesen des Manuskripts des konfokalen Mikroskop und Imaris Software und Dr. Stephen Freeman zu teilen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem belgischen FRS unterstützt - FNRS (U.N002.13 und T.N0015.13) und mit Unterstützung der belgischen Universitätsstiftung (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique) veröffentlicht.

Der Autor erklärt , dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll Dual somatodendritische Ganzzellableitungen und lokale dendritischen Aufnahmen zu implementieren. Es ist nützlich für den Einfluss von Ionenkanälen zu bestimmen (dh I h) auf dem zeitlichen Verlauf der postsynaptischen Potentiale und Abbilden der Verteilung des Ionenkanals (I h) entlang der somatodendritischen Domäne von nigralen DA - Neuronen, respectively. Die resultierenden elektrophysiologischen Messungen kombiniert werden, um hoc histochemistry Post Zellmorphologie zu erholen. Das Verfahren wurde eingesetzt DA Neuronen zu untersuchen, in der Substantia nigra, kann aber für benachbarte nigral GABA-Neuronen verallgemeinert werden, Bereich ventralen tegmental DA Neuronen oder andere midbrain Neuronen. Alle Schritte können auch gefolgt werden , um andere Ionenkanäle untersuchen in Dendriten von nigral Neuronen ohne wesentliche Änderungen zum Ausdruck gebracht. Post - Hoc - Visualisierung ist besonders relevant für Neuronen mit Axon-LagerDendriten, wie nigral Neuronen 25,26, Hippokampus - oriens-alveus Inter 21 oder einigen CA1 Pyramidenneuronen 67. Interessanterweise scheinen Neuronen diese Funktion teilen häufiger zu sein als allgemein 67 gedacht. Morphologische Analyse zeigt auch die genaue Lage der Elektroden und axon. Die Detektion des letzteren können im Axon Anfangssegment (spannungsabhängige Na + -Kanäle oder Ankyrin G) mittels Immunhistochemie 68,69 ausgedrückt durch die Markierung von Proteinen optimiert werden. Die Zuverlässigkeit der Daten mit dendritischen Aufnahmen und anschließender neuronalen Kennzeichnung gesammelt, hängt immer von der Scheibenqualität. Maximale Anstrengung muss daher angewandt werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen innerhalb des Gewebes zu erhalten. Dies wird mit schonenden Umgang mit gesunden Tieren, hochwertige Werkzeuge und Reagenzien, ausreichend Sauerstoffversorgung der Gewebe und eiskalten Temperaturen während der gesamten Herstellung von Scheiben erreicht. Stabile Aufzeichnungsbedingungen beruhen auf der Auswahl von gesunden Neuronen. In der whole-cell-Modus sollten Serienwiderstand anfänglich so niedrig wie möglich sein und gewartet werden während des gesamten Experiments konstant. Die Stabilität der Aufnahmen ist weiterhin abhängig von hochwertigen Manipulatoren ohne Drift und Vibrationen. Diese Störungen können durch die Optimierung der Pipette Stabilität reduziert werden: die Verbindung zum Pipettenhalter prüfen und zu heads, Controlling, dass Mikromanipulator Kabel sind schlaff, zu vermeiden plötzliche Änderungen der Temperatur oder Tischbewegung und die Überprüfung der Mechanismus des Manipulators. Für Doppelaufnahmen Methylsulfat- 13,15,21 wurde in der intrazellulären Lösung enthalten, aber Gluconat 9,14,25 können alternativ verwendet werden. Jedoch kann die Haupt Anion das Membranpotential 70,71 und einige spannungsabhängige Ströme 72 verändern. Intrazellulärer Lösung kann mit ATP, GTP und Phosphokreatin zur Erhaltung der Physiolo ergänzt werdengische Funktionen von Neuronen. Zusätzlich einen Fluoreszenzfarbstoff in der Pipettenlösung Zugabe (zB Alexa 594 oder Sulforhodamin 101 41) , um die Dendriten während einer somatischen Aufzeichnung zu visualisieren kann nützlich sein , zum Beispiel eine Druckanwendung zu platzieren (Abbildung 7 in Ref. 41) oder eine elektrische Stimulations Pipette. Die Pipettenlösung für Cell-Attached - Aufnahmen enthält einen hohen K + -Konzentration und keine Na + große I h zu erfassen. Bemerkenswert der Na + / K + Konzentrationsverhältnis beeinflusst die Stromamplitude 10, das Umkehrpotential des Stroms 11 und die Gating von I h 73. Alternativ kann ich h auch außerhalb Outs 10 aufgezeichnet werden. In dieser Aufzeichnungskonfiguration jedoch das intrazelluläre Milieu, in der Nähe der Kanäle gestört werden kann. Folglich Unterschiede in der spannungsabhängige Aktivierung von I &lt;sub&gt; h beobachtet wird beim Vergleich von Strömen mit Cell-Attached - Patches erhalten und außerhalb Outs 10. Anschwellen von Neuronen wird gelegentlich bei der Patch-Clamp - Aufzeichnung auftreten, und stellt sich oft aus verschiedenen Ursachen, wie die geringe Qualität des Wassers, starkes Ungleichgewicht in der Osmolarität oder pH - Wert zwischen dem intra- und extrazellulären Lösungen 39 oder Fehler in der Zusammensetzung der Lösungen. Die Qualität der elektrophysiologischen Ableitungen hat eine direkte Auswirkung auf die Qualität der Morphologie der verwerteten Neuronen. (- 10 MOhm, wie in Refs 6,11. 6) und für einzelne somatische Aufnahmen nach Cell-Attached - Aufnahmen 14 der Verdünnung des intrazellulären Milieu zu minimieren Hohe Beständigkeit somatischen Pipetten werden für Dual - Aufnahmen verwendet. Die Ganzzell-somatischen Aufzeichnung nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung wird deshalb kurz gehalten (&lt;10 min). Outside-out-Patches von sowohl der somatischen und dendritischen Pipetten sind für die ordnungsgemäße Schließen der cell Membran und die anschließende Erholung der Zellmorphologie. Zusätzlich zu der Struktur der Zelle kann der neurochemischen Inhalt für die aufgezeichneten Neuronen 59,74 bestimmt werden. So kann beispielsweise die intrazelluläre Protein - Tyrosin - Hydroxylase immunmarkierten zur eindeutigen Identifizierung von DA - Neuronen 13 werden. DA - Neuronen werden hauptsächlich in der SN pars compacta eingeengt, mit einer viel niedrigeren Dichte in der SN pars reticulata, wo sie sich mit einer höheren Anzahl von GABA - Neuronen 75 miteinander vermischt werden. Während die Zellkörper von DA-Neuronen ist oft größer als der GABA-Neuronen, ist die visuelle Identifizierung dieser Zellen mit IR-Videomikroskopie unsicher und teilweise durch die Opazität der pars compacta behindert. Um diese Einschränkungen, die Vorauswahl von DA - Neuronen umgehen kann durch die Verwendung von transgenen Mäusen , erleichtert werden , um einen Fluoreszenzmarker in einer bestimmten Population von Neuronen (TH 65 oder DAT für DA - Neuronen exprimiert, GADfür GABA-Neuronen) und Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung. Alternativ dazu kann ein Fluoreszenzfarbstoff in der Lösung der somatischen Elektrode eingeschlossen werden, um die Visualisierung von Dendriten zu erleichtern. Verbesserte Auflösung der Fluoreszenzzelle wird durch Nipkow Kreiselscheibenapplikators konfokalen 14,22,30 oder Zwei-Photonen - Mikroskopie 7 kombiniert , um IR-DGC 6 gebracht. Mehrere Vorteile werden DGC im Vergleich zu DIC bezogen. Zunächst wird , wie DIC Prismen nicht erforderlich sind, kann die IR-DGC Bildes mit einem Fluoreszenzbild 49,52,53,76 überlagert werden. Zweitens kann DGC mit Photostimulation kombiniert und Optogenetik 77. Ein Nachteil der Scheibe Vorbereitung ist die Erhaltung der Integrität von Neuronen. DA - Neuronen erweitern ihre Dendriten in den drei Raumebenen 78,79 und damit Verkürzung des dendritischen Fach nicht vollständig in den Scheiben 80 können vermieden werden. Die Wahl der Orientierung der Scheiben (coronal, horizontal oder parasagittal) ist ein Trade-off. Der Ursprung der Innervation und dem experimentellen Design muss berücksichtigt werden, um die richtige Ausrichtung der Scheiben zu wählen. Direkt dendritischen Patching ist die Technik verwendet, um die Verteilung der funktionellen Ionenkanäle in den verschiedenen Kompartimenten von Zellen abzubilden. Darüber hinaus bietet diese Technik die Variabilität in funktionellen Eigenschaften der Kanäle 20 zu bestimmen. Als Ergänzung kann die Position und Dichte von Ionenkanälen ermittelt werden mittels Immunhistochemie an den Licht- und Elektronenmikroskopie Ebenen 17,23. Dieser Ansatz bietet auch die Möglichkeit, die Kanaldichte in kleinkalibrigen Strukturen zu bestimmen, die Patch-Pipetten unzugänglich sind. Jedoch könnten diese Kanäle in einer bestimmten Funktionszustand 24 oder sogar inaktiv im Vergleich zu denen, Patch-Clamp - Techniken aufgenommen werden. Beide Techniken sind daher notwendig, um ein vollständiges Bild von der Lage zu erhalten und die Eigenschaften vonIonenkanäle in einem bestimmten zellularen Bereich 17. Mit der Entwicklung von spannungsempfindlichen Farbstoffen, Spannung Abbildungs verwendet wurde an mehreren Stellen 81 , um die Ausbreitung von APs und EPSPs in Neuronen zu untersuchen. Als Alternative zu Dual-Patch-Clamp-Aufnahmen, kann dieser Ansatz auch für dünne Dendriten implementiert werden, die auf Patch-Pipetten nicht zugänglich sind, aber eine genaue Kalibrierung des Signals und Mitteln erforderlich machen. Während DA-Neuronen im ventral tegmentalen SN und Bereich über somatische Aufnahmen im physiologischen und pathophysiologischen Kontext umfassend untersucht werden, bleibt die funktionellen Eigenschaften ihrer Dendriten in beiden Bedingungen weitgehend unbekannt. Patchen von Dendriten wurde für nigral Dopamin - Neuronen von mehreren Gruppen mit Erfolg 13,25,26 und bleibt die Methode der Wahl zu sezieren erregbar Eigenschaften dieser feinen subzellulärer Strukturen 8 umgesetzt. Dendritische Aufnahmen bieten eine weitere Mögschaft , die Effizienz und die Plastizität der synaptischen Übertragung und die Plastizität der dendritischen Erregbarkeit 82,83 zu prüfen.

Neurone erhalten synaptischen Informationen überwiegend auf ihre Dendriten. Erregenden und hemmenden synaptischen Signale von ihrer Website von Generation zur Integrationsstelle verbreiten, in dem Aktionspotentiale (APs) als Ausgangssignal hervorgerufen werden. Auf ihrem Weg werden synaptische Potentiale beeinflusst sowohl die Struktur der Dendriten und die Wechselwirkung zwischen passiven und aktiven Membraneigenschaften. Die Kombination dieser sehr variablen Parameter erweitert die Rechenleistung von Neuronen 1,2. Jedoch verhindert der geringe Durchmesser von Dendriten jedoch die Untersuchung ihrer elektrischen Eigenschaften. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der Patch-Clamp - Technik 3 ist die Optik 4 und Verbesserung von Verfahren zur Schicht Vorbereitung 5 in den letzten Jahrzehnten haben es ermöglicht , Aufnahmen aus sehr dünn (0,7-3 &amp; mgr; m Ø) Dendriten 6,7. Diese Verfahren wurden und werden immer noch verwendet weitgehend die Erregbarkeit von Dendriten in einer Vielzahl zu untersuchen of Neuronen 8. Direkt dendritischen Aufnahmen sind wesentlich die Verteilung 9-19 und Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften 20-22 von Ionenkanälen in verschiedenen neuronalen Abteilen zu bestimmen. Diese Daten sind die notwendige Ergänzung der Ionenkanalverteilungen mit Immunhistochemie nachgewiesen kombiniert , um Licht- und Elektronenmikroskopie 23,24. Dual - somatodendritische Aufnahmen wurden implementiert , um die Ausbreitung von Aktionspotentialen 9,13-15,21,22,25-27 und Verbreitung der synaptischen Potentiale 13,16,18 entlang der somatodendritische Domäne von Neuronen zu erforschen, erhalten detaillierte passive Kabelmodelle 28- 30 und die zeitliche Auflösung der neuronalen Integration 31 untersuchen. Die Substantia nigra (SN) ist eine Region, in der Mittelhirns in mehreren Funktionen beteiligt sich beispielsweise die Steuerung der Bewegung, die Codierung von Belohnung und gewohnheitsmäßige Verhalten. Die Abnahme von Dopamin aufgrund der spezifischenVerlust dopaminerger (DA) Neuronen in der SN mit den motorischen Störungen in Patienten , die an Parkinson-Krankheit leiden , beobachtet 32 verbunden. Die nigral Schaltung besteht aus zwei Hauptzelltypen: dopaminergen und GABA-erge Neuronen. Interessanterweise haben diese Neuronen mehrere spezifische Eigenschaften, die sie von anderen Neuronen unterscheiden. Das Axon eines großen Anteils von DA - Neuronen und einigen GABA - Neuronen stammt aus einer dendritischen Ort anzeigt , dass die dendritischen Dorn heterogen ist (Axon-Lager und Axon-fehlt Dendriten) 25,26,33. Die Morphologie dieser Neuronen im Gegensatz daher mit der typischen Organisation von Neuronen in dem die Informationsübertragung das Gesetz der dynamische Polarisation emittiert von Cajal folgt: ausgehend von Dendriten zu soma und schließlich 34 bis Axon. DA - Neuronen sind auch Aktivität zu lösen Dopamin aus ihren Dendriten 35, erzeugen Platzen bekannt 36 und NMDA-Rezeptor Plastizität 37. Die dissection dieser Phänomene ist schwer zu fassen, ohne direkte Aufnahmen von der Stelle, wo sie initiiert werden. Um Einblicke in die Beziehung zwischen den genauen Ort und funktionellen Eigenschaften von Ionenkanälen und ihre Rolle bei der dendritischen Erregbarkeit und Informationstransfer in nigral Neuronen, direkte dendritischen Aufnahmen sind die Methode der Wahl. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Verfahren , die verwendet werden können Single- und Dual - Patch-Clamp - Aufnahmen von Dendriten nigraler Neuronen und dem entsprechenden Post - hoc - biocytin Kennzeichnung zu erhalten. Die Grundprinzipien für das Patchen der somatischen und die dendritischen Membran sind sehr ähnlich. Praktisch jedoch Aufnahmen von dendritischen Sites erfordern eine gezielte Optimierung im Vergleich zu somatischen Aufnahmen. Erfolgreiche dendritischen Aufnahmen verlassen sich auf die Qualität der Scheiben, eine optimale Anpassung der Optik, sanfte Annäherung der Patch-Pipette und die Stabilität der Aufnahmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="137">
			<td height="137" style="height:138px;width:156px;">Double-distillated water</td>
			<td style="width:143px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Super Q</td>
			<td style="width:187px;">&#160;Resistivity &#62;14 M&#937; cm, ideal 18.2 M&#937; cm at 25&#176;C, filtered (0.22 &#181;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Microfilter candles</td>
			<td style="width:143px;">Robu</td>
			<td style="width:137px;">Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:156px;">Tissue slicer with vibroprobe</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:137px;">VT1200</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:143px;">Dosaka</td>
			<td style="width:137px;">DTK-1000</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 4, frequency 7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Razor blades</td>
			<td style="width:143px;">Gilette</td>
			<td style="width:137px;">Super Silver</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Reserve chamber</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">PP beckers</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">213-1725</td>
			<td style="width:187px;">400 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Merk Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Millex - GV 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:143px;">UHU</td>
			<td style="width:137px;">&#34;Sekunden Kleber&#34;</td>
			<td style="width:187px;">liquid glue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:137px;">Brown-Flaming P-97</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:137px;">1807524</td>
			<td style="width:187px;">2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dental wax</td>
			<td style="width:143px;">Colt&#232;ne/Whaledent</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">orthodontic tray wax strips</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Platinum grid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:137px;">MF-830</td>
			<td style="width:187px;">to fire-polish pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:156px;">Potassium methyl sulfate</td>
			<td style="width:143px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:137px;">215481</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:156px;">Biocytin</td>
			<td style="width:143px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:137px;">B1592</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:156px;">Manometer</td>
			<td style="width:143px;">GREISINGER electronic</td>
			<td style="width:137px;">GDH 13 AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:156px;">Microscope</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:156px;">Dodt Gradient Contrast</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Manipulators</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">LN Mini 25</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:156px;">Frame grabber</td>
			<td style="width:143px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:137px;">DFG/USB2pro</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Camera</td>
			<td style="width:143px;">DAGE-MTI</td>
			<td style="width:137px;">NC-70</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Condenser</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">high numerical aperture condenser working with oil</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Objective</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td>
			<td style="width:187px;">63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Fourfold-changer</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">between the camera and the microscope</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Black &#38; white video monitor</td>
			<td style="width:143px;">Sony</td>
			<td style="width:137px;">SSM-175CE</td>
			<td style="width:187px;">16-inch, 850 TV lines, analog</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">215-2409</td>
			<td style="width:187px;">to transfer slices from the setup to histology room</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">The Axon Guide</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Book</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Stimfit</td>
			<td style="width:143px;">https://github.com/neurodroid/stimfit</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:156px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">441244</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:156px;">Well cell culture plate</td>
			<td style="width:143px;">Greiner-Bio-One</td>
			<td style="width:137px;">662160</td>
			<td style="width:187px;">for the staining of fixed slices</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:143px;">Merk</td>
			<td style="width:137px;">108643</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">mouse anti-TH monoclonal primary</td>
			<td style="width:143px;">Immunostar</td>
			<td style="width:137px;">22941</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11031</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:143px;">Dako</td>
			<td style="width:137px;">X0907</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">ProLong Diamond Antifade</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">P36961</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Fluorescein Avidin DCS</td>
			<td style="width:143px;">Vector Lab</td>
			<td style="width:137px;">A-2011</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:156px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:137px;">FV1000</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:156px;">ImageJ</td>
			<td style="width:143px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:143px;">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">plugin for ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Imaris</td>
			<td style="width:143px;">http://www.bitplane.com</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Neuromantic</td>
			<td style="width:143px;">http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:156px;">WinWCP</td>
			<td style="width:143px;">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

Dendriten von dopaminergen Neuronen empfangen und vermitteln synaptischen Eingang, Unterstützung Aktionspotential Rückausbreitung und die Freisetzung von Neurotransmittern. Schuppen Licht in diesen Neuronen auf der Informationsübertragung wird diese grundlegenden Funktionen zu verstehen. Dendritische patch-clamp-Aufnahmen bieten die Möglichkeit, direkt auf die elektrischen Eigenschaften von Dendriten und das darunter liegende spannungsgesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen. Jedoch sind diese feinen Strukturen nicht leicht zugänglich Patch-Pipetten wegen ihres kleinen Durchmessers. Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Verfahren stabile und zuverlässige Aufzeichnungen von den Dendriten von dopaminergen Neuronen in akuten Scheiben zu sammeln. Elektrophysiologische Messungen werden mit Post - hoc - Erholung der Zellmorphologie kombiniert. Erfolgreiche Experimente stützen sich auf eine verbesserte Herstellung von Scheiben, Lösungen und Pipetten, adäquate Einstellung der Optik und Stabilität der Pipette in Kontakt mit der aufgezeichneten Struktur. Standard-Prinzipien somatic Patch-Clamp-Aufzeichnung werden an Dendriten angewendet, sondern mit einem sanfteren Ansatz der Pipette. Diese vielseitigen Techniken können verschiedene Fragen zu den erregbaren Eigenschaften von Dendriten zu adressieren umgesetzt werden.

Das oben beschriebene Protokoll beabsichtigt, die Sammlung von Daten unter Verwendung von dendritischen Patch-Clamp-Aufnahmen zu erleichtern. Diese Technik, kombiniert mit post hoc Histochemie hilft Einblicke in die Mechanismen vieler elektrischer Signale in Dendriten Ursprung oder Ausbreitung zu gewinnen. Direkter Zugriff auf Dendriten mit Patch-Pipetten ist schwierig, aber ein besonderes Augenmerk auf einige methodische Aspekte werden die Erfolgsrate der Aufnahmen zu verbessern. Ein Experimentator ausreichend stabilen somatischen Aufnahme erfahren können damit rechnen, auf die meisten Versuche mit hohem Widerstand (G &amp; Omega;) Dichtungen und vollständige Experimente zu erhalten. Ein bis zwei hochwertige dendritischen Aufnahmen können pro Präparation gesammelt werden. Die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Hirnschnitten mit gesundem somata und Dendriten ist eine Voraussetzung für den Zugriff auf diese feinen Strukturen (Abbildung 1). Die criteriein für diese Neuronen Auswahl sind eine glatte und homogene Oberfläche der ganzen Zelle und einer soma und Dendriten mit geringem Kontrast , wenn sie mit optimal angepasst Optik (1A und 1B) beobachtet. Auswählen von Neuronen zu stark im Allgemeinen führt zu instabilen Aufnahmen (1C und 1C) gegenübergestellt . Daher werden solche Neuronen vermieden werden sollte. Im Vergleich zu anderen Neuronen zeigen nigral DA Neuronen spezifischen morphologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften. Diese Funktionen , die normalerweise mit einem einzelnen somatischen Pipetten beurteilt kann auch in Doppel somatischen (Abbildung 2) und somatodendritischen Aufnahmen (Abbildung 3) beobachtet werden. Lange hyperpolarisierender Strominjektionen induzieren ein Membranpotential Rektifikation genannt &#39;sag&#39; (2B und 5D). Das Axon stammt, in den meisten Fällen auf einer dendritischen Website identifiziert alsVerwendung komplementärer Kriterien 13,25,26, was anzeigt , dass die dendritischen Kompartiment in diesen Neuronen heterogen ist (3A - 3B). Als Folge davon , wo das Fach der AP entspricht beobachtet wird zuerst dem Fach , in dem das Axon (3C - 3D) austritt 13,25,26. Das Axon wird von einem axonalen Bleb verursacht durch eine Schneid des Axons während des Schneidens 64, aber diese Struktur nicht systematisch erfasst im Allgemeinen beendet. Die ausgeprägte sag beobachtet in nigralen DA - Neuronen in Folge der Aktivierung von I h deutet auf eine hohe Expression von HCN - Untereinheiten. Um den Einfluss von I h auf die Integration von synaptischen Signale, synaptic artigen Strom (EPSC) Wellenformen bestimmen wurden über die dendritischen Aufzeichnungselektrode während somatodendritische Dual Aufnahmen 55 (&lt;erzeugt und injiziertstrong&gt; Abbildung 4). Die Kinetik dieser simulierten EPSCs wurden auf den Anstiegs- und Abfallzeitkonstanten des realen spontanen EPSCs basiert. Die sich ergebende aEPSP wurde mit dem somatischen Elektrode aufgezeichnet. Badanwendung der I h blocker ZD 7288 erhöht , um die Dauer der aEPSP, was darauf hinweist , den Beitrag von I h zu den Zeitverlauf der synaptischen Signale (4B). ZD 7288 beseitigt auch das Membranpotential Rektifikation bestätigt , dass die SAG ergibt sich aus der Aktivierung von I h (4C). Die Ergebnisse mit simulierten EPSPe erhalten könnte Experimente korreliert werden unter Verwendung von elektrisch evozierten EPSPe 65. Um die genaue Verteilung des Kanals in der somatodendritische Domäne von DA - Neuronen, Cell-Attached - Aufnahmen Karte implementiert wurden (Abbildung 5). Eine hochohmige Dichtung (&gt;&gt; 1 G &amp; Omega;) ist eine absolute Notwendigkeit für Cell-Attached - Aufnahmen (5B </strong&gt;). In Dendriten von DA - Neuronen aktiviert I h langsam mit langen hyperpolarisierender Spannungsschritten und der Strom im stationären Zustand wird nach Hunderten von ms (5C) erreicht, wie zuvor 66 gezeigt. Diese Beobachtung zeigt , dass HCN - Kanäle in Dendriten von DA - Neuronen haben unterschiedliche Untereinheiten im Vergleich zu denen in pyramidalen Neuronen oder andere Zelltypen exprimiert 10,16,66. Da die Verteilung des Kanals in dem dendritischen Kompartiment inhomogenen sein könnte und als das dendritische Kompartiment selbst heterogen ist, wird die Identität des Dendriten (Axon-Lager oder nonaxon tragenden Dendrit) ergab durch die IR-DGC Bild mit dem konfokalen Bild zu vergleichen nach Biocytin Färbung (3A und B). Wiederherstellung der Zellmorphologie ist daher notwendig, für beide Dual somatodendritische Aufnahmen und für Cell-Attached-Aufnahmen über nachfolgende somatischen Ganzzellableitungen. Abbildung 1. Soma und proximaler Dendriten nigraler dopaminerge Neurone Mit Infrarot - Videomikroskopie sichtbar machen . (A) IR-DGC Bild eines nigral DA Neuron die soma und proximalen Dendriten und beide somatischen und dendritischen Pipetten zeigt. Ein Dual-somatodendritische Aufzeichnung wurde erfolgreich auf diesem gesunden Neuronen durchgeführt. Beachten Sie die niedrigen Kontrast und die glatte Oberfläche der ganzen somatodendritische Domäne der Zelle. (B) Ein weiteres Beispiel für ein gesundes DA Neuron. (C) DA Neuron mit einer raueren und unebenen Oberfläche und einer stärkeren Kontrast. Während ein Doppelaufzeichnung erhalten wurde, war die Stabilität suboptimal und die Aufzeichnungsdauer war kurz (~ 15 min) durch eine allmähliche Zunahme des Zugangswiderstand an beiden Pipetten. (D) zweites Beispiel eines DA Neuron ein stark kontrastierte zeigt soma und proximalen Dendriten. In diesem Fall wurde eine starke Erhöhung der Zugangswiderstand beobachtet kurz nach der Pause in der whole-cell-Modus. Ein Versuch, den Zugangswiderstand durch Unterdruck zu verringern, war nicht erfolgreich. Neurone in Panel C und D können sich während der Schneideverfahren beschädigt wurden und sollte für Versuche vermieden werden. (E) Simultaneous Doppel somatischen Aufzeichnung in einem gesunden DA Neuron zu Beginn der Aufzeichnung. (F) Das gleiche Neuron , wie in Tafel E mit eine geschwollene Zellkörper nach 17 min ~. Notieren Sie sich die vollständige Abwesenheit von Kontrast, die kugelartige Erscheinung des Somas und die Anwesenheit des großen Kern , die nicht offensichtlich in gesunden Neuronen ist. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figur 2. </strong&gt; Simultane Doppel Somatic Aufnehmen von einem DA Neuron. (A) IR-DGC Bild während der Doppel somatischen Aufnahme von einem DA Neuron. (B) hyperpolarisierender und depolarisierende 1 s lang Strominjektionen (-160 bis 80 pA, erhöhen 80 pA) und entsprechenden Spannungsänderungen gleichzeitig mit beiden Patch-Pipetten aufgezeichnet. Beachten Sie das Vorhandensein des Durchhangs in der Spannungsverlauf mit dem langen hyperpolarisierender aktuellen Schritt und die große After-Hyperpolarisation nach dem AP während des depolarisierenden Stromimpuls. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Abbildung 3. Doppel - S omatodendritic Aufnahme in einem DA Neuron. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron. Der Abstand zwischen dem dendritischen und Somatic Pipette ist 29 &amp; mgr; m. (B) Konfokale Z-Projektionsbild des Neurons in Feld A mit Avidin an Fluoresceinisothiocyanat markiert konjugiert (FITC). Das Neuron wurde während der Aufnahme mit biocytin gefüllt. Das Axon stammt von einem proximalen Dendriten der Nähe des soma , wie durch den Pfeil angezeigt. (C) Simultaneous Dual somatodendritische Ganzzellspannung Aufnahme von dem Neuron in der Abdeckung A. AP im soma (schwarz Spannungsspuren) und Dendriten (rot Spannung aufgezeichnet in Reaktion Spuren) auf eine lange Strominjektions Schritt s 1 über die somatischen (links, schwarz Stromspur) und alternativ dendritischen Pipette (rechts, rot aktuelle Trace) (D) somatische und dendritischen AP in gedehnten Zeitskala angezeigt.. Mit entweder somatischen oder dendritische Strominjektion, die somatische AP (schwarz) voran die dendritische AP (rot). Die Verzögerung zwischen APs in diesem Neuron betrug 120 &amp; mgr; s und 210 &amp; mgr; s mit somatischen und dendritischen Stromeinspeisung sind. Verzögerungenwurden bei AP halb-maximale Amplitude während der Anstiegsphase des AP gemessen. Der AP wird zunächst der Nähe in der Kammer beobachtet , auf die das Axon auftaucht, bestätigt frühere Beobachtungen 25,26. In diesem Fall wird die dendritische Aufnahme von einer Axon-Dendrit fehlt gemacht. Ein Beispiel für eine Aufnahme von einem Axon-Lager Dendriten ist in Ref. 13 (in ihrer Abb. 1). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Ausbreitung von Artificial EPSPe Entlang der somatodendritische Achse des DA Neurone. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron. Der Abstand zwischen der dendritischen und somatische Pipette 45 um. Beide Patch - Pipetten sind in der gesamten Zellenstrom-Clamp - Aufnahmemodus. (B) Strommit der dendritischen Pipette in Current-Clamp aufgezeichnet und verwendet, um die künstliche EPSP (oben) zu erzeugen. (; Τ Zerfalls = 3 ms, Amplitude = 100 pA τ Anstieg = 0,6 ms) über die dendritischen Aufzeichnungspipette 55 wird der Strom durch die Injektion eines EPSC artigen Wellenform erhalten. Am unteren propagierte aEPSPs im SoMa in Kontrollbedingungen (schwarz) aufgezeichnet und nach dem Bad Anwendung des I h - Blocker ZD7288 (30 &amp; mgr; M; rote Kurve). Jede Spannungsverlauf ist der Mittelwert von 40 Einzel fegt. Beachten Sie die große Zunahme der EPSP Dauer in Gegenwart von ZD7288 anzeigt , den Beitrag von I h zu dem zeitlichen Verlauf der EPSPs. (C) Spannungs Spuren von Soma in Kontrollbedingungen aufgezeichnet (schwarz) und nach der Anwendung von 30 uM ZD 7288 ( rot) in Reaktion auf einen langen (30 pA; 1 s) Hyperpolarisieren aktuellen Schritt. Bemerke die Abwesenheit des Membranpotentials Rektifikation (SAG) nach der Blockierung des I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Abbildung 5. Das Vorhandensein von I h in Dendriten von DA Neuron. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron und Pipette auf proximalen Dendriten. (B) Kapazitive und Leckströme während einer 5 mV Spannungsbefehl in Cell-Attached - Konfiguration. Der Dichtungswiderstand betrug 5 GOhm in diesem Beispiel (C) hyperpolarisierender Spannungsstufe. (90 mV; oben) aus einem Membranpotential von 0 mV einen langsam aktivierenden I h induziert. Die aktuelle Spur wurde umgedreht und mit einer einzigen Exponentialfunktion ausgerüstet , der eine Zeitkonstante von τ = 632 ms zu geben. (D) SpannungAntworten der whole-cell aufgezeichnet soma (Panel A) bis 1 s hyper- und depolarisiert Stromimpulse (-160 bis 120 pA, 40 pA Inkrement). Die somatischen Ganzzell Aufnahme wurde nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung durchgeführt. Beachten Sie die Abwesenheit von APs durch die extrazelluläre Applikation von TTX und Cd 2+ spontane Zündung während Cell-Attached - Aufzeichnung zu unterdrücken. Diese spannungsgesteuerten Na + und Ca 2+ Strom - Blocker wurden hinzugefügt Aktionsströme zu unterdrücken. Platten A - D von gleichen Neurons (E) IR-DIC Bild eines anderen Neurons DA und einer dendritischen Pipette (F) spannungsabhängig von einem Testimpuls auf 0 mV von einem 50 ms Vorimpuls bei -120 mV aktiviert Ströme.. in einem Outside-out von dem proximalen Dendriten der Neuronen in der Platte E. Haltepotential -80 mV ausgeschnittenen Patch. Notieren Sie sich die zeitabhängige Inaktivierung des Stroms. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um ein</a> , <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern</a>Version dieser Figur. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7,305 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 1 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 310 mOsmol / L (optimale Reichweite: 314-325 mosmol / L), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Artificial Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5,084 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7,551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 7 mM </td><td> 7 ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Saccharose </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Saccharose-ACSF vorzubereiten Scheiben schneiden. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mM </td><td> 3,803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocytin </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 mit KOH eingestellt </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Intrazelluläre Lösung für Dual - Aufnahmen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 1 mM </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> 183,32 </td><td> 0,02 mM </td><td> 0,3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 290 mOsmol / l, eingestellt mit D-Glucose (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Elektroden Lösung für Cell-Attached - Aufnahmen.

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Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Serie: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

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