Die Autoren möchten sich Alexei Bogdanov für die Herstellung von Patch-Clamp-Chips an der CPFC und Hue Tran, Ping Zhao und Matthew Shiu für die Unterstützung bei der Montage zu bestätigen. Naweed Syed wurde von einem kanadischen Institute of Health Research (CIHR) Zuschuss unterstützt. Collin Luk ist der Empfänger von NSERC und Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) Stipendien.

1. Chipherstellung Der Prozess in 6 Ergebnisse in einer 3 um dicken freistehenden Film, einem niedrigen Widerstand 1 MOhm-Zugang und eine glattflächige trichterförmige Öffnung, die eine intime Dichtung mit der Zelle 9 erleichtert beschrieben, siehe Abbildung 2. Die Chips vereinzelt werden und verklebt Plexiglas Pakete mit der Öffnung in Richtung eines Lochs Verbinden des Chips mit einem unterirdischen Kanal. Das Kleben wird in einer Weise, die Shunt-Kapazität minimiert auf eine nominale 17 pF verzichtet. Pakete werden mit zwei 1,5 mm Durchmesser und 6 mm langen Glasröhrchen als fluidische Anschlüsse (Abbildung 3) ausgerüstet. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von einem fokussierten Ionenstrahl Abschnitt eines NRCC Patch-Clamp-Chip zeigt eine glatte Oberfläche und Siliziumdioxid Trichterform, die intimen Kontakte Zelle begünstigt, und eine flache Öffnung, dass nur einen geringen Zugang WiderstandsthermometerE. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Abbildung 3. Ein Chip wird am unteren Rand der Kultur Fläschchen in einem Plexiglas-Paket mit unterirdischen Fluidik und Glasröhren eingebaut geklebt. 2. Sterilisation, Grundieren und Prüfung Die folgenden Schritte sollten in einem Biologie Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um eine Verunreinigung oder Verstopfung der Öffnung zu vermeiden. <ul type="disc"><li> Sterilisieren Chips in einem basischen Harrick Plasma Reiniger (www.harrickplasma.com) mit einem 0,1 bis 0,3 mbar Restdruck für 15 Min. bei einer maximalen Leistung von 18 W. Andere Luftplasma können verwendet werden mit vergleichbaren Leistungsdichte (24 mW / cm 3) und wobei das Produkt der Leistungsdichte und die Zeitkonstante. Die Plasma-Behandlung macht auch die Chips hydrophil, was erleichtert die Grundierung. </li><li> Fit Glasröhren mit sterilem Silastic Laboratory Silikonschlauch, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96.115 bis 08), 3inch auf einer Seite, 1 cm auf der anderen Seite. </li><li> Füllen Sie Fluidik durch die Rohre mit sterilfiltriert Standard-Phosphatpuffer (PBS) darauf achten, keine Blase gefangen ist. </li><li> Befestigen Sie den langen Silikonschlauch, während unter Druck setzen des PBS von der kurzen Seite bei 1 atm. Ein Pool von PBS sickert durch die Öffnung sichtbar sein in der Ampulle. Stecken Sie den Druck liefert der PBS und nehmen Sie den kurzen Silikonschlauch von diesem Angebot. </li><li> Füllen Fläschchen mit gefilterter, PBS mit einer Spritze. </li><li> Tauchen eine Ag / Ag: Cl-Elektrode in der kurzen Röhre und eine Gegenelektrode in der Ampulle. Eine Impedanz-Meter wird verwendet, um zu bestätigen, dass der Zugang Widerstand ist zwischen 300kohm und 3Mohm und der Shunt-Kapazität liegt zwischen 10pF und 25pF. Ein Chip mit einem geringeren Widerstand ist wahrscheinlich ein Leck haben, und eine höhere Kapazität gilt als nicht für den Einsatz, da sie nicht erfassen kann, die schnellste Dynamik der Zelle Elektrophysiologie 6. Ein Chip mit einer geringeren Kapazitätoder höher wird als Widerstand angeschlossen, obwohl es könnte einfach sein, dass eine Blase in der Öffnung eingeschlossen ist. Einige Chips sind nach 1H erneut getestet und die richtige elektrochemische Impedanz haben. </li><li> Spülen Sie das Fluidik-Kanal mit sterilem, deionisiertem Wasser; leeren Sie den Top-Fläschchen und spülen Sie mit der gleichen, zweimal. </li><li> Tauchen Sie den verpackten Chip mit Röhren in frischem sterilem, deionisiertem Wasser für 30 Minuten laden Sie dann mit anderen Chips in einem sterilen Behälter mit sterilem, deionisiertem Wasser gefüllt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Späne hydrophilen und vor Verunreinigungen geschützt bleiben. </li></ul> 3. Chips Vorbereitung in der Zellbiologie-Labor Die folgenden Schritte in einem HEPA-Filter Laminarströmungshaube unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, müssen alle Lösungen in diesem Verfahren verwendet gefiltert vor der Anwendung mit Hilfe eines 0,22 &amp;mgr; m-Filter sterilisiert werden. <ul type="disc"><li> Öffnen Sie ein Chip-Container unter einem HEPA-Filter Laminarströmungshaube und entfernen Sie Späne von container dem Gesicht nach unten zu vermeiden Schöpfen möglich schwimmende Verunreinigungen in Top-Fläschchen. </li><li> Spülen Sie oben auf der Chip 2x Fläschchen mit frisch gefiltert sterilem, deionisiertem Wasser, um das restliche Schmutz von der Chip-Oberfläche zu entfernen. </li><li> Saugen Sie sterilem, deionisiertem Wasser aus der Spitze Fläschchen. </li><li> Ein Ende des Silasticschlauch an dem fluidischen Kanal auf einem unter Druck stehenden Spritze mit sterilfiltriert entionisiertem Wasser. In unserem System sind Spritzen mit Lösung gefüllt unter Druck durch Anschluss an einen Druckluftbehälter eingestellt 20psi. Um die Sterilität zu gewährleisten, wird die Luft filtriert (0,22 um Filter) vor dem Eintritt in die Spritze und unserem System hat auch einen Ein / Aus-Ventil, das uns zu stoppen oder Druck bei Bedarf ermöglicht. </li><li> Verwendung einer Klemme, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs. </li><li> Öffnen des Ein / Aus-Ventile, um die Lösung unter Druck zu setzen. </li><li> Um die subterranen fluidischen des Chips mit frischem sterilem, deionisiertem Wasser gespült, Ausspannen das Ausgangsende des Schlauchs. </li><li> Umce das Wasser durch die Öffnung, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs mit einer Klemme. </li><li> Um Wasserableitung zu vermeiden, klemmen Sie die Input-und Output Enden der Schläuche mit einem Hämostaten und schließen Sie den Ein / Aus-Ventile. </li><li> Trennen Sie die Eingabe Ende des Schlauches aus der Spritze. </li><li> Legen Sie Glasstopfen in beide Enden des Schlauches und entfernen Sie die Hämostaten. </li><li> Füllen Sie oben Fläschchen mit Filter steriled deionisiertem Wasser. </li><li> Setzen Sie den Deckel eines 35 mm sterile Schale in die Basis eines 100 mm sterile Schale </li><li> Ort Chip auf der Oberseite des Deckels 35 mm und Deckel mit 100 mm-Schale Deckel. </li><li> Bild-Chips, um sicherzustellen, dass die Membran und die Blende der Chips frei von Schmutz und / oder Luftblasen sind. In unserem Labor haben wir eine aufrechte Mikroskop und ein 20x-Objektiv mit großem Arbeitsabstand zu verwenden. </li><li> Wenn Schutt und / oder Luftblasen vorhanden sind, wiederholt spülen Fluidikkanal und Top-Fläschchen. Wenn die Ablagerungen und / oder Luftblasen nicht entfernt werden kann der Chip wird verworfen. </li><li> Sobald die Chips sindabgebildet werden, um Laminarströmungshaube zurück und ziehen Sie beide Enden des Schlauchs. </li><li> Ein Ende des Schlauchs an einem unter Druck stehenden Spritze mit physiologischen Medien. </li><li> Klemme die Ausgabe Ende des Schlauchs mit einer Klemme </li><li> Druckventil öffnen, entfernen Sie die Gefäßklemme vom Ausgang Ende der Fluidik und spülen Sie die Fluidik-Kanal mit physiologischen Medien </li><li> Um die unterirdische fluidischen mit physiologischen Medien Spülen der Ein / Aus-Ventile zu öffnen und die Gefäßklemme aus dem Ausgangsende des Schlauchs. </li><li> Um die physiologischen Medien zwingen aufwärts durch die Öffnung, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs mit einer Klemme. </li><li> Klemme Eingangsende des Schlauchs mit einer Klemme zu schließen und die Ein / Aus-Ventile. </li><li> Entfernen Sie die Eingabe Ende des Schlauches aus der Spritze und stecken Sie beide Enden des Schlauches mit Glas-Stopfen. </li><li> Entfernen Sie die Hämostaten. </li><li> Entfernen Sie das Wasser von oben Fläschchen. </li><li> Füllen Sie die Top-Fläschchen mit Filter sterilisiert physiologischen Medien. </li><li>Platzieren Sie den Chip wieder in die 100 mm Petrischale. </li><li> Legen Sie die Basis einer 35 mm-Schale in die 100 mm-Schale und füllen Sie ihn mit Filter sterilisiert deionisiertem Wasser auf Feuchtigkeit anzureichern. </li><li> Decken Sie die Schüssel, bis es Zeit für die Beschichtung ist </li></ul> 4. Zellaussaatdichten der Schnecke Neuronen Die Patch-Clamp-Chips geeignet sein können für eine Vielzahl von Zubereitungen. Derzeit testen wir unsere Chips mit Säugetieren primären kortikalen Neuronen und erhalten haben, vorläufige Ergebnisse mit Zellen für 14 Tage 7, was bedeutet, dass unsere Sterilisationsprotokoll angemessen ist und zeigt an, dass die Chips sind nicht im langfristigen Kulturen zytotoxischen kultiviert. Für die Zwecke dieses Protokolls wurden Schnecke Neuronen gewählt, weil sie eine einfache, aber gut etabliertes Modell zur neuronalen Elektrophysiologie 11 zu studieren, zu vertreten und es ist mit diesen Zellen, dass wir die wichtigsten Ergebnisse bisher 10 erhalten. Detaillierte Zelle Isolierung und Kultivierung Verfahren habenbeschrieben zuvor 12, 13. <ul type="disc"><li> Entfernen Sie die äußere Schale von 2 bis 3 Monate alt Lymnaea stagnalis mit stumpfen Pinzette und Anesthetize Tiere in Lymnaea Kochsalzlösung, die 10% Listerine. Alle nachfolgenden Schritte durchgeführt aseptisch in einer Haube mit laminarer Strömung mit sterilisiertem Dissektion und-lösungen bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen physiologischen Medien in den Fluidik mit dem entsprechenden Recording-Lösung mit einer Eppendorf-Pipette. Im Falle von Neuronen Lymnaea die Lösung (in mM): 50 KCl, 5 MgCl 2, 5 Ethylenbis (oxyethylennitrilo) tetraessigsäure (EGTA) und 5 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES; pH 7,4 , 130 mOsm) 14 </li><li> Stecken Sie die Schnecken in eine Schüssel mit Sylgard Lymnaea Kochsalzlösung gefüllt und entfernen gesamte Gehirn wie zuvor 13 beschrieben </li><li> Behandeln Sie das Isolated Gehirn in definierten Medien (DM) mit Trypsin-Enzym (0,2% Lösung, Sigma, Katalog-Nr T-9201) für 18 Minuten durch Behandlung in DM und Trypsin-Inhibitor (Sigma, Sojabohne, Katalog-Nr T-9003) für 15 Minuten. </li><li> Stecken Sie die Köpfe in eine kleine Schüssel mit Sylgard hohe Osmolarität definierten Medien gefüllt (HODM - DM mit Glucose zugegeben, 750 &amp;mgr; l 1 M Glucose-Lösung zu 20 ml DM). </li><li> Mit einer feinen Pinzette und Schere Dissektion, entfernen Sie die äußere und die innere Hülle der Ganglien des Interesses, das Aussetzen der Neuronen. </li><li> Mit Hilfe eines feuerpolierte Glaspipette mit HODM gefüllt und an einer Mikrospritze gelten sanfte Saugwirkung in der Nähe der Zelle von Interesse (linkes Pedal dorsalen 1), bis das Neuron löst aus dem Gehirn und wird in der Pipette suspendiert. </li><li> Die Glaspipette wird dann bewegt, und tauchte in einzelne Neurochips wo sanfte Vertreibung aus der Mikroliterspritze ermöglicht die Neuronen zu sanft geschoben werden aus der Pipette und auf der Oberseite der einzelnen Patch-Löcher auf den Chips.</li><li> Willkommen Zellen zu sitzen für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur ungestört ihre Befestigung an dem Chip die Öffnung umgebenden Fläche zu präsentieren. </li></ul> 5. Elektrophysiologischen Ableitungen Um die Chips an den Verstärker anschließen (in unserem Fall ein Multiclamp 700B Verstärker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) <ul type="disc"><li> Ersetzen Sie die Lösung in der unterirdischen fluidischen und in der Chip-Fläschchen mit den entsprechenden Recording-Lösungen. Bei Lymnaea Neuronen, die oberen Kulturkammern mit Lymnaea Kochsalzlösung gefüllt (in mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl 2, MgCl 2 und 1,5), gepuffert auf pH 7,9 mit HEPES 14. </li><li> Für Stabilität, Leim der Chip auf einen Objektträger und legen Sie sie unter dem Mikroskop. </li><li> Um den Chip an den Verstärker (in unserem Fall ein Multiclamp 700B Verstärker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) verbinden, schneiden Sie das eine Ende des Schlauchs und legen Sie eine Silver Draht ist mit dem Kopf-Stufe verbunden ist. </li><li> Legen Sie die Referenz-Elektrode in der oberen Ampulle des Chips. </li><li> Der Chip ist nun bereit für die Aufnahme. </li><li> Tragen Sie eine 5 mV Schritt mit dem Verstärker zu messen Gesamtwiderstand (R t) und bestimmen Sie die Konfiguration der Neuronen: Cell-Attached-(R t&gt; 1 G), Whole-Cell-(Rt = 50-100 MOhm sowie kapazitive Transienten, indikative der Blasensprung über der Öffnung); oder ohne Dichtung (R t &lt;5 MW). In der letzten Reihe von Experimenten 10, 58% Prozent der Zellen mit hohem Widerstand Dichtungen hatte und von denen, zeigten 80% der Zellen erregbaren Reaktionen. </li></ul> 6. Repräsentative Ergebnisse <ul type="disc"><li> Anwenden depolarisierende Stromimpulse (20 pA TZ) mit dem Neuron (in diesem Fall LPeD1). </li><li> Halten Sie das Neuron bei Vm Nähe seiner Ruhepotential (~ - 60 mV). </li><li> Beachten Sie die Antworten auf diese depolarisierenden Pulsen. Überschwingen Aktionspotentiale solltebeobachtet werden, wenn das Neuron ist lebensfähig werden. </li><li> 4 zeigt ein repräsentatives Ergebnis die im Detail in 14, 15 wird diskutiert. </li></ul><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> Abbildung 4. Spannungsantworten (oben) von einem Neuron zum LPeD1 abgestufte Reihe von intrazellulären Stromimpulse (unten). 60mV - Die Stromimpulse wurden bei Vm = angewendet. Fehlerbehebung <ul type="disc"><li> Vor der Beschichtung, um festzustellen, ob Bild-Chips Membran und Blende frei von Schmutz und geeignet für die Beschichtung sind. Wir verwenden ein aufrechtes Mikroskop und ein 20x-Objektiv mit großem Arbeitsabstand. In unserer letzten Versuchsreihe 1 wurden 67% Prozent der Chips erfolgreich in dieser Weise grundiert. </li><li> Wenn Schutt und / oder Luftblasen sind zu verwerfen Chip und versuchen Sie einen anderen. </li><li> Verschiedene Oberflächenbehandlungen (Plasma) oder Beschichtungen (PDL, PEI usw.) können ausprobiert werden, aber Erfolg kann stark abhängig von Zelltypverwendet. </li><li> Die Zusammensetzung des fluidischen (&quot;Pipette&quot;)-Lösung in kritisch für die Bildung der Giga-Dichtung und die ganze Zellen. Passen Lösung unter Beachtung Osmolarität, pH-Wert und ionischen Make-up. </li><li> Für längerfristige Kultur, mit den Medien in mikrofluidischen Kanal beginnen, wechseln Sie dann in Lösung vor Pipette zur Aufnahme über sanfte Schwerkraft-Perfusion (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

NKR Patch-Clamp-Chip Verhör-Plattform ist ein potenziell mächtiges Werkzeug für hohen Informationsgehalt Pharma-Assays und in vitro-Modelle von Krankheiten zu untersuchen. Seine Vorteile im Vergleich zu Glas-Pipetten sind eine niedrige Zugriffszeit Widerstand, was ein Vorteil für große Zellen zu untersuchen ist, und trotz einer etwas größeren Kapazität wird in vergleichbarer Dynamik für kleinere Zellen führen. Spontane Zelle Öffnung Dichtungen wurden routinemäßig erhalten, und Ganzzell-Eintrag wurde beobachtet, dass spontane 14 sein. Ein deutlicher Unterschied zwischen den Chips und der Glaspipette Verfahren ist die Tatsache, dass die Sonde ein Teil der Zellkulturschale ist und nicht manuell in Kontakt mit der Zellmembran gebracht. Kultivierung von Zellen, möglicherweise Teil der funktionalen Netzwerke, führt zu mehr biologisch relevanten Modelle als Krankheitsmodelle, und ein anderer Mechanismus zur Sicherung von Hochgeschwindigkeits-Zelle zu untersuchen Dichtungen 16. Jedoch, im Gegensatz zu Zellsuspensionen, Aspiration Cannot verwendet, um eine Zelle an der Sonde zu positionieren. Schnecke Neuronen, wie andere große Zellen, zugänglich sind, um manuelle Positionierung auf der Sonde. Für kleinere Zellen erfordern längere Kultivierungszeiten, haben wir die Notwendigkeit für Manipulationen vermieden und halten eine hohe Wahrscheinlichkeit, eine Dichtung durch Strukturieren Haftung Polypeptide auf der Sonden an Zellen auf der Sonden zu platzieren, und demonstriert die Positionierung von Zellen auf der Sonde 17,18. NKR ist auch die Entwicklung einer Polyimid-Mikrofluidik-Patch-Clamp-Chip 19 mit einer Kapazität vergleichbar mit der Glaspipette. Das ultimative Ziel dieses Projekts ist ein Multiple-Sonden Patch-Clamp-Chip, der die gleichzeitige Überwachung der elektrophysiologischen Aktivität mehrerer Neuronen im Verhalten des Netzwerks bei der Auflösung einzelner Ionenkanäle 14 in Eingriff. Erlaubt Dieses Verfahren ist ein hoher Auflösung komplementäre Methode zur Multi-Elektroden-Arrays 20.

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

Aufgrund seiner exquisiten Sensibilität und die Fähigkeit zur Überwachung und Steuerung von einzelnen Zellen auf der Ebene der Ionenkanäle, ist Patch-Klemmung der Goldstandard der Elektrophysiologie angewendet, um Krankheitsmodelle und Pharma-Bildschirme gleichermaßen ein. Verfahren beinhaltet üblicherweise leicht Kontaktieren einer Zelle mit einer Glaspipette von einer physiologischen Lösung gefüllt, um einen Patch der Membran unter der Spitze 2 zu isolieren. Eine Elektrode in der Pipette eingeführt erfasst Ionenkanal-Aktivität in der Membranscheibe oder, wenn gebrochen, für die gesamte Zelle. Im letzten Jahrzehnt, Patch-Clamp-Chips wurden als Alternative 3, 4 vorgeschlagen worden: ein aufgehängtes Film trennt die physiologischen Milieu aus dem Kulturmedium, und einer Öffnung in der Folie mikrofabrizierten ersetzt die Spitze der Pipette. Patch-Clamp-Chips haben in automatisierten Systemen integriert und auf den Markt für High-Throughput-Screening-5. Um incrzu erleichtern Durchsatz, umfassen sie die fluidischen Abgabe von Zellen aus der Suspension, deren Anordnung auf der Öffnung durch Absaugen und automatischen Routinen Zelle-zu-Probe-Dichtungen erfassen und in einen ganzen Zellen-Modus. Wir haben uns auf die Herstellung eines Silizium-Patch-Clamp-Chip mit optimierter Impedanz und Form der Öffnung, die die hochwertige Aufzeichnung von Aktionspotentialen in kultivierten Neuronen Schnecke 6 ermöglicht berichtet, vor kurzem haben wir auch Fortschritte bei der Vernehmung von Säugetieren Neuronen 7 berichtet. Unsere Patch-Clamp-Chips mit der kanadischen Photonics Fabrication Centre 8, ein kommerzielles Gießerei hergestellt, und in großen Serien erhältlich. Wir sind gespannt, in Zusammenarbeit mit Elektrophysiologen, um die Nutzung des NKR-Technologie in verschiedenen Modellen zu validieren zu engagieren. Die Chips nach dem allgemeinen Schema in 1 dargestellt werden: der Silizium-Chip ist an der Unterseite eines Plexiglas Kultur überführt und die Rückseite der Öffnung zu einem unterirdischen chann verbundenel mit Röhren an jedem Ende des Pakets angebracht. Die Zellen werden in dem Fläschchen kultiviert und die Zelle am Anfang der Sonde durch eine Messelektrode im channel.The beiden äußeren fluidischen Schnittstellen ermöglichen Lösung Austausch mit minimaler Störung der Zelle eingefügt überwacht, das ist ein Vorteil gegenüber Glaspipetten für intrazelluläre Perfusion. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> Abbildung 1. Prinzip der Messung mit dem NKR Patch-Clamp-Chip Wir beschreiben hier, die Protokolle zu sterilisieren und zu grundieren die Chips, laden Sie sie mit mittel-, Platten sie mit Zellen, und schließlich nutzen sie für elektrophysiologische Ableitungen.

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Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Wir zeigen, wie planaren Patch-Clamp-Chips an der National Research Council von Kanada werden sterilisiert, grundiert, mit Medium geladen, mit Zellen ausplattiert, hergestellt und verwendet für elektrophysiologische Ableitungen.

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.6K Aufrufe.  National Research Council of Canada. Wir zeigen, wie planaren Patch-Clamp-Chips an der National Research Council von Kanada werden sterilisiert, grundiert, mit Medium geladen, mit Zellen ausplattiert, hergestellt und verwendet für elektrophysiologische Ableitungen.

Serie: Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.