共焦点顕微鏡はから、米国国立科学財団 (NSF)、補助金 #DBI 0722569 資金で購入しました。研究によって、米国国家機関の健康/国立医学研究所の一般的な (NIH/日の出) グラント #GM085290 および米国国防総省 (DOD) グラント #W81XWH-16-1-0466 r. m. ブリュー スターに授与を受けました。E. バイタルは UMBC に前の大学と学部科学教育プログラムを通じてハワード ヒューズ医学研究所からの助成金によって支えられた、#52008090 を付与します。S. p. ブラウンは奨学金教育 GAANN によって米国部のサポートされていた、メイヤーホフ大学院フェローシップ NIH/日の出の補助金によって資金を供給 #GM055036、および資金によって、米国の国防総省グラント #W81XWH-16-1-0466 研究させて。

<ol>
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現在多くの方法がありますゼブラフィッシュ胚における MT 動態をイメージングしてタグ付き分子ライブ イメージングからの反応に至るまで固定組織11,12,13,14。単一のセルに MTs は、動的または安定した状態で存在できますが、上皮化は、MTs は徐々 に時間をかけて安定化プロセスです。安定性と動的な MTs のマーカーを使用してこの現象を可視化する方法を提供しています。ここで紹介した方法では 3次元イメージング ソフトウェアの機能を活用して、動的からゼブラフィッシュ胚組織の断面の安定した MT の集団への移行を定量化します。プロトコル 2メソッドを使用して、新生 MTs の明瞭な人口をラベルし、核生成と成長の残業代に従ってください。
MTs が外界にその傾向のため、自然な状態でイメージし悪名高くにくいです。したがって、このメソッドの重要なコンポーネントは、MTs の全体胚全体の急速な固定です。これは、MTs が安定し、胚の浸透性を増加するバッファーを使用して生理的温度で固定を開始によって達成されます。固定時間も過固定は、抗原、抗体の結合と干渉することを隠すことができる間、縮小固定が MTs の逮捕に失敗すると重要です。3-4 時間の推奨固定時間は、半ば原腸陥入で、最大 24 時間後受精胚で動作します。時間スケールの若い終わりに向かって胚修正されますの近い 3 h より古い胚は全体 4 h を必要があります。適切な固定とも切片と反応する必要があります修正から 1 週間以内に発生するので、MTs は時間と外界が。
組織が正しく修正、一度反応を問題が発生することができます。セクションが多すぎますに孵化するで、同じの場合に発生した最も一般的な問題は特に、組織の中心を通って不溶をされています。胚の透過を改善するために洗剤の増加と共に第一次および二次抗体を一次抗体と潜伏期間の濃度を増加させる反応の問題のほとんどを改善します。抗体の分類が固定問題や反応の問題のため失敗した場合、抗体の分類のパターンを調べることによって、原因を特定することが可能です。貧しい固定が膜で強烈なラベリングの結果および細胞質にラベリングを拡散、とき過固定が弱いラベリングする MT アーキテクチャを保持されます。ただし、抗体、不溶と、ラベルなしで、組織の中心エリアとして表示されます。
有意義な方法で MT の画像を分析する能力、高品質の画像に依存します。3 D で MT 長さをキャプチャするには、目的と開口可能な最小の Z ステップ サイズを使用してください。ここで示されている画像は次の生産数値の 1.4 の絞りと油エマーション目的 X 63 で捕獲された: ピクセル = 240 nm、Z ステップ Z スタック サイズ 0.1 μ m の = = 16.252 μ m。シングル MT の幅が 25 nm、約 10 倍以下に顕微鏡、このメトリックの分解能の限界を正確にすることはできませんを用いてこの手法。代わりに、すべての 3 次元で達成可能な最小ピクセル サイズ以上のみの MT 長さを測定できます。行またはフレーム平均 MT 信号定義を強化できます。MT 解析は、高品質のセクションの予約する必要があります。貧しい固定組織をイメージし、分析できない、穏やかな overfixation 慎重にレーザー強度の増加によって相殺することができます、良好なダイナミック レンジを維持しながら弱い信号を検出するを得る。貧しい抗体浸透中最善ではない薄いセクション (5-10 μ m) をイメージングの結果、適切な標識が地域に画像取得を制限することによって修正できます。高いバック グラウンド表示からフィルターの設定を調整することによって補正できます。ただし、これらの調整のいずれかが行われている場合は、ことを確認する必要は Z スタックの各平面上許容できるフィルターのしきい値。
3次元画像解析ソフトでは、MT 長さ、面積、角度、豊富と固定ティッシュ セクションの 3次元空間内の他の基準を定量化する実験者をことができます。ここで説明した方法は、市販のソフトウェアを用いてデータを取得するための方法を説明します。ただし、フィルタ リング モジュールは、関連するプラグインやマクロ、分析のすべてで利用可能と強化されたパブリック ドメイン ソフトウェアに適応させること。分析の前に raw 画像はどちらられる数量化の背景と非特異的シグナルを含むを避けるためにする必要があります。分析を完了すると、実行可能なスプレッドシートにデータを転送、データ セットから多くの推論が可能です。ここで行われる計算の 1 つだった合計 MTs に β-チューブリン縞、または安定した MTs の比率ごとの Glu チューブリン縞 1 が全体の MT 骨格が投資収益率で安定したを表します実験者希望彼らの定量的データを補完する洗練されたタグ付きイメージ ファイルの形式 (TIFF) を生成する場合スケール バー画像が 3次元画像解析ソフトで楽。
このアッセイでは、MT アセンブリ、 in vivoに関与するタンパク質の機能解析をことができます。反応を連続切片を交互に実行する場合は、同じ胚における動的かつ安定的な MTs を勉強するこのプロトコルを使用する可能性があります。今後、増加洗剤または変更された埋め込み角度などの変更は、古い胚のためのこれらのメソッドの使用と解剖学的質問の広い範囲が許可されます。

微小管 (MTs) は、ポリマーの α- および β-チューブリン線形原繊維、いくつかを組み合わせて、中空の管1,2を形成にまとめることです。MTs は、終了プラス成長著しい中心体または他の微小管重合のセンター (脂質)3で固定終了マイナス成長が遅いとの偏波構造です。De novoMT 形成は (γ-テュルク) に複雑な γ-チューブリン環核 MT アセンブリ4のテンプレートを提供するによって開始されます。任意の指定されたセルに MTs の二集団区別できるそのターン以上異なるレートで。動的 MTs は、成長の段階と動的不安定5として知られているプロセスの収縮の間の切り替えによって、細胞環境を探る。動的 MTs とは異なり安定した MTs 非成長しているし、動的 MTs6より長い半減期があります。

細胞生物学の研究の十年は MT の構造と機能を研究するためのツールの高度な配列を提供、これらの細胞骨格要素に関する知識の大きいボディの結果します。例えば、MTs は確立と維持だけでなく安定動的 MTs7,対の差動細胞内分布にも、本質的な極性に起因する細胞極性の中心的な役割を再生8. 対照的に、まで以下について理解される MT アーキテクチャと脊椎動物の胚などのより複雑な三次元 (3 D) 環境で機能の一部高解像度で MT 骨格のイメージングへの挑戦のため。この制限にもかかわらず gfp 発現するトランスジェニックの最近の生成は行ラベル MTs または MT マーカーの蛍光タグの一過性の発現は、MTs を受けるダイナミックな変化と自分の携帯電話の私達の理解を増加しているとゼブラフィッシュ胚の発達の役割。どちらかは、ラベル付きの9またはチューブリンのポリマーは、直接 MT 関連タンパク質を使用してを分類しているが直接のチューブリンの形質転換線で視覚化される MT ネットワーク全体 Doublecortin ようなキナーゼ (Dclk) または Ensconsin (EMTB)10、 11。他の線 (および構造体) 生成されている MT プラス終了の具体的分類によって MT 本質的な極性の評価を有効にするまたは終了11,12,13,マイナス中心体固定14です。 これらのツールの力を成長の有機体ライブ、MT のダイナミクスを学習する能力であります。このような研究は明らかに、たとえば、特定の細胞集団に MTs の空間と動的配布、形態形成 (細胞分裂面のインジケーター) を受けている組織で細胞分裂の方向のスピンドルは、MT ポリマーの極性細胞の伸長など、移行プロセスに関連と MT 成長率彗星速度9,13,15によって決まります。これらのツールの制限は、彼らが容易に安定性と動的 MT 集団間に行いません。 ことです。

豊富な細胞生物学文献からの描画、反応メソッド ゼブラフィッシュ胚における安定性と動的な MTs のイメージを説明ここでは、形質転換線の使用を補完するものであります。ゼブラフィッシュのような反応方法の普及はやや固定プロシージャ中に MT の整合性を維持する難しさによって妨げられています。プロトコル 1の反応の合計、ダイナミックな最適化手法の概要を説明し、発展途上のゼブラフィッシュ脳の断面積で安定した Mt。さらに、商業的に使用する直接的な方法利用可能なソフトウェアは、これらの MT 集団を定量化に記載されます。安定した MTs は、α-チューブリンのアセチル化、detyrosination、時間16,17をかけて安定した MTs の蓄積などのいくつかの翻訳後修飾に基づく動的 MTs と区別されます。ゼブラフィッシュの胚のアセチル化は、毛様体と軸索の MTs の安定した界面 MTs18、安定した MTs のサブセットにこのマーカーの有用性を制限することではなく、発生します。対照的に、detyrosination は、ゼブラフィッシュ胚18のすべての安定した MTs で発生するが表示されます。この翻訳後修飾は、α-チューブリン (tubulin detyrosinated)18のカルボキシ末端のグルタミン酸を公開し、抗グルタミン酸チューブリン19を使用して検出することができます。Detyrosination は、安定した MTs に優先的に発生しますが、実験的証拠は MT 安定16の原因ではなく結果、この翻訳後修飾であることを示します。、抗-Tyr-チューブリン, α-チューブリン19の tyrosinated フォームを特異的に認識する抗体を用いた動的な MTs の構成相互の MT の人口は区別されます。次のこれらのマーカーと共焦点レーザー顕微鏡の反応、MTs (長さ、番号、および相対的な豊かさ) の定量分析は成長の神経管の定義された領域で実行できます。合理化されたメソッドは、3次元画像処理ソフトウェアを使用して分析を実行するためここで提供されます。このメソッドは、形態形成や設立成熟細胞極性20の質問はアドレスに適用できます。確かに、安定した MTs の偏光配列の精緻化に伴う光受容形態21、開発途上神経管18と軸索形成の8細胞の上皮化を含む多くの発達的イベント。

プロトコル 2では、そのアセンブリ フェーズ (アンカレッジ/核生成と成長)22,23中 MTs を分析する細胞生物学試験の生体の適応について説明します。新生 MTs は中心体を核、その後母中心小体23の subdistal 肢に固定します。次の解重合初期の MT 再生を分析する方法を説明します。このプロトコルは、MTs、薬物のウォッシュ アウト プロシージャおよび治療後の回復期間を耳下腺ノコダゾール処理に関する詳細を提供します。MT の再成長が一定間隔で監視します。合計 MTs のためのマーカーとの反応によって s post ウォッシュ アウト (抗 β-チューブリン) 中心体のマーカーと一緒に (抗 γ-チューブリン) と核 (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI))、プロトコル 1で説明する一般的な手順によると。De novo MT の評価ではなく既存の MTs の拡張が可能、このプロトコルの MT 解重合ステップは欠かせません。この手法は結合タンパク質 3 チャンらに示すように、緑色蛍光タンパク質 (EB3 GFP) に融合エンドなどプラスのヒント マーカーを使用して、(解重合の不在) の MT の成長率を測定するためその他のパブリッシュされた手順とは異なるため201211。この試金は胚・ デ ・ ノボMT アセンブリの欠陥を分析する場合に役立ちますまた、不完全なものに終って中心体には γ-チューブリンの募集が障害者である以前に報告したNEDD1変異など神経管形成と神経欠陥24。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td style="width:177px;">IBI scientific</td>
			<td style="width:159px;">IB70050</td>
			<td style="width:373px;">Only used for embedding. 
			 
			Prepare 4% LMP agarose 
			by heating a solution of&#160; 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave 
			until polymerized. Keep warm on a 50 &#730;C hot plate with the cap secured</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">Used to treat petridishes.&#160;&#160; Prepare 1% agarose 
			by heating a solution of&#160; 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave 
			until polymerized.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">487928-10MG</td>
			<td style="width:373px;">Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots.&#160; Store at -20 &#730;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">8% Formaldehyde</td>
			<td style="width:177px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:159px;">157-8-100</td>
			<td style="width:373px;">Aliquot and store at -20 &#730;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Kpipes</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P7643</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">NaCl</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">S7653</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">T3253-500G</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">KCl</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9333-500G</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C5080</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">NP-40</td>
			<td style="width:177px;">American Bioanalyticals</td>
			<td style="width:159px;">AB01424</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">EGTA</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">E3889-25G</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">MgCl2</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2670-500G</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">S26-100ml</td>
			<td style="width:373px;">Aliquot and store at -20 &#730;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">BP1605</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Triton-x</td>
			<td style="width:177px;">American Bioanalyticals</td>
			<td style="width:159px;">AB02025</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P5147-1G</td>
			<td style="width:373px;">make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 &#730;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Anti-Fade mounting medium</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:159px;">P10144</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DAPI</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:159px;">D1306</td>
			<td style="width:373px;">Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 &#181;l DAPI stock&#160; with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 &#730;C for months.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:207px;">Mouse anti-&#946;-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Developmental studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:159px;">E7</td>
			<td style="width:373px;">1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Rabbit anti-&#947;-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Genetex</td>
			<td style="width:159px;">GTX113286</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Rabbit anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Genetex</td>
			<td style="width:159px;">GTX108784</td>
			<td style="width:373px;">1/1000*</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Rabbit anti-detyrosinated-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">AB3201</td>
			<td style="width:373px;">1/200-1/1000*&#160; Titrate antibody with first use of new lot.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Rabbit anti-tyrosinated-tubulin</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">ABT171</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Mouse anti-centrin</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">04-1624</td>
			<td style="width:373px;">1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Goat 488 anti-rabbit</td>
			<td style="width:177px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:159px;">A11008</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Goat 594 anti-rabbit</td>
			<td style="width:177px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:159px;">A11012</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Goat 594 anti-mouse</td>
			<td style="width:177px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:159px;">A11005</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Goat 488 anti-mouse</td>
			<td style="width:177px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:159px;">A11001</td>
			<td style="width:373px;">1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Vibratome</td>
			<td style="width:177px;">Vibratome</td>
			<td style="width:159px;">1500</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Forceps</td>
			<td style="width:177px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">555227F</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:177px;">Cell treat</td>
			<td style="width:159px;">229693</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">35 mm petri dish</td>
			<td style="width:177px;">Cell treat</td>
			<td style="width:159px;">229638</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">50 ml falcon tube</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-432-22</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Woven nylon mesh 70 um</td>
			<td style="width:177px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:159px;">B0043D1SZG&#160;</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Micropipette</td>
			<td style="width:177px;">Gilson</td>
			<td style="width:159px;">F123602</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">NC-999363-9</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Aquarium sealant</td>
			<td style="width:177px;">Amazon.com, by MarineLand</td>
			<td style="width:159px;">Silicone Sealer 1 oz (Tube)&#160;</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Ring stand</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-675BO</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Microbore PTFE Tubing, 0.022&#34;ID</td>
			<td style="width:177px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:159px;">WU-06417-21</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Modeling clay</td>
			<td style="width:177px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:159px;">Sargent Art 22-4000</td>
			<td style="width:373px;">Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Clamp</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-215-466</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">60ml syringe</td>
			<td style="width:177px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-820-11</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Embryo medium (E3)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">34.8 g NaCl 
			1.6 g KCl 
			5.8 g CaCl2&#183;2H2O 
			9.78 g MgCl2&#183;6H2O 
			 
			To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Blocking Solution</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">50 ml TBS-NP-40 
			2.5 ml normal goat serum 
			1 g BSA 
			625 &#181;l Triton-X</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">TBS-NP-40 (pH 7.6)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">155 mM NaCl 
			10 mM Tris HCl 
			0.1% NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">2x MAB (pH6.4)</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:373px;">160 mM KPIPES 
			10 mM EGTA 
			2 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Commercial 3-D Image processing Software</td>
			<td style="width:177px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:159px;">Volocity (V 6.2)</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Dry block heater&#160;</td>
			<td style="width:177px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">12621-108</td>
			<td style="width:373px;">Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ12</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">SP5</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Flat embedding mold</td>
			<td style="width:177px;">emsdiasum.com</td>
			<td style="width:159px;">BEEM 70904-01</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Public domain image processing software</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td style="width:159px;">ImageJ (V 1.5)</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:532px;">* Success varies by lot number</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of immunolabeling to analyze stable, dynamic, and nascent microtubules in the zebrafish embryo

微小管 (MTs) は、イメージ体内、特に脊椎動物の胚に挑戦して、ダイナミックで壊れやすい構造です。反応メソッドは、ゼブラフィッシュの胚の成長の神経管の MTs の異なる集団を分析するためここで記述されます。神経組織にフォーカスがある、この方法論は他の組織に広く適用されます。手順は、早くに半ば形成段階の胚 (12 体節に 1 体節)、しかし彼らに適応できる一連の比較的マイナーな調整と他のステージのために最適化されています。最初のプロトコルは、安定性と動的な MTs の空間分布を把握し、画像処理ソフトウェアでこれらの集団の定量的分析を行うメソッドを提供します。このアプローチは、既存のツールにリアルタイムを使用して形質転換線のタグ構造体の一過性の発現分布と画像微小管動態を補完します。確かに、このようなツールは、ダイナミックで安定した MTs とは容易に区別しないしかし、非常に便利。イメージを作成し、これらの異なる微小管集団を分析することで、細胞の極性形成と形態形成メカニズムの理解のための重要な含意。2 番目のプロトコルでは、新生 MTs を具体的に明らかにする手法について説明します。これは、次の薬ノコダゾールと薬物ウォッシュ後の回復期の微小管脱重合時間をかけて、MTs のde novoの成長特性をキャプチャで。この手法は、MTs のゼブラフィッシュ胚におけるにまだ適用されていない、微小管重合に関与する蛋白質の生体内機能を調査するための貴重なアッセイをします。

反応を使用して安定性と動的な MTs の解析 プロトコル 1, Glu チューブリンと Tyr チューブリン マーカーとして使用する安定性と動的な MTs のそれぞれ初期 (神経キール) 中に MT のサブ集団の分布と神経管の開発の後期 (神経ロッド) が明らかに。動的な MTs 一世を風靡菱脳神経キール ステージ (4-5 体節) で (図 2A ~ D)。キールが神経のロッド (11-12 体節)、強化された上皮化の段階に発展する質的少ない MTs は腹側のロッドを中心に反 Tyr チューブリン抗体 (図 2E H) 陽性。対照的に、Glu チューブリンが散在しており神経キール (図 3A ~ D) 全体で点状が MT 管 (図 3E H) に沿って腹側神経ロッドで濃縮されています。矢印は、ラベリングが増加特定の MT バンドルまたは構造体をポイントします。
抗グルタミン酸チューブリンと反 Tyr チューブリン抗体は (二重標識実験の防止) 同一宿主動物種で生産されたが安定的かつ動的な MT のマーカーはほとんどゼブラフィッシュの逃避重複と考えられました。まず、腹側の神経のロッドが動的 (図 2F) MTs よりもより安定した (図 3F) です。背側神経ロッドで傾向を反転、ゼブラフィッシュ モデルと一致して結びつけている神経管までに背側の組織するダイナミックなまま形成20。第二に、分裂が完全に付けニューラル キール (図 2D矢印)、Tyr-チューブリン抗体、中心体と一致するスピンドルのベースだけ中が付いて安定性マーカー Glu チューブリン (図 3D矢印)。Β-チューブリン蛍光抗体法、両方の試金に一般的な通知されますすべて MTs 分布の実験者、非固有のラベルを却下するための基礎を提供しています。
大量の便利な表 (表 2) にまとめることがデータで起因する 3次元画像解析ソフトウェアを使用してオブジェクトを測定します。長さ、数、および面積の測定をするためには、分析に使用できるデータのサブセットのみを用いています。さらに分析することがなくデータのコンポーネントの 1 つは、指定したオブジェクトの数です。この番号は、数する必要がありますいないによって大きく異なるセクション、および MTs に核の比率は単一の治療条件の類似したとどまるべきであるのような内部の品質管理として使用します。外れ値は、調整フィルターを再実行する必要がありますいずれかの分析、またはイメージの分析も不十分なラベルが付いたインジケーターです。したがって、外れ値のすべての画像は、調整した設定を再分析する必要があります。外れ値セクションは、貧しい人々 のラベル付けや異常なオブジェクト カウント可能性があります物理的な損傷の兆候を検討すべき。解析が完了すると、品質管理、有用な情報から回復できる生データはよう合計 MTs の平均の長さと、MTs または合計 MTs (表 3) に安定した mt 比を安定します。これらの測定に加えて (核、中心、等) 他の細胞構造に MTs または彼らの関係に関する推論を描画するために使用することができます 3次元画像解析ソフトウェアを使用して他の多くの統計情報が得られます。
De novoMT アセンブリ アッセイ ノコダゾール治療 depolymerizes MTs (図 4A、4 D 、 4 G) びまん性ラベリングの結果です。MTs が再生すると、彼らは中心体 (図 4B、4 eと4 H) から延長、ただし、これはそれらの非平面軌道 (図 4C、4 階と4I) による単一の平面でわかりにくい。それにもかかわらず、いくつかの画像解析ソフトウェアはノコダゾール ウォッシュ アウト (表 4) 後 MT 成長の評価を有効にする 3次元の長さを測ることができます。表 4にデータセットから得られる重要な観察、分析神経管のすべての地域でノコダゾール ウォッシュ後の時間の経過とともに増加する MTs の平均の長さが表示されます。前述のように、他のタイプの 3次元画像解析ソフトウェアから得られるメトリックは、mt 法データ (たとえば、比 MTs の核当り) を解釈する携帯電話のコンテキストを提供できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig1.jpg"> 
図 1: [ウォッシュ アウト] 装置の図・ デ ・ ノボMT アセンブリ アッセイ。はめ込みカット縦 50 mL 遠心管に接着メッシュから作られた流れを介してデバイスのクローズ アップがあります。メッシュは、複数の実験グループを同時に処理することができますように通過デバイスを個人的します。使用中に胚の中は注射器に追加され、すべての実験グループに一定のリンスを提供するフローを介してデバイスに合わせてチューブをゆっくりと流れます。<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig2.jpg"> 
図 2:動的な山地をイメージさせる反応の利用Dechorionated 胚の適切な段階 ( A ~ Dの 4-5、12-13 体節Eh)、後脳と β-チューブリン ( AとEグリーン) に対する抗体とカルビンディン抗体を介して横断面で固定しました。動的 MT 集団を明らかにするすべての MTs と tyrosinated α-チューブリン ( BとFで赤) をマークします。非常にダイナミックな MTs は、黄色のラベルが表示されます ( D, Hの矢印) の地域として結合画像 (C, G) と (D, H) そのより高い倍率で見ることができます。スケール バー = (A ~ C と E G) 25 μ m と 10 μ m (D ・ H)。<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig3.jpg"> 
Figure 3: 安定した山地をイメージさせる反応の使用Dechorionated 胚は、適切な段階 ( E-Hで-D と 12-13 距離で 4-5 体節) で、菱脳とカルビンディン抗体を切断、修正されました。合計 MTs は一般的な β-チューブリン抗体 ( AおよびEの緑) で視覚化した中安定した MTs は ( BとFで赤) α-チューブリン (Glu-チューブリン) の detyrosinated フォームに対する抗体が付いています。結合画像 (C, G) と (D, H) そのより高い倍率で赤と黄色の信号は、高山の安定度 (D, H の矢印) の領域を表します。スケール バー = (A ~ C と E G) 25 μ m と 10 μ m (D ・ H)。<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig4.jpg"> 
図 4:初期の山地をイメージさせる反応の利用Dechorionated 胚は 4-5 体節に固定され、横菱脳を断面します。セクションだったカルビンディン抗体 β-チューブリン (D、E、およびF) MTs の成長をマークすると γ-チューブリン (A、B、およびC) 核形成ポイント/体をマークします。神経管の背側領域は箱入り (A、D;B、EとC F)、高倍率で表示 (G, H, 私、それぞれ) 核 (DAPI、ブルー) の合計と、(γ-チューブリン ・赤) の由来を明らかにする MTs (β-チューブリン、緑)。白の矢印: MTs と由来。黄色の矢印: セルの第 2 中心小体が表示されます。スケール バー = (A ~ F) 25 μ m と 10 μ m (G-私)。<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55792/55792table1.jpg"> 
表 1: 既定の 3次元画像解析ソフトウェア内のオブジェクトをフィルター処理するための設定。
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/55792/55792table2.jpg"> 
表 2: 代表的な raw データ セットを分析するソフトウェアは MTs を安定した 3次元画像解析を用いて。各列では、単一のセクションからの測定値を表します。Min: 最小測定;Max: 最大測定;SD: 標準偏差;SE: 標準誤差です。
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/55792/55792table3.jpg"> 
テーブル 3: 3次元から得ることができるデータセットの例として画像安定した MTs を定量化する分析ソフトウェア。合計 (β-チューブリン) の平均長さの測定を選択し、MTs (の合計 (Glu-チューブリン) MTs (表 2を参照してください) すべてのサンプルから関連するラベルの平均の骨格の長さの平均と安定の比で計算を安定Glu-tubulin あたり β-チューブリンの縞すじの一手) 平均の Glu チューブリン数で割った平均 β-チューブリン カウントを取得して計算します。
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/55792/55792table4.jpg"> 
表 4:データセットを分析する 3次元画像解析ソフトウェアから取得可能の例・ デ ・ ノボMT アセンブリ。De novo MT アセンブリからの代表的な結果の実験、ノコダゾール ウォッシュ後に 3 つの回復時間ポイント (1, 5, 10 分) 得られたデータセットを比較します。各時点の核数を由来 (γ-チューブリン涙点)、合計 MTs (β-チューブリン縞) の数の測定が表示されます選択、イメージの領域分析 (開発の神経管の断面)。

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Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

ここでは、他の組織に広く適用される、ゼブラフィッシュ脳の発達における微小管の異なる集団を分析するメソッドについて反応について説明します。最初のプロトコルでは、反応の安定性と動的微小管の最適化手法について説明します。第二議定書は、画像し、初期微小管を具体的に数値化する方法を提供します。

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

use-immunolabeling-to-analyze-stable-dynamic-nascent-microtubules

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K ビュー.  University of Maryland, Baltimore County. ここでは、他の組織に広く適用される、ゼブラフィッシュ脳の発達における微小管の異なる集団を分析するメソッドについて反応について説明します。最初のプロトコルでは、反応の安定性と動的微小管の最適化手法について説明します。第二議定書は、画像し、初期微小管を具体的に数値化する方法を提供します。

ビデオ: Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するための<em&gt;インビトロ</em&gt;髄鞘形成アッセイ

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

発生生物学

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

2 つのサケ科の魚で空気除去の有効性 (オンコルヒュンクス) レインボー ・ トラウトやブラウン ・ トラウト (タイセイヨウサケMorpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...