Wir wünschen Johnson &amp; Johnson, der TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X und Trius Therapeutics danken für die Bereitstellung von Bedaquilin, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid und Tedizolid sind. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li und Danielle Weiner unterstützte mit MALDI-Analyse, bioanalytische Verfahren, Herstellung der caseum Surrogat, chemische Synthese und Isolierung von Kaninchen-caseum. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der Bill und Melinda Gates-Stiftung, Auszeichnung # OPP1044966 und OPP1024050 V. Dartois, NIH Geteilt Instrumentation Grant-S10OD018072 sowie eine gemeinsame Finanzierung von der Bill and Melinda Gates Foundation und Wellcome Trust für ein Kompetenzzentrum durchgeführt für Lead-Optimierung für Krankheiten der Dritten Welt zu P. Wyatt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Use Committee des NIAID (NIH), Bethesda, MD durchgeführt. Alle Studien mit M. tuberculosis wurden in einem Labor mit Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt. 1. Kaninchen Infektionsmodell und Caseum Sammlung <ol><li> Infect Neuseeland weiße Kaninchen mit M. tuberculosis einen nasen nur Aerosol - Belichtungssystem unter Verwendung von wie oben beschrieben. 12, 13 erlauben die Infektion für 12-16 Wochen fortzuschreiten. Sedate die Kaninchen, die mit 35 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin intramuskulär, euthanize die Kaninchen mit 0,22 ml / kg Pentobarbital-Natrium und Phenytoin-Natrium intravenös und mit den necropsies fortzufahren. </li><li> Mit einer Pinzette und Skalpell entfernen Lunge aus der Brust cavity. Von jedem Lungenlappen, seziert aus einzelnen Hohlräumen und großen nekrotischen Granulome mit einem Skalpell. Vorsichtig abkratzen caseum aus dem Hohlraum und Granulom Wänden. Wiegen, aufnehmen und speichern Proben in 2 ml Röhrchen mit Schraubverschluss bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Gamma-Bestrahlung der infektiösen caseum Proben bei 3 MegaRad auf Trockeneis sie uninfectious und sicher für den Einsatz in einem BSL-2 Labor zu machen. </li></ol> 2. In - vitro - Erzeugung von Caseum Surrogate von THP-1 - Zellen <ol><li> Wachsen THP-1 Monozyten in RPMI 1640-Medium (2 mM L-Glutamin und 10% fötales Rinderserum) in T175 Zellkulturflaschen (80 ml / Kolbe). Inkubieren der Kolben in einer 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 3-4 Tage. </li><li> Zentrifugieren der Kultur aus einer T175-Kolben in zwei 50 ml konischen Röhrchen bei 150 × g für 5 min. Überstand verwerfen und suspendiert das Pellet in 10 ml RPMI 1640 Medien. </li><li> Pipette 5 &amp; mgr; l dieser Kultur in ein 1,5 ml-Röhrchen mit 45 &amp; mgr; l tRypan blau. Gründlich mischen durch Pipettieren. Übertragung 10 &amp; mgr; l zu einem Hämozytometer und zählen die Anzahl der lebensfähigen THP-1-Monozyten (ungefärbten) ein Lichtmikroskop (Vergrßerung 10X) verwendet wird. Berechnen Sie die Anzahl der lebenden Zellen pro ml der Kultur. Verdünne mit RPMI - Medium auf die Enddichte von 1,25 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Last 40 ml der Kultur auf einer großen Zellkulturplatte (50 x 10 6 Zellen / Platte). Werden 40 &amp; mgr; l von 100 &amp; mgr; M PMA (Phorbol-12-Azetat-myristate13 in Ethanol hergestellt) und lassen Zellen über Nacht in dem Inkubator haften. HINWEIS: Endgültige Konzentration von PMA ist 100 nM. </li><li> Verdünnte reine Ölsäure (OA) (0,89 g / ml) in Ethanol zu einer Konzentration von 0,1 M (dh 31,7 uL OA in 968,3 &amp; mgr; l Ethanol). Man verdünnt diese Lösung in frischem vorgewärmtem RPMI Medium auf eine Konzentration von 10 mM. Man verdünnt diesen OA Suspension auf 0,4 mM (endgültige Arbeitskonzentration) in RPMI-Medium vorgewärmt auf 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die vorhandenen Medien und nichtAdhärierten Zellen aus den Zellkulturplatten und fügen sanft 40 ml 0,4 mM OA zu den THP-1-Makrophagen (THP-M) hinzu. Inkubieren bei 37 ° C im Inkubator über Nacht. </li><li> Verwenden Sie ein Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung, um das Vorhandensein zahlreicher Lipidkörper-Einschlüsse in jedem THP-M visuell zu bestätigen. Entfernen Sie alle RPMI-Medium aus den Zellkulturplatten und waschen Sie die adhärenten Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Verwendung einer 50 ml serologischen Pipette. HINWEIS: Lipidkörper erscheinen als kleine, klare, sphärische Strukturen im Cytoplasma des THP-M. </li><li> Füge 40 ml 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS zu jeder Platte hinzu. 15 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Lösen Sie die schaumigen Makrophagen (FM) durch wiederholtes Pipettieren über die Oberfläche der ganzen Platte mit einer 10-mL serologischen Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 50-ml-Kegelrohr und drehen Sie sie bei 150 xg für 5 min. </li><li> Das Zellpellet wird in 10 ml PBS (dritter PBS-Wäsche) a resuspendiertNd Übertragung auf eine vorgewogene 15-ml-konische Rohre. Spinne bei 150 xg für 5 min. Den Überstand sorgfältig mit einer serologischen Pipette abspülen und entsorgen. </li><li> Betrachten Sie die FM-Pellets zu 3 Gefrier-Tau-Zyklen, um die Zellen zu lysieren und sie bei 75 ° C für 20-30 min zu inkubieren, um Proteine ​​in der Matrix zu denaturieren. Die Pellets bei -20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren. </li></ol> 3. Rapid Equilibrierung Dialyse (RED) Assay <ol><li> 10 mM Stammlösungen aller Testverbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereiten. Verdünnen Sie zu 500 μM Arbeitslösungen in DMSO vor jedem Assay. </li><li> Wiegen Sie die Röhre mit dem Fallum Surrogat Pellet. Subtrahiere das Gewicht des leeren Rohres, um das Gewicht des Pellets allein abzuleiten. Füge 2-3 Metallperlen pro Röhrchen hinzu und unter Verwendung eines Gewebehomogenisators bei 1.200 Hüben / min für 1 min den Fallum oder die Surrogatmatrix in PBS (1: 9 w / v) zu stören, um 10x verdünnte Suspension jeder Matrix zu erreichen. </li><li> Spike 6,5 μl der 500ΜM-Lösung der Testverbindung in 643,5 &amp; mgr; l des Homogenats, um die Endkonzentration von 5 &amp; mgr; M (&amp; le; 1% DMSO) zu erreichen und zu verwirbeln. </li><li> Legen Sie die ROT-Einsätze in die Grundplatte. Füge 200 μl der drogenspiked Matrix in die Spenderkammer (roter Ring) jedes RED-Inserts und 350 μl PBS in jede Empfängerkammer ein. Vorbereiten von 3 Einsätzen für jede Testverbindung (dreifache Proben). Siegelplatte mit einer Klebeplatte abdichten und bei 37 ° C auf dem Thermomixer bei 200 U / min (1 xg) für 4 h inkubieren. </li><li> Nach der Inkubation mischen Sie den Inhalt der Spender- und Empfängerkammern vorsichtig 2-3 mal auf und ab. 20 μl Aliquote von Homogenat aus den Spenderkammern pipettieren und 20 μl sauberes PBS in ein 1,5 mL Röhrchen (1: 1) zugeben. In ähnlicher Weise pipettieren Sie 20 μl Aliquots von PBS-Proben aus den Empfängerkammern und fügen Sie 20 μl sauberes Homogenat (Matrix-Matching) hinzu. 8 HINWEIS: Matrix-Matching eliminiert die neFür 2 separate Kalibrierkurven (in Homogenat und PBS) für die quantitative Analyse. Der Inhalt der Spenderkammer kann im Laufe der Zeit sedimentieren. Den Inhalt vor dem Entfernen von Aliquoten vorsichtig mischen. </li></ol> 4. LC-MS Quantifizierung und Datenanalyse <ol><li> Fügen Sie 160 μl 1: 1 Methanol: Acetonitril mit 500 ng / ml Diclofenac oder 10 ng / ml Verapamil (interner Standard) zu jedem Röhrchen hinzu und verwirbeln Sie, um Proteine ​​auszufällen. Zentrifugieren bei 10.000 xg für 5 min, um den Niederschlag zu sedimentieren und die Überstände in 96-Well-Tiefbrunnen-Platten zur Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LCMS) zu überführen. 7 </li><li> Erstellen Sie Kalibrierkurven von 1-1.000 nM für jede Testverbindung, während Sie die gleiche Matrixzusammensetzung wie die obigen Proben halten. Quantifizieren Sie die Konzentration der Testverbindung in Proben aus den Spender- und Empfängerkammern nach einer LC-MS-Methode. </li><li> Berechnen Sie den ungebundenen Bruch ( f u ) of die Droge in verdünnter Matrix unter Verwendung von Gleichung 1. Berechne des f u in unverdünnter Matrixgleichung unter Verwendung von 2 (D = Verdünnungsfaktor von 10). 14 <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Überprüfen Sie die Wiederherstellung (Massenbilanz) jeder Verbindung unter Verwendung von Gleichung 3 zu identifizieren Verbindungen mit Stabilität / Stoffwechsel / nicht-spezifische Bindungsprobleme. HINWEIS: Wiederherstellung fällt typischerweise zwischen 70% und 130%. 15 <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy.">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li><li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis.">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions.">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li><li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding.">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li><li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Equilibrium+Dialysis+(RED):+an+In-vitro+High-Throughput+Screening+Technique+for+Plasma+Protein+Binding+using+Human+and+Rat+Plasma.">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid.">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li><li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+localization,+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat.">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+a+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li><li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+Granulomas+are+Hypoxic+in+Guinea+pigs,+Rabbits,+and+Non-Human+Primates.">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li><li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure:+implications+for+rational+drug+discovery.">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li><li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis.">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li><li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910.">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li></ol>

Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Pulmonary nekrotische Läsionen und Hohlräumen bei Tuberkulose-infizierten Patienten enthalten Subpopulationen von Bakterien, die zur medikamentösen Behandlung recalcitrant sind. Die käsigen Kerne dieser Strukturen sind besonders verantwortlich, diese persisters in einer extrazellulären Umgebung für die Beherbergung. 16 günstige Verteilung von antibakteriellen Mitteln in diese entfernten Standorte wird angenommen , dass eine wichtige Determinante der Tuberkulose Wirksamkeit von Medikamenten sein. Vor der Validierung dieses Protokolls, gab es keine In - vitro - Techniken zur Verfügung, die die Verteilung der Wirkstoffforschung Verbindungen in käsigen Läsionen vorhersagen könnte. Massenspektrometrie Bildgebungstechniken Als Ergebnis war die Beurteilung der Arzneimittelverteilung in diesen kritischen Brennpunkten stark abhängig von Tierinfektionsmodellen, Läsion zentriert pharmakokinetischen Studien und MALDI. 5, 17 Die in - vitro - Test beschrieben , erRe ist ein schneller und effektiver Weg zur Vorhersage der Arzneimittelpenetration bei Tuberkuloseläsionen ohne Ledium und Kosten für in vivo pharmakokinetische Studien. Das Protokoll ist eine Modifikation des Plasmaprotein-Bindungsassays, der ursprünglich die beabsichtigte Verwendung der RED-Vorrichtung war. Die Homogenisierung von Gewebeproben zu einer pipettierbaren Konsistenz ermöglicht die Messung der Gewebeproteinbindung unter Verwendung derselben Vorrichtung. Dieses Protokoll kann mit caseum durchgeführt werden, wenn es von Tierinfektionsmodellen verfügbar ist. Wie Abbildung 1 erklärt, binden Medikamentenmoleküle an Makromoleküle im Fall / Surrogat-Homogenat und halten sie in der Spenderkammer, während die ungebundenen Arzneimittelmoleküle frei sind, über die semipermeable Membran in die Empfangskammer zu diffundieren. Die ungebundene Fraktion ( f u ) equilibriert zwischen beiden Kompartimenten während der Inkubationszeit. Wie Fig. 2 zeigt, sind sehr stark gebundene Verbindungen ( f u ≤ 1%), die almo sindvollständig innerhalb der Spenderkammer eingeschlossen st sind permeierenden caseum nicht wirksam. Auf der anderen Seite, weniger gebundene Verbindungen (1% &lt;f u &lt;100%) sind in der Lage in den käsigen Kern in unterschiedlichem Maß zu diffundieren; Je höher die f u, durchdringt die ausführlichen den nekrotischen Bereich. Das Protokoll kann auch mit einer Surrogat-Matrix, die aus Lipid-beladenen Makrophagen THP-1, die mit Ölsäuren induziert wurden, abgeleitet werden. Mehrere Bedingungen für die Induktion von Lipidkörpern Akkumulation wurden auf THP-1 s getestet. Dies umfasst Hypoxie, Exposition gegenüber bestrahlten M. tuberculosis und der Exposition gegenüber Trehalose-6,6&#39; dimycolat (TMD) von der mycobakteriellen Zellwand abgeleitet. Die endgültige Oleinsäure Inkubation Konzentration von 400 uM wurde nachgewiesen peak Lipidkörperbildung zu induzieren, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen und die Haftung zu beeinträchtigen. 7 Die Verdünnung von Ölsäure in vorgewärmten Medien ist entscheidend , um sicherzustellen , maximaL Auflösung der Fettsäure. Die resultierende Surrogatmatrix hat einen vergleichbaren Cholesteringehalt zum wahren Fall, aber höhere und niedrigere Triglycerid- und Proteininhalte. 7 Wie Abbildung 3 zeigt, korreliert die Bindung von 18 Anti-Tuberkulose-Verbindungen an die Surrogat-Matrix stark mit ihrer Bindung an den Fall. Die jüngste Studie, die auch nicht-kommerzielle Verbindungen mit undefinierter bakterizider Aktivität einschloss, zeigte, dass die FM-abgeleitete Matrix ein wirksames Surrogat zum Fall ist. 7 Durch die Beseitigung der Notwendigkeit von Tierinfektionsmodellen erhöht die Surrogatmatrix den Durchsatz dieses Assays erfolgreich, während sie kostengünstiger wird. Dieses vielseitige Protokoll kann auch verwendet werden, um mehrere Verbindungen gleichzeitig zu testen (Kassettentests). Wir haben bisher gezeigt, dass das Testen von 5 Arzneimittelkombinationen, alle bei 5 &amp; mgr; M, in jedem Einsatz unter Verwendung dieses Protokolls effektiv eine Verbindung herstellen kannS auf der Grundlage ihrer caseum bindenden Affinitäten beim Sparen von Zeit und Material. Eine sechste Kontrollverbindung wie Moxifloxacin kann der Kassette als interne Kontrolle zugesetzt werden, um die Konsistenz zwischen Assays und Chargen von Fallum / Surrogat zu gewährleisten. 7 Wichtig ist, dass das Protokoll mit so wenig wie 20 μl eines 10 mM Verbindungsmaterials (&lt;&lt; 1 mg einer Verbindung) durchgeführt werden kann. Dies ist ein großer Vorteil früh in der Wirkstoff-Entdeckung Prozess, wenn Chemiker synthetisieren begrenzte Mengen von jeder Verbindung für Screening-Zwecke. Die RED Geräte sind automatisationsfreundlich; Der Mikroplattenabdruck der Basisplatte macht es kompatibel mit automatisierten Systemen, die für die Verarbeitung von Standard-96-Well-Platten ausgelegt sind. Obwohl die Surrogat-Matrix gezeigt wurde, dass sie die Bindungseigenschaften von ex vivo caseum erfolgreich nachahmen (Abbildung 3 ), erkennen wir an, dass sie bestimmte Verbindungen ungenau profilieren kann. THP-1-Makrophagen werden üblicherweise verwendet <em&gt; In - vitro - Techniken Alveolarmakrophagen im Lungengewebe zu simulieren. Allerdings ist die Surrogat-Matrix, die aus THP-1 nicht die gleichen Zusammensetzung wie das Material in nekrotischen käsigen Lungenläsionen. Als Ergebnis können bestimmte Klassen von Verbindungen in Wechselwirkung treten unterschiedlich mit der Surrogat-Matrix. Darüber hinaus ist der Erfolg des Tests auf der Stabilität der Testverbindung in der käsigen Matrix bedingtes. Caseum ist eine biologische Matrix, die viele Komponenten mit Plasma teilt, und daher ist dieses Protokoll Abbau anfällig Probleme in der gleichen Art und Weise viele plasmabasierten Assays sind ebenso Verbindung. In dieser Hinsicht ist die THP-M-Matrix abgeleitet Surrogat bevorzugt, da der Denaturierungsschritt in der Protokollenzymaktivität entfernt, am Ende des Tests die Gesamtrückgewinnung zu verbessern. Der caseum Surrogat-Bindungstest ist ein nützliches Werkzeug in der Wirkstoffforschung Tuberkulose und in mehrer Leitstrukturoptimierung Programmen verwendet werden. Es kann auch helfen, mehr ef zu entwerfenFective Kombination Regimen auf der Grundlage der Fähigkeit der einzelnen Medikamente, um in die verschiedenen Schichten von mehreren Läsion-Typen. Das Protokoll könnte auch angepasst werden, um die Wirkstoffforschung für andere Krankheiten zu erleichtern, die durch die Bildung von Läsionen oder Abszessen gekennzeichnet sind, wo die Drug Penetration begrenzt ist, aber für eine erfolgreiche Behandlung kritisch ist.

Die Behandlung der pulmonalen Tuberkulose-Krankheit erfordert eine effektive Verteilung der Medikamente in verschiedene Arten von Läsionen. Nekrotische Läsionen und Hohlräume enthalten käsige Zentren, die Subpopulationen von drogenverträglichen oder &quot;persistenten&quot; Bakterien beherbergen. 1 , 2 Die Kavitationserkrankung ist mit minderwertigen Heilungsraten und schlechter Prognose verbunden. 3 , 4 Frühere Studien haben gezeigt, dass mit Hilfe von quantitativen und bildgebenden Techniken die Fähigkeit, in den Fall zu dringen, signifikant von einer Medikamentenklasse zur anderen variiert. 5 , 6 Diese Methoden erfordern jedoch die Verwendung von Tierinfektionsmodellen, die langsam und langwierig sind. Ein in vitro- Assay, der die Arzneimittelbindung an ex vivo caseum misst, wurde entworfen. Diese Bindung wurde gefunden, um umgekehrt mit der Arzneimittelpenetration in käsigen Granulomen zu korrelieren und ist daherAls prädiktives Werkzeug verwendet. 7 Gleichgewichtsdialyse gilt als der Goldstandardansatz für Plasmaprotein-Bindungsstudien. Die RED-Vorrichtung (Rapid Equilibrium Dialyse) bietet ein schnelles, einfach zu bedienendes und zuverlässiges System zur Durchführung solcher Assays. 8 Das Gerät besteht aus zwei Komponenten: Einweg-Einweg-Einsätze bestehend aus 2 Kammern, die durch einen vertikalen Zylinder mit halbdurchlässiger Membran getrennt sind; Und wiederverwendbare Basisplatten, die bis zu 48 Einsätze zu einem Zeitpunkt aufnehmen können. Die Dialysemembran hat einen 8 kDa-Molekulargewichts-Cutoff (MWCO), der sich ideal für Arzneimittel-Makromolekül-Bindungsstudien eignet. Das hohe Flächen-zu-Volumen-Verhältnis des Membranabteils ermöglicht eine schnelle Dialyse und Äquilibrierung. Sowohl die Einsätze als auch die Basisplatte wurden für eine minimale unspezifische Bindung validiert. Die Kombination der RED-Vorrichtung mit bioanalytischen Techniken liefert genaue Schätzungen der ungebundenen Fraktionen von Arzneimitteln in pLASMA. 8, 9 Obwohl ursprünglich Plasmaproteinbindung zu messen, das RED-Gerät wird in mehreren Gewebebindungsstudien verwendet worden, unter Verwendung von Homogenaten. 10, 11 in diesem Protokoll messen wir Medikament caseum Bindung, die nekrotische Ablagerungen von den nekrotischen Läsionen und der Hohlräume tuberculosis infizierten Kaninchen ausgeschnitten. Die azelluläre und nicht-vaskuläre Natur des käsigen Materials macht es leicht in eine homogene Suspension zu homogenisieren, die mit dem Assay kompatibel ist. Da caseum ist mühsam herzustellen und schwer zu bekommen, wird das Protokoll auch für die Verwendung mit einer Surrogat-Matrix validiert, die von schaumigen Makrophagen hergestellt wird. THP-1 Monozyten abgeleiteten Makrophagen werden mit Ölsäure induziert, um mehrere Lipidkörper ansammeln, die sie geben ihre ‚schäumenden‘ Aussehen. Diese Lipid-beladenen Zellen werden geerntet undverarbeitet, um eine Matrix zu erzeugen, die wir als Ersatz verwenden, um caseum. Diese Studie hat gezeigt , dass die Drogen Bindung an diese Surrogat Matrix korreliert gut mit zu caseum Bindung, effektiv den in vivo nachahmt Prozess, die Arzneimittelpenetration in dem käsigen Kern von Granulomen und Hohlräumen verhindert.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&amp;sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&amp;nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

Die Tilgung der Tuberkulose-Krankheit erfordert Medikamentenregimen, die die Mehrfachschichten komplexer Lungenläsionen durchdringen können. Die Arzneimittelverteilung in den käsigen Adern von Hohlräumen und Läsionen ist besonders wichtig, weil sie Subpopulationen von drogenverträglichen Bakterien, die auch allgemein als persisten bezeichnet werden, beherbergen. Bestehende Methoden zur Messung der Arzneimittelpenetration bei Tuberkulose-Läsionen beinhalten kostspielige und zeitaufwändige in vivo- pharmakokinetische Studien, gekoppelt an bioanalytische oder bildgebende Verfahren. Die In-vitro- Messung der Arzneimittelbindung an Fallmakromoleküle wurde als Alternative zu solchen Techniken vorgeschlagen, da diese Bindung die passive Diffusion von Arzneimittelmolekülen durch den Fall beeinträchtigt. Die schnelle Gleichgewichtsdialyse ist ein schnelles und zuverlässiges System zur Durchführung von Plasmaprotein- und Gewebebindungsstudien. In diesem Protokoll haben wir eine schnelle Gleichgewichts-Dialyse (RED) -Gerät verwendet, um die Arzneimittelbindung an Homogenate von caseum zu untersuchen, das excis istAus den Läsionen und Hohlräumen von Tuberkulose-infizierten Kaninchen. Das Protokoll beschreibt auch, wie man eine Surrogatmatrix aus lipidbeladenen THP-1-Makrophagen erzeugt, um anstelle von caseum zu verwenden. Dieser Fall / Surrogat-Bindungstest ist ein wichtiges Instrument in der Tuberkulose-Wirkstoffforschung und kann angepasst werden, um die Arzneimittelverteilung bei Läsionen oder Abszessen, die durch andere Krankheiten verursacht werden, zu untersuchen.

Mit diesem Protokoll haben wir Hunderte von Tuberkulose Medikament Entwicklung Verbindungen für ihre vorhergesagte Effizienz bei Eindringen Fallum getestet. Abbildung 1 zeigt die Grundkonzepte des ROTEN Assays. Die Dialysemembran der RED-Inserts ermöglicht es, dass ungebundene kleine Moleküle vom Spenderbrunnen zum Empfänger gut diffundieren und schließlich ein Gleichgewicht zwischen beiden Kompartimenten erreichen. Kleine Moleküle, die an Makromoleküle wie Proteine ​​oder Lipide gebunden sind, werden im Spender gut gefangen. Die quantitative Analyse der Proben aus beiden Kompartimenten ermöglicht die Berechnung der ungebundenen Fraktion ( f u ) jedes kleinen Moleküls in der Fall- oder Surrogatmatrix. Es wurde gezeigt, dass diese Fraktion direkt mit der Arzneimittelpenetration im Fall in vivo korreliert. 7 Abbildung 2 zeigt die Verwendung von MALDI (Matrix-assisted laser desorption / ionization) MassenspektroMetry bilder, je höher die f u , desto umfangreicher diffundiert das Medikament in caseum. Daher stimmt dies mit der Hypothese überein, daß die Arzneimittelmoleküle in die äußere Felge des Gehäuses von ihrer Grenzfläche zu den zellulären Schichten der Läsion diffundieren, die Bindung an käsige Makromoleküle das Arzneimittel sequenziert und verhindert, daß es weiter in den kernigen Kern diffundiert. Eine Stichprobe von 18 Anti-Tuberkulose-Medikamenten ist in Tabelle 1 zusammen mit ihren f u in beiden Fallum und dem Surrogat aufgelistet. Wie Fig. 3 veranschaulicht, ist die aus THP-1-abgeleiteten schaumigen Makrophagen hergestellte Matrix ein wirksames Surrogat zum wahren Fall. Die Bindung in beiden Matrizen korreliert stark miteinander. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig1.jpg" /> Abbildung 1: Darstellung des ROTEN Assays. Während der Inkubation, Medikament Moleküle, die ungebunden bleiben Makromoleküle inDie Matrix diffundiert über die Dialysemembran. Im Laufe der Zeit wird ein Gleichgewicht zwischen der Konzentration von ungebundenen Arzneimittelmolekülen sowohl in der Spender- als auch in der Empfänger-Vertiefung hergestellt. Alle Makromoleküle (Proteine, Lipide, etc. ) und gebundene Arzneimittelmoleküle werden innerhalb der Spenderkammer gefangen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55559/55559fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig2.jpg" /> Abbildung 2: Drug Penetration in vivo . Die Beziehung zwischen der Fraktion ungebunden ( f u ) und der Diffusion in den Fall in vivo , bestimmt durch MALDI (Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation) Massenspektrometrie-Bildgebung für sechs Anti-Tuberkulose-Medikamente. Ionenkarten sind repräsentative Lungenläsionen und die Signalintensität wird durch die Skalenleiste nach links angezeigt. H<html> ematoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung von benachbarten Abschnitten unterhalb der Ionen-Karten dargestellt. Schwarz / Weiß-Konturlinien markieren die käsige Mitte jeder Läsion. Nachgedruckt (angepasst) mit Genehmigung von Sarathy et al. 7 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55559/55559fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55559/55559fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig3.jpg" /> Abbildung 3: Korrelation zwischen den ungebundenen Fraktionen (f u) von 18 anti-Tuberkulose Medikamenten in caseum und die Surrogat - Matrix. Die Best-Fit-Linie wurde unter Verwendung einer linearen Regression bestimmt. Die Güte der Anpassung wird als R &amp; sub2 ; -Wert ausgedrückt. Nachgedruckt (angepasst) mit Genehmigung von Sarathy et al. 7k &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td> Caseum f u (%) </td><td> Surrogat f u (%) </td></tr><tr><td> Ethambutol </td><td> 35,2 ± 4,4 </td><td> 38,8 ± 5,6 </td></tr><tr><td> isoniazid </td><td> &gt; 99,9 </td><td> &gt; 99,9 </td></tr><tr><td> Acetyl-Isoniazid </td><td> &gt; 99,9 </td><td> &gt; 99,9 </td></tr><tr><td> p - Aminosalicylsäure Säure </td><td> 54,7 ± 1,4 </td><td> 51,1 ± 11,2 </td></tr><tr><td> Rifampicin </td><td> 5,13 ± 0,2 </td><td> 7,3 ± 0,6 </td></tr><tr><td> Rifapentin </td><td> 0,5 ± 0,1 </td><td> 1,1 ± 0,1 </td></tr><tr><td> Moxifloxacin </td><td> 13,5 ± 3,7 </td><td> 16,8 ± 1,8 </td></tr><tr><td> Levofloxacin </td><td> 8,34 ± 0,4 </td><td> 16,3 ± 3,1 </td></tr><tr><td> Gatifloxacin </td><td> 16,3 ± 4,2 </td><td> 18,8 ± 2,9 </td></tr><tr><td> Linezolid </td><td> 29,3 ± 3,6 </td><td> 27,9 ± 2,2 </td></tr><tr><td> Posizolid </td><td> 10,7 ± 1,7 </td><td> 17,6 ± 4,5 </td></tr><tr><td> Sutezolid </td><td> 30,1 ± 8,7 </td><td> 21,7 ± 1,7 </td></tr><tr><td> Radezolid </td><td> 5,2 ± 0,8 </td><td> 7,6 ± 1,9 </td></tr><tr><td> Tedizolid </td><td> 8,8 ± 1,8 </td><td> 13,7 ± 2,7 </td></tr><tr><td> Clofazimine </td><td> &lt;0,01 </td><td> &lt;0,01 </td></tr><tr><td> Bedaquilin </td><td> &lt;0,01 </td><td> &lt;0,01 </td></tr><tr><td> PA-824 </td><td> 7,31 ± 2,2 </td><td> 3,6 ± 0,2 </td></tr><tr><td> OPC67683 </td><td> 0,04 ± 0,02 </td><td> 0,02 ± 0,002 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Fraktion ungebunden ( f u ) der 18 TB-Arzneimittel, die im Fall- und Surrogat-Bindungsassay getestet wurden. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Nachgedruckt (angepasst) mit Genehmigung von Sarathy et al . 7

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An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Hier beschreiben wir eine schnelle Gleichgewichtsdialyse (RED) Methode zur Messung der Arzneimittelbindung an den Fall aus pulmonalen Tuberkuloseläsionen und Hohlräumen. Das Protokoll wird auch mit einer schaumigen Makrophagen-abgeleiteten Matrix verwendet, die ein wirksames Surrogat zum Fall ist.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

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Nanyang Technological University

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Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Nonlinear Pharmacokinetics

Introduction to Respiratory System Drugs

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11.6K Aufrufe.  Rutgers.  Hier beschreiben wir eine schnelle Gleichgewichtsdialyse (RED) Methode zur Messung der Arzneimittelbindung an den Fall aus pulmonalen Tuberkuloseläsionen und Hohlräumen. Das Protokoll wird auch mit einer schaumigen Makrophagen-abgeleiteten Matrix verwendet, die ein wirksames Surrogat zum Fall ist. 

Serie: An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Ein Tuberkulose-Molekularer bakterieller Belastungstest (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Medizin

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hochdurchsatz-Screening-Assay für Mycobacterium abscessus mit Dual-Reportern

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Skalierbares Wirkstoff-Screening-Protokoll für die effiziente Entdeckung von M. abscessus-Behandlungen

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Ein

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Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung

Ein Tuberkulose-Molekularer bakterieller Belastungstest (TB-MBLA)

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

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