Biz sırasıyla, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ve tedizolid Bedaquiline sağlamak için Johnson &amp; Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Kaburga-X ve Trius Therapeutics teşekkür etmek istiyorum. Brendan Prideaux Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin Emma Rey-Jurado Nancy Ruel, Leyan Li ve Danielle Weiner MALDI analizi, biyoanalitik yöntemler, caseum vekil hazırlanması, kimyasal sentez ve tavşan caseum izolasyonu ile destek sağlamıştır. Bu çalışma V. Dartois NIH Paylaşılan Enstrümantasyon Grant S10OD018072 yanı sıra Mükemmellik Bir Merkezi için Bill ve Melinda Gates Vakfı ve Wellcome Trust ortak finansmanı için Bill ve Melinda Gates Vakfı tarafından finanse ödül # OPP1044966 ve OPP1024050 ile yürütülmüştür P. VVyatt&#39;a Gelişen Dünya Hastalıklar Kurşun Optimizasyonu için.

Tüm hayvan çalışmaları NIAID Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (NIH), Bethesda, MD onayı ile Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca gerçekleştirilmiştir. M. tuberculosis içeren tüm çalışmalarda biyo-güvenlik tutucu seviye 3 (BSL-3) ile birlikte bir laboratuarda gerçekleştirilmiştir. 1. Tavşan Enfeksiyon Modeli ve Caseum Koleksiyonu <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi bir sadece burundan bir aerosol uygulama sistemi kullanılarak Yeni Zelanda M. tuberculosis ile beyaz tavşan Infect. 12, 13 enfeksiyon 12-16 hafta boyunca ilerlemeye izin verin. Oturaklı 35 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin kas içinden, birlikte tavşan 0.22 ml / kg pentobarbital sodyum ve fenitoin sodyum ile tavşan damar ötenazi ve nekropsilerden devam edin. </li><li> cımbız ve bir neşter kullanılarak, göğüs ca akciğerleri kaldırmakvity. Her akciğer lobundan, bir neşter yardımıyla bireysel boşlukları ve geniş nekrotik granülomları inceleyin. Kaseyi dikkatli bir şekilde boşluk ve granülom duvarlarından kazıyın. 2 mL vidalı kaptaki tüpleri tartın, kaydedin ve depolayın -20 ° C&#39;de kullanıma hazır oluncaya kadar saklayın. </li><li> Kuru buz üzerinde 3 MegaRad&#39;de bulaşıcı kazein örneklerini gamma radyasyona maruz bırakarak onları bir bulaşıcı olmayan ve güvenli bir BSL-2 laboratuarında kullanın. </li></ol> 2. THP-1 Hücrelerinden Kaseum Vekilinin in vitro Üretimi <ol><li> T175 hücre kültürü şişeleri (80 mL / şişe) içinde RPMI 1640 ortamında (2 mM L-glutamin ve% 10 sığır fetüsü serumu) THP-1 monositleri büyütün. Şişeleri 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 atmosferinde 3-4 gün inkübe edin. </li><li> Kültürü, 150 xg&#39;de iki 50 mL konik tüp içinde T175 bir şişeden 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 10 mL RPMI 1640 ortamda pelet askıya alınız. </li><li> 45 uL t içeren 1.5 mL tüp içine bu kültürden 5 μL pipetleMavi rippan. Pipetleme ile iyice karıştırın. 10 μL&#39;lik bir hemositometreye aktarın ve canlı bir THP-1 monosit sayısını (renklendirilmemiş) bir ışık mikroskopu (10X büyütme) kullanarak sayın. Kültür mL başına canlı hücrelerin sayısını hesaplayın. RPMI ortamı ile 1.25 x 106 hücre / mL nihai yoğunluğa kadar seyreltin. </li><li> Büyük bir hücre kültürü plakasına (50 x 10 6 hücre / tabağa) 40 mL kültür yükleyin. 40 uL 100 uM PMA (etanol içinde hazırlanmış forbol 12-miristat 13-asetat) ilave edin ve hücrelerin inkübatöre gece boyunca yapışmasına izin verin. NOT: PMA&#39;nın nihai konsantrasyonu 100 nM&#39;dir. </li><li> Saf oleik asit (OA) (0.89 g / mL), 0.1 M konsantrasyonunda etanol içinde ( yani , 968.3 uL etanolde 31.7 μL OA) seyreltin. Bu çözeltiyi taze önceden ısıtılmış RMPI ortamında 10 mM&#39;lik bir konsantrasyona kadar seyreltin. Bu OA süspansiyonunu önceden 37 ° C&#39;ye ısıtılmış RPMI ortamında 0,4 mM&#39;ye (son çalışma konsantrasyonu) seyreltin. </li><li> Mevcut medyayı çıkarın veYapışmış hücreleri hücre kültür plakalarından hafifçe ilave edin ve THP-1 makrofajlarına (THP-M) 40 mL 0.4 mM OA ekleyin. Gece inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir THP-M&#39;de sayısız lipid cesedi kapanımının varlığını teyit etmek için 40x büyütmede hafif bir mikroskop kullanın. Hücre kültürü plakalardan tüm RPMI orta çıkarın ve 50 ml serolojik pipet kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) ile yapışkan hücreleri hafifçe yıkayın. NOT: THP-M&#39;nin sitoplazmasındaki lipit cisimler küçük, net, küresel yapılar olarak görünür. </li><li> PBS içinde 40 mL 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) her bir tabağa ilave edilir. 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin. </li><li> Köpüklü makrofajları (FM), 10 mL&#39;lik bir serolojik pipet kullanarak tüm plakanın yüzeyinde tekrar tekrar pipetleme ile ayırın. Hücre süspansiyonunu 50 mL&#39;lik bir konik tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 150 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> 10 mL PBS (üçüncü PBS yıkama) içinde hücre topağını tekrar süspansiyon haline getirin.nd önceden tartılmış 15 mL&#39;lik konik tüplere aktarın. 5 dakika boyunca 150 x g hızında tekrar Spin. Dikkatle bir serolojik pipet ve imha edilmesini kullanarak süpernatant aspire. </li><li> hücreler lize edildi ve matris proteinleri denatüre etmek için 20-30 dakika süreyle 75 ° C&#39;de inkübe etmek 3 dondurma-çözme döngüsüne FM pelet Konu. Kullanım için hazır olana kadar -20 ° C &#39;de pelet saklayın. </li></ol> 3. hızlı bir dengeleme Diyaliz (kırmızı) Deneyi <ol><li> dimetil sülfoksit tüm test bileşikleri (DMSO) içinde 10 mM stok çözelti hazırlayın. Her bir deney öncesinde DMSO içinde çözüm çalışan 500 uM&#39;ye seyreltilir. </li><li> caseum vekil pelet içeren tüp tartılır. tek başına pelet ağırlığı elde etmek için boş bir borunun ağırlığı çıkarılır. (: Ağırlık / hacim 1: 9), her matrisin 10x seyreltilmiş süspansiyonu elde etmek için caseum veya PBS ile taşıyıcı matris bozabilir 1 dakika / dakika 1200 vuruş bir doku homojenleştirici kullanılarak, tüp başına 2-3 metal boncuk ekleyin ve. </li><li> 500 6.5 uL başakΜM solüsyonu, 5 uM (≤% 1 DMSO) nihai konsantrasyonunu elde etmek için 643.5 uL homojenata ve vorteks içine yerleştirin. </li><li> KIRMIZI insertleri taban plakasına yerleştirin. Her alıcı bölmesine her RED girişi ve 350 μL PBS verici bölmesine (kırmızı halka) ilaç-spiked matris 200 mcL ekleyin. Her bir test bileşiği için üç eklenti hazırlayın (üçlü örnekler). Plakayı yapışkan plakalı bir conta ile yapıştırın ve 4 saat boyunca 200 rpm&#39;de (1 xg) termomiksör üzerinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kuluçka işleminden sonra verici ve alıcı odalarının içindekileri hafifçe 2-3 defa yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Donör odalardan 20 μL&#39;lik homojenat kısımları pipetleyin ve 1.5 mL&#39;lik bir tüpe (1: 1) 20 μL temiz PBS ekleyin. Benzer şekilde, alıcı odalardan PBS örnekleri 20 mcL alikotları pipetle ve temiz homojenat (matris eşleme) 20 mcL ekleyin. 8 NOT: Matris eşleştirme işlemi,Kantitatif analiz için yapılacak 2 ayrı kalibrasyon eğrisi (homojenat ve PBS&#39;de) için. Donör odasının içeriği zamanla sedimantasyon yapabilir. Alikotları çıkarmadan önce içeriğini pipetle hafifçe karıştırın. </li></ol> 4. LC-MS Niceleme ve Veri Analizi <ol><li> Her bir tüpe 500 ng / mL diklofenak veya 10 ng / mL verapamil (iç standart) içeren 160 uL 1: 1 metanol: asetonitril ekleyin ve proteinleri çökeltmek için girdap ekleyin. Çökeltiyi tortu haline getirmek ve süpernatantları sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LCMS) analizi için 96 oyuklu derin plakalara aktarmak için 5 dakika boyunca 10,000 xg&#39;de santrifüjleyin. 7 </li><li> Yukarıdaki numunelerle aynı matris bileşimini koruyarak, her test bileşiği için 1-1000 nM&#39;den kalibrasyon eğrileri oluşturun. Bir LC-MS yöntemi kullanarak verici ve alıcı odalarından alınan numunelerdeki test bileşiğinin konsantrasyonunu hesaplayın. </li><li> Bağsız fraksiyonu hesapla ( f u ) of denklem 1 kullanılarak seyreltilmiş matris içinde ilaç denklem 2 (D = 10 seyreltme faktörü) kullanılarak seyreltilmemiş matris içinde f u hesaplayın. 14 <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> stabilite / metabolizma / spesifik olmayan bağlanma konularla bileşimleri belirlemek için Denklem 3 kullanılarak her bileşiğin kurtarma (kütle dengesi) kontrol edin. NOT: Kurtarma tipik% 70 ve% 130 arasında düşer. 15 <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy.">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li><li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis.">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions.">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li><li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding.">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li><li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Equilibrium+Dialysis+(RED):+an+In-vitro+High-Throughput+Screening+Technique+for+Plasma+Protein+Binding+using+Human+and+Rat+Plasma.">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid.">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li><li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+localization,+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat.">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+a+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li><li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+Granulomas+are+Hypoxic+in+Guinea+pigs,+Rabbits,+and+Non-Human+Primates.">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li><li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure:+implications+for+rational+drug+discovery.">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li><li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis.">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li><li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910.">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li></ol>

Rakip finansal çıkarlar yoktur.

Tüberkülozla enfekte hastalarda pulmoner nekrotik lezyonlar ve boşluklar, ilaç tedavisine dirençli bakteri alt popülasyonlarını içerir. Bu yapıların kazeöz çekirdeği, özellikle, bu persisörleri ekstraselüler bir ortamda barındırmaktan sorumludur. Anti-bakteriyel maddelerin bu uzak yerlere olumlu dağılımının tüberküloz ilaç etkinliğinin önemli bir belirleyicisi olduğuna inanılmaktadır. Bu protokolün onaylanmasından önce, konstitüsyonel lezyonlarda ilaç keşfi bileşiklerinin dağılımını öngören mevcut in vitro teknikler mevcut değildi. Sonuç olarak, bu kritik odakların ilaç dağılımının değerlendirilmesi, hayvan enfeksiyon modelleri, lezyon merkezli farmakokinetik çalışmalar ve MALDI kitle spektrometri görüntüleme tekniklerine büyük ölçüde bağımlıydı. 5 , 17 İn vitro tahlil,Rejeneratif tüberküloz lezyonlarında ilaç penetrasyonunu tahmin etmek için hızlı ve etkili bir yoldur ve in vivo farmakokinetik çalışmaların maliyeti. Protokol, orijinal olarak RED cihazının kullanılması olan plazma protein bağlanma tahlilinin bir modifikasyonudur. Doku numunelerinin pipete uyumlu bir kıvamda homojenleştirilmesi, aynı cihaz kullanılarak doku proteininin bağlanmasını ölçmeye izin verir. Bu protokol, hayvan enfeksiyon modellerinden temin edilebilirse, kaseum ile yürütülebilir. Şekil 1&#39;de açıklandığı gibi, ilaç molekülleri, donör odasında tutularak kazein / vekil homojenatta bulunan makromoleküllere bağlanırken, bağlanmamış ilaç molekülleri, yarı geçirgen membrandan alıcı bölmesine dağılmaya karşı serbesttir. Bağlanmamış fraksiyon ( f u ) kuluçka döneminde her iki bölme arasında dengelenir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, çok güçlü bir şekilde bağlanmış bileşikler ( f u ≤% 1), bunlar almoSt tamamen donör odasında sıkışıp kekozu geçirirken etkili değildir. Öte yandan, daha az bağlanmış bileşikler (% 1 &lt; f u &lt;% 100), vakumlu deriye farklı derecelerde difüze olabilir; F u ne kadar yüksek olursa, nekrotik bölgeye daha yoğun nüfuz eder. Protokol, oleik asit ile indüklenen lipid yüklü THP-1 makrofajlarından türetilmiş bir yedek matris ile de kullanılabilir. Lipid vücudu biriktirme indüksiyonu için çeşitli koşullar THP-1s üzerinde test edildi. Bunlara hipoksi, ışınlanmış M. tuberculosis maruziyeti ve mikobakteriyel hücre duvarından türetilen trehaloz 6,6&#39;-dimikolata (TMD) maruz kalma dahildir. 400 uM&#39;lik nihai oleik asit inkübasyon konsantrasyonunun, hücre canlılığı ve yapışmasından ödün vermeden zirve lipid vücudu oluşumunu indüklediği kanıtlanmıştır. 7 Önceden ısıtılmış ortamda oleik asidin seyreltilmesi, maksimumu sağlamak için kritik önem taşıryağlı asit l erime. Elde edilen taşıyıcı matrisi, sırasıyla gerçek caseum, ancak daha yüksek ve daha düşük trigliserid ve protein içeriği, kıyaslanabilir bir kolesterol içeriği vardır. Şekil 3, Şekil 7 olarak vekil matris güçlü bir şekilde caseum bağlanma ile korelasyon için, 18 antitüberküloz bileşiklerin bağlanma. Ayrıca tanımlanmamış bakterisidal aktiviteye sahip, ticari olmayan bileşikleri kapsar yeni bir çalışma, FM türetilen matriks caseum için etkili bir taşıyıcı olduğunu ortaya koymuştur. Hayvan enfeksiyon modelleri için ihtiyacı ortadan kaldırarak 7, taşıyıcı matris başarılı bir şekilde yaparken bu tahlilde verimini artırır daha düşük maliyetli. Bu çok yönlü protokol, aynı zamanda bir çok bileşik, aynı anda (kaset testi) test etmek için de kullanılabilir. Daha önce etkin bir bileşik rütbe bu protokolü kullanarak her insertindeki, 5 uM&#39;de bu test 5 uyuşturucu kombinasyonları, bütün göstermiştirzaman ve malzeme tasarrufu yaparken onların caseum bağlama yatkınlığının esas alınmıştır. örneğin moksifloksasin gibi bir altıncı kontrol bileşiği deneyleri ve caseum / vekil gruplar arasında tutarlılığı sağlamak için bir iç kontrol olarak kaset ilave edilebilir. 7 Önemli olarak, iletişim kuralı, bir 10 mM bileşik stok (bir bileşiğin &lt;&lt; 1 mg) olarak yaklaşık 20 uL çalıştırılabilir. kimyagerler tarama amaçları için her bileşiğin sınırlı miktarda sentez, bu ilaç keşfi sürecinde erken büyük bir avantajdır. KIRMIZI cihaz aparatı otomasyon dostudur; Taban plakasının mikro izi standart 96 oyuklu plakalar işlemek için tasarlanmış otomatik sistemler ile uyumlu hale getirir. Taşıyıcı matris başarıyla ex vivo olarak caseum (Şekil 3) bağlanma özelliklerini taklit etmek için gösterilmiş olmakla birlikte bunun yanlış profil bazı bileşikler olabilir olduğunu kabul eder. THP-1 makrofajlar yaygın olarak kullanılan <eM&gt; in vitro yöntemlerle akciğer dokusunda alveolar makrofajları taklit eder. Bununla birlikte, THP-1&#39;den türetilmiş vekil matrisin, akciğer lezyonlarında nekrotik kaukusta materyal ile aynı kompozisyona sahip değildir. Sonuç olarak, bazı bileşik sınıfları vekil matris ile farklı etkileşime girebilir. Dahası, deneyin başarısı, testik bileşiğin kutupsal matristeki stabilitesi üzerinde şarta bağlıdır. Caseum, birçok bileşeni plazmayla paylaşan biyolojik bir matristir ve bu nedenle bu protokol, birçok plazma bazlı tahlilin olduğu gibi aynı şekilde bileşik bozulma sorunlarına duyarlıdır. Bu açıdan, THP-M-türevi vekil matrisi tercih edilir, çünkü protokoldeki denatürasyon basamağı, enzim aktivitesini ortadan kaldırır ve tahlilin sonunda toplam geri kazanımı iyileştirir. Kaseum vekil bağlanma testi tüberküloz ilaç keşfi için yararlı bir araçtır ve çoklu kurşun optimizasyon programlarında kullanılmaktadır. Ayrıca daha fazla ef tasarımında yardımcı olabilirGüneylilerin kombinasyonu çok lezyon tiplerinin farklı katmanlarına bölüm tek tek ilaçların yeteneğine dayanmaktadır rejimleri. Protokol aynı zamanda ilaç penetrasyon sınırlı ancak başarılı tedavisi için kritik olan lezyon veya apse oluşumu ile karakterize edilmektedir, diğer hastalıklar için ilaç keşfi kolaylaştırmak üzere adapte edilebilir.

akciğer tüberkülozu hastalığının tedavisi lezyonlar farklı içine ilaç etkin dağıtım gerektirir. Nekrotik lezyonlar ve boşluklar ilaç toleranslı veya &#39;kalıcı&#39; bakteri alt-popülasyonunu liman peynir merkez içerir. 1, 2 kaviter hastalık alt kür oranları ve kötü prognoz ile ilişkilidir. 3, 4 önceki çalışmalar caseum nüfuz kabiliyeti önemli ölçüde bir ilaç sınıfı diğerine değişir, nicel ve görüntüleme teknikleri kullanılarak, göstermiştir. 5, 6 Ancak bu yöntemler, yavaş ve zahmetlidir hayvan enfeskiyon modellerinden kullanılmasını gerektirir. Ex vivo olarak caseum bağlanma ilaç ölçen bir in vitro deney tasarlanmıştır. Bu ters nedenle, peynir granülomada ilaç nüfuzunun ile ilişkili ve bulunmuştur bağlanma, birTahmin edici bir araç olarak kullanılmıştır. 7 Dengeleme diyalizi, plazma protein bağlama çalışmalarına altın standart yaklaşım olarak görülür. Hızlı denge diyalizi (RED) cihazı, bu tür testleri gerçekleştirmek için hızlı, kullanımı kolay ve güvenilir bir sistem sağlar. 8 Cihaz iki bileşenden oluşur: yarı geçirgen zarın dikey bir silindiri ile ayrılmış 2 hazneden oluşan tek kullanımlık, tek kullanımlık uçlar; Ve aynı anda 48 ek parça tutabilen tekrar kullanılabilir taban plakaları. Diyaliz membranı, ilaç-makromolekül bağlama çalışmaları için ideal olan 8 kDa moleküler ağırlıklı bir kesime (MWCO) sahiptir. Membran kompartmanının yüksek yüzey alanı / hacim oranı, hızlı diyaliz ve dengeleme sağlar. Hem ekler hem de taban plakası, asgari spesifik olmayan bağlanma için onaylanmıştır. RED cihazının biyoanalitik tekniklerle kombinasyonu, ilaçların bağlanmamış fraksiyonlarının kesin tahminlerini plasma. 8 , 9 Başlangıçta plazma protein bağlanmasını ölçmek için tasarlanmış olmasına rağmen, RED cihazı homojenatları kullanarak çeşitli doku bağlama çalışmalarında kullanılmıştır. 10 , 11 Bu protokolde, tüberkülozla enfekte tavşanların nekrotik lezyonlarından ve boşluklarından eksize edilen nekrotik çöpler, kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçüyoruz. Caseus materyalinin asellüler ve non-vascular özelliği, tahlil ile uyumlu homojen bir süspansiyona homojenleştirilmesini kolaylaştırır. Kaseum üretmek için sıkıcı ve zor gelmesi nedeniyle, protokol de köpüklü makrofajlardan hazırlanan bir vekil matris ile kullanım için onaylanmıştır. THP-1 monosit türevi makrofajlar, onlara &#39;köpüklü&#39; görünüm veren çoklu lipid cisimcikleri biriktirmek için oleik asit ile indüklenir. Bu lipit yüklü hücreler hasat edilir veBiz caseum için bir ikame olarak kullanmak, bir matris üretmek üzere işlenir. Bu çalışma, bu taşıyıcı matris etkin bir granülomlar ve boşlukların peynir çekirdek ilacın nüfuz etmesine engel in vivo işlemi taklit caseum bağlanma ile iyi bir korelasyon ile bağlanan ilaç göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&amp;sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&amp;nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

Tüberküloz hastalığının ortadan kaldırılması, kompleks pulmoner lezyonların çok katmanına nüfuz edebilen ilaç rejimleri gerektirir. Çukurların ve lezyonların kazeöz damarlarındaki ilaç dağılımı, özellikle persistan olarak da adlandırılan uyuşturucuya dirençli bakterilerin alt popülasyonlarını barındırdığı için çok önemlidir. Tüberküloz lezyonlarında ilaç penetrasyonunun ölçülmesine ilişkin mevcut metotlar, biyoanalitik veya görüntüleme teknikleriyle birleştirilen yüksek maliyetli ve zaman alan in vivo farmakokinetik çalışmaları içerir. Kozmetik makromoleküllere bağlanan ilacın in vitro ölçümü, bu tür teknikler için bir alternatif olarak önerildi çünkü bu bağlanma, ilaç moleküllerinin kaseum yoluyla pasif difüzyonunu engelledi. Hızlı denge diyalizi plazma proteini ve doku bağlama çalışmalarında hızlı ve güvenilir bir sistemdir. Bu protokolde, kazanın homojenatlarına ilaç bağlanmasını ölçmek için hızlı denge diyaliz (RED) cihazı kullandık.Tüberküloz ile enfekte tavşanların lezyonlarından ve boşluklarından türetilmiştir. Protokol ayrıca, kaseum yerine kullanılacak lipid yüklü THP-1 makrofajlarından bir vekil matrisi nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu kaseum / vekil bağlanma testi, tüberküloz ilaç keşfi için önemli bir araçtır ve lezyonlarda veya apselerde diğer hastalıkların yol açtığı ilaç dağılımının araştırılmasına yardımcı olmak için uyarlanabilir.

Bu protokolü kullanarak, yüzlerce tüberküloz ilaç geliştirme bileşiğini penetran kaseumda tahmin edilen etkinlikleri için test ettik. Şekil 1 , RED testinin temel kavramlarını görüntüler. RED eklentilerinin diyaliz zarları bağlanmamış kük moleküllerin donör kuyudan alıcı kuyusuna dağılmasına ve son olarak da her iki bölme arasında denge elde edilmesine olanak tanır. Proteinler veya lipidler gibi makromoleküllere bağlı olan küçük moleküller donör kuyusuna sıkışır. Her iki kompartmandan alınan numunelerin kantitatif analizi, kaseum veya vekil matristeki her bir küçük molekülün bağlanmamış fraksiyonunun ( f u ) hesaplanmasına izin verir. Bu fraksiyonun in vivo olarak kazein içerisindeki ilaç penetrasyonu ile doğrudan ilişkili olduğu gösterilmiştir. 7 Şekil 2&#39;de MALDI (Matrix yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon) kütle spektrumuMetri görüntüler, f u ne kadar yüksekse, ilacın cageum&#39;a yayılması o kadar yoğun olur. Dolayısıyla, bu, ilaç moleküllerinin lezyonun hücresel katmanlarıyla olan arayüzünden kaseumun dış kenarına dağıldığı için, kutupsal makromoleküllere bağlanarak ilacın kopyalanması, bunun da kasede çekirdeğe daha da yayılmasını önleme hipotezi ile uyuşmaktadır. 18 anti-tüberküloz ilaçtan oluşan bir örnek panel, her iki kaseumda ve vekil içindeki f u ile birlikte Tablo 1&#39;de listelenmiştir. Şekil 3&#39;te görüldüğü gibi, THP-1&#39;den türetilen köpük makrofajlardan hazırlanan matris, gerçek kaküm için etkili bir yedektir. Her iki matristeki bağlanma, birbiriyle kuvvetli bir şekilde ilişkilidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig1.jpg" /> Şekil 1: KIRMIZI tahlilin illüstrasyonu. Kuluçka süresince, makromoleküllere bağlı olmayan ilaç molekülleriMatris diyaliz membranı boyunca yayılır. Zamanla hem verici hem alıcı kuyularında bağlanmamış ilaç moleküllerinin konsantrasyonu arasında bir denge kurulur. Tüm makromoleküller (proteinler, lipidler, vb. ) Ve bağlı ilaç molekülleri donör odasında sıkışır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55559/55559fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig2.jpg" /> Şekil 2: İn vivo ilaç penetrasyonu. Altı anti-tüberküloz ilaç için MALDI (matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon) kütle spektrometresi görüntülemesiyle saptanan in vivo fraksiyona bağlı fraksiyon ile farezus içine difüzyon arasındaki ilişki. İyon haritaları, temsili akciğer lezyonlarından oluşur ve sinyal yoğunluğu soldaki ölçek çubuğu ile gösterilir. &#39;H<html> Bitişik kesitlerin ematoksilin ve Eozin (H &amp; E) boyaması iyon haritalarının altında gösterilmektedir. Siyah / beyaz kontur çizgileri, her lezyonun çürük ortasını vurgular. Sarathy ve diğerlerinin izniyle yeniden basıldı (adapte edildi). 7 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55559/55559fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig3.jpg" /> Şekil 3: Cageumdaki anti-tüberküloz ilaçlarının ve vekil matrisin bağlanmamış fraksiyonları ( f u ) arasındaki korelasyon. En uygun çizgi doğrusal regresyon kullanılarak belirlendi. Uygunluk iyiliği R2 değeri olarak ifade edilir. Sarathy ve diğerlerinin izniyle yeniden basıldı (adapte edildi). 7K &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td> Caseum f u (%) </td><td> Vekaletname (%) </td></tr><tr><td> Etambutol </td><td> 35.2 ± 4.4 </td><td> 38.8 ± 5.6 </td></tr><tr><td> İsoniazid </td><td> &gt; 99.9 </td><td> &gt; 99.9 </td></tr><tr><td> Asetil-izoniazid </td><td> &gt; 99.9 </td><td> &gt; 99.9 </td></tr><tr><td> P- aminosalisilik asit </td><td> 54.7 ± 1.4 </td><td> 51.1 ± 11.2 </td></tr><tr><td> Rifampisin </td><td> 5.13 ± 0.2 </td><td> 7.3 ± 0.6 </td></tr><tr><td> rifapentine </td><td> 0.5 ± 0.1 </td><td> 1.1 ± 0.1 </td></tr><tr><td> Moksifloksacin </td><td> 13.5 ± 3.7 </td><td> 16.8 ± 1.8 </td></tr><tr><td> Levofloksasin </td><td> 8.34 ± 0.4 </td><td> 16.3 ± 3.1 </td></tr><tr><td> gatifloksasin </td><td> 16.3 ± 4.2 </td><td> 18.8 ± 2.9 </td></tr><tr><td> linezolit </td><td> 29.3 ± 3.6 </td><td> 27.9 ± 2.2 </td></tr><tr><td> Posizolid </td><td> 10.7 ± 1.7 </td><td> 17.6 ± 4.5 </td></tr><tr><td> Sutezolid </td><td> 30.1 ± 8.7 </td><td> 21.7 ± 1.7 </td></tr><tr><td> Radezolid </td><td> 5.2 ± 0.8 </td><td> 7,6 ± 1,9 </td></tr><tr><td> Tedizolid </td><td> 8,8 ± 1,8 </td><td> 13.7 ± 2.7 </td></tr><tr><td> Clofazimine </td><td> &lt;0.01 </td><td> &lt;0.01 </td></tr><tr><td> Bedaquiline </td><td> &lt;0.01 </td><td> &lt;0.01 </td></tr><tr><td> PA-824 </td><td> 7.31 ± 2.2 </td><td> 3.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> OPC67683 </td><td> 0.04 ± 0.02 </td><td> 0.02 ± 0.002 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Kaseumda test edilen 18 TB ilaçların fraksiyonu bağlanmamış ( f u ) ve vekil bağlanma testi. Tüm sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir. Sarathy ve diğerlerinin izniyle yeniden basıldı (adapte edildi). 7

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions at JoVE.com

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Burada pulmoner tüberküloz lezyonlarından ve boşluklardan alınan kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçmek için hızlı bir denge diyaliz (RED) yöntemi anlatılmaktadır. Protokol, aynı zamanda, kaseum için etkili bir vekil olan köpüklü makrofaj kaynaklı bir matriste de kullanılır.

bir<em&gt; In vitro</emTüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Öngören Caseum Bağlanma Testi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Nonlinear Pharmacokinetics

Introduction to Respiratory System Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

11.6K Görüntüleme.  Rutgers.  Burada pulmoner tüberküloz lezyonlarından ve boşluklardan alınan kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçmek için hızlı bir denge diyaliz (RED) yöntemi anlatılmaktadır. Protokol, aynı zamanda, kaseum için etkili bir vekil olan köpüklü makrofaj kaynaklı bir matriste de kullanılır. 

Video: An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Tıp

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mycobacterium abscessus için Çift Raportör Kullanarak Yüksek Verimli Tarama Testi

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: M. abscessus Tedavilerinin Etkili Keşfi için Ölçeklenebilir İlaç Tarama Protokolü

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme