This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.

1. Bakterienstamm und Wachstumsmedium <ol><li> Make-Albumin-Dextrose und Salz-Stammlösung (ADS) durch Solubilisieren von 25 g Rinderserumalbumin, 10,0 g Dextrose und 4,05 g Natriumchlorid in 460 ml deionisiertem Wasser. Filter-Sterilisieren der ADS und lagere bei 4 ° C. </li><li> Make 7H9 Brühe durch Zugabe von 4,7 g 7H9 Pulver und 2 ml Glycerin zu 900 ml gereinigtem Wasser. Autoklaviert die 7H9-Bouillon bei 121 ° C für 10 min und läßt es vor dem Fortfahren auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Machen 7H9ADST durch Zugabe von 100 ml ADS und 0,5 ml Tween 80 bis 900 ml 7H9-Bouillon. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Man wiegt 50 mg Kanamycinsulfat und löst in 1 ml entionisiertem Wasser; die Endkonzentration beträgt 50 mg / mL. Filter-sterilisiert und bei -20 ° C. In 0,5 ml Kanamycin Stammlösung pro 1 l 7H9ADST. HINWEIS: Dieses Medium sollte frisch hergestellt werden, so skaliert die Volumina in geeigneter Weise entsprechend der Kultur Größe. </li><li> Wachsen M. tuberculosis in 7H9ADST mit Kanamycin in Kultur steht. Schütteln Sie die Kultur täglich und verdünnen Sie es, bevor die OD 600 1,0 erreicht Verklumpen zu vermeiden. HINWEIS: Der Stamm M. tuberculosis für die Entwicklung dieses Verfahrens verwendet H37Rv wurde mit Plasmid pJAK2.A 12 umgewandelt. pJAK2.A ist ein integratives Plasmid basiert auf dem Vektor pMV361, die aus dem hsp60 Promotor Expression auf hohem Niveau des Glühwürmchen - Luciferase - Gens ermöglicht , und kann unter Verwendung von Kanamycin selektiert werden. </li></ol> 2. THP-1 Medium und Wartung <ol><li> Fügen Sie 50 ml hitzeinaktiviertem fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml 200 mM L-Glutamin und 500 ml RPMI 1640-Medium RPMI unvollständig (ca. 10% FBS und 2 mM Glutamin) zu machen. </li><li> Pflegen einer THP-1 - Zellkultur nach Standardprotokoll 13. THP-1-Zellen in RPMI unvollständigem Medium kurz, wachsen, während eine Zelldichte von 0,2 bis 1 Million pro ml Medium zwischen pas AufrechterhaltenWeisen. </li></ol> 3. Hochdurchsatz - Screening intrazellulärer Mit Luziferase-exprimierenden M. tuberculosis H37Rv <ol><li> Die optische Dichte einer aktiv wachsende Bakteriensuspension in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm. Berechnen Sie die Bakteriendichte unter Verwendung des Umwandlungsfaktors von 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 Bakterien pro ml. </li><li> Pipette aus genügend Bakterien für eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 10: 1 in ein neues Zentrifugenröhrchen. Pelletieren bei 3.000 × g für 10 min und aspirieren die Flüssigkeit. In 50 ul Humanserum zu 450 ul RPMI1640. Skalieren Sie die Lautstärke auf die entsprechenden Werte für das Experiment. </li><li> Um die Bakterien zu opsonieren, das Pellet bei einer Dichte von 1 x 10 8 Bakterien pro 500 ul RPMI1640 , das 10% Humanserum. Lassen Sie die Mischung bei 37 ° C für 30 min inkubieren. Bestimmen Sie die THP-1-Zellkulturdichte, indem sie mit einem Hämocytometer gezählt und ein invertiertes microscope. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen in sterilen Zentrifugenröhrchen bei 100 x g und 37 ° C für 10 min. Aspirieren den Überstand und die Zellen in RPMI unvollständig in einer Dichte von 1 Million Zellen pro ml. Hinzufügen Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) zu einer 40 ng / ml Endkonzentration. Hinweis: Dies wird als Mix Differenzierung bezeichnet werden. </li><li> Kombinieren opsonisiertes M. tuberculosis mit THP-1 Differenzierungs Mischung bei einer MOI von 10: 1 und aliquotieren die Endmischung bei 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung in einer 96-Well - Flachboden - weißen Platte. Regelmäßig rühren Sie die Mischung Einheitlichkeit zu gewährleisten. Ermöglicht die Differenzierung und die Infektion fortschreiten über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 100 &amp; mgr; l RPMI jeder. Fügen Verbindungen auf die gewünschten Konzentrationen in RPMI verdünnt unvollständig und inkubiere 3 Tage lang. </li><li> Aspirieren das Medium aus den Vertiefungen. Zugeben von 50 &amp; mgr; l Luciferase-Assay-Reagens in jede Vertiefung. Abdichten der Platten mit transparent Klebeplatte Versiegelungen. Sie 5 min Inkubation bei 22 ° C und dann eine Anzeige in einem Luminometer bei 1 s pro Vertiefung erhalten. </li></ol> 4. Die Zytotoxizität Analyse unter Verwendung eines 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay 14 <ol><li> Differenzieren THP-1-Zellen in RPMI unvollständig mit 40 ng / ml PMA in klaren 96-Loch-Platten, ergänzt. Achten Sie auf eine Zelldichte von 1 Million pro ml und aliquote 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung. Ermöglicht die Differenzierung über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 fortschreiten. </li><li> Aspirieren das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie sie zweimal mit RPMI 1640. Verbindungen in RPMI zu den Vertiefungen unvollständig verdünnt hinzufügen. Inkubieren für 3 Tage. </li><li> Man löst 0,5 g MTT in 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um eine Stammlösung von 5 mg machen / mL. Sterile Filter und Lagerung bei -20 ° C, vor Licht; ist es am besten diese Lösung frisch zu machen. </li><li> 2,5 h vor deme das Ende der Inkubationszeit 3-Tag, fügen Sie in jede Vertiefung 25 ul MTT-Lösung und die Inkubationszeit abzuschließen. </li><li> Bereiten 50% N, N-Dimethylformamid (DMF) durch Mischen von 250 ml DMF mit 250 ml deionisiertem Wasser. </li><li> Bereiten MTT-Extraktionspuffer, wie folgt: Man wiegt 100 g SDS in einer 500-ml-Flasche und 300 ml 50% DMF. Anwenden niedrige Hitze der SDS zu ermöglichen aufzulösen. 10 ml reiner Essigsäure und 12,5 ml 1 M HCl. Füllen bis zur 500 ml-Markierung mit 50% DMF; die endgültige Zusammensetzung des Extraktionspuffers beträgt 50% DMF, 20% SDS, 2,5% Essigsäure und 2,5% 1 M Salzsäure. </li><li> Am Ende der Behandlungszeit wird mit 100 &amp; mgr; l Extraktionspuffer (erwärmt auf 45 ° C keine Kristalle aufzulösen) in jede Vertiefung. Lassen Sie die Mischung über Nacht bei 37 inkubieren ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. Die Absorption bei 570 nm. HINWEIS: Der Zytotoxizitätstest wird am besten parallel durchgeführt mit einem intrazellularenular Bildschirm samt-Charge und das Alter der THP-1-Zellen. </li></ol> 5. In-Brühe Mit Aktivitätsanalyse einer Resazurin - Assay 3 <ol><li> Wächst M. tuberculosis in 7H9ADST zur mittleren log - Phase (~ 0,5 bis 0,8 OD 600). Verdünne die Kultur mit dem 7H9ADST bis 0,01 OD 600. Verdünne die Verbindungen in 7H9ADST die Testkonzentrationen und Aliquot 100 &amp; mgr; l der verdünnten Verbindung in jede Vertiefung auf 2x. </li><li> Übertragung von 100 &amp; mgr; l der verdünnten Bakteriensuspension in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platten für 5 Tage bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Man löst 10 mg Resazurin in 100 ml deionisiertem Wasser und Sterilfilter. </li><li> In 30 ul Resazurin-Lösung und überwacht die Farbänderung nach 48 h; Bakterienwachstum wird durch eine Farbumwandlung von blau angezeigt rosa. ANMERKUNG: Eine quantitative Analyse kann auch durch das Messen entweder die Fluoreszenz bei 590 nm mit einer Anregung bei 530 durchgeführt werden - 560nm oder das Absorptionsvermögen bei 570 nm und 600 nm 15. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests for this work.

Verwendung eines menschlichen intrazellulären Infektionsmodell für M. tuberculosis Das Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und kostengünstiges HTS - Verfahren zu erstellen. Tuberkulose ist ein Mensch durch die Infektion von Alveolarmakrophagen gekennzeichnet Krankheit , die durch M. tuberculosis. Aufgrund Fragen der biologischen Sicherheit, Forschung sowohl biologische Modelle des Bakteriums und die Wirtszellen beteiligt hat in der Vergangenheit verwendet worden. Allerdings hat es sich gezeigt , dass die Verwendung von Surrogat - Bakterien und nicht-menschlichen Modelle schlechte Prädiktoren der Hit-to-Lead - Erfolg in der Medikamentenentwicklung sind, was darauf hinweist , dass Arzneimittel - Screening am besten mit menschlichen Zellen infiziert mit M. tuberculosis 19, durchgeführt wird 20, 21, 22. In diesem Verfahren haben wir fortschrittliche und aktuelle state-of-the-art-Screening-Protokolle für die menschliche Makrophagen-ähnliche THP-1-Zelllinie angepasst. Um zu erreichen, HochDurchsatz führten wir mehrere technische Verbesserungen an der Infektion Protokoll. In erster Linie ersetzt wir alle Schritte in CFU Bestimmung beteiligt und ersetzt sie mit einem Luciferase-basierten Reportersystems. Glühwürmchen-Luciferase wurde aufgrund der einfachen Endpunktassay ausgewählt, die einen schnellen Abbau durch Wirtszelle Lysosom Enzyme und die minimalen Anforderungen an die Ausrüstung. Diese Substitution wirksam beseitigt eine 30 Tage Inkubationszeit, sowie die Arbeits- und Verbrauchskosten im Zusammenhang mit Überzug und kolonie Zählschritte. Eine zweite große Verbesserung, die wir eingeführt wurde Batch-Verarbeitung und Infektion, die weiter den Durchsatz und die Kohärenz zwischen den Vertiefungen mit einem einfacheren Infektion Protokoll verbessert. Durch die Kombination der Differenzierung und Infektionsschritte in einem einzigen Schritt, wir waren in der Lage, das Protokoll um einen Tag zu verkürzen. Zugleich konnten wir die drei Runden des Waschens reduzieren, die normalerweise zwischen Differenzierung und infectio auftreten würden,n, die eine Quelle für möglichen THP-1-Zellverlust aufgrund von Ablösung ist. Dieses Protokoll wurde für das Screening in der THP-1-Zelllinie entwickelt, die mehrere Vorteile verleihen. THP-1, als immortalisierte Zelllinie kann für mehr als 20 Passagen 23 in vitro kultiviert werden zuverlässig. Dies ist besonders wichtig für große Screening-Kampagnen, in denen es schwierig sein kann, genügend Zellen zur Aufrechterhaltung einer Hochdurchsatz-Einrichtung zu liefern. Zusätzlich Tests in THP-1 bieten einen homogenen genetischen Hintergrund, die Variabilität der Ergebnisse minimiert. Dies ist zum Testen von Verbindungen , die sehr vorteilhaft Antworten Wirtszelle 10 zu beeinflussen. Als zusätzlichen Bonus, die Genexpression in der THP-1 - Zelllinie kann durch small interfering RNAs (siRNAs) 24 nach unten reguliert werden. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug für die nachfolgenden Untersuchungen über die Wirkungsweise der Trefferverbindungen. Auch wenn dieses Verfahren wurde unter Verwendung von THP-1-Zellen, eskann leicht für humane primäre Zellen, wie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) angepasst werden, wie zuvor 10 gezeigt wurde. Um am besten die tatsächliche Interaktion zwischen Alveolarmakrophagen und M. tuberculosis nachahmen, das intrazelluläre Assay - Protokoll enthält einen Schritt um die Bakterien opsonieren. Opsonisierung mit humanem Serum Coats M. tuberculosis und erleichtert den Zelleintritt über Komplement - Rezeptor 3 (CR3) 25. Naked Bakterien sind eher Makrophagen über die Lektin - Rezeptor 8 einzugeben. Da der bronchoalveolären Flüssigkeit bekannt ist , Komponenten von humanem Serum enthalten 25, Opsonisierung, oder das Fehlen davon, kann einen wesentlichen Einfluss auf das Ergebnis haben Screening. Jedoch können einige, wählen Sie diesen Schritt , um überspringen den Infektionsprozess 16 weiter zu vereinfachen, oder es kann genug menschliches Serum zu erhalten , aufgrund der Größe des li nicht machbarbliothek gescreent 11 ist. Die intrazelluläre Assays umfasst einen Schritt, um alle Flüssigkeit, enthaltende ungebundenes Material aus den Vertiefungen vor der Zugabe der Luciferase-Reagenz zu entfernen. Dieser Schritt ist so konzipiert, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen, während die Menge Reagenz pro Vertiefung verwendet reduzieren. Da jedoch kann die Einbeziehung dieses Schrittes erzeugt falsch-positive Daten für die Verbindungen , die THP-1 , aber nicht zu töten M. tuberculosis, freistehend und lysiert THP-1 und frei schwebender M. tuberculosis entfernt werden würden. Daher soll die Hersteller vorgeschlagenen Protokoll des Hinzufügens von gleichen Mengen an Luciferase - Reagens (100 ul) in jeder Vertiefung , um M. tuberculosis Überleben in Vertiefungen , die zytotoxischen Verbindungen zu testen , gefolgt werden. Im Gegensatz zu dem Glühwürmchen - Luciferase - System, wird das bakterielle lux - System erfordert keine externen Reagenzien zur Signalerzeugung 26. Aber,das Glühwürmchen - System wird über das lux - System aus den folgenden Gründen bevorzugt: Erstens, das bakterielle System in Mycobakterien 26 toxisch sein kann. Zweitens, ein komplexeres Reportersystem (5 lux - Gene für gegen 1 Gen für Firefly) ist anfällige Inhibierung durch Testverbindungen zu signalisieren. Schließlich, im Handel erhältliche Reagenzien für die Glühwürmchen-Luciferase-Assays zur Verfügung stellen, die notwendigen Voraussetzungen für eine optimale Signalerzeugung. Auf der anderen Seite stützt sich die bakterielle Luciferase-System an die ATP-Produktion und die Cofaktoren im Inneren der Bakterien für die Signalerzeugung. Diese können variieren zwischen den verschiedenen Behandlungen und sind nicht so leicht zu kontrollieren. Daher normiert die Zugabe des Luciferase-Reagens zu dem Firefly-System, die Reaktionsbedingungen und liefert zuverlässigere Messungen der Luziferase-Aktivität in allen Behandlungen. CFU Bestimmung hat seine lange der Goldstandard Bakteriendichte zur Quantifizierung. Im Vertrag, Bioluminescence, wie die meisten Reporter, ist kein direktes Maß für Bakterien. Stattdessen ist RLU eine Funktion sowohl der CFU und der Stoffwechselzustand der Bakterien. Andere haben 5 die meist lineare Beziehung zwischen RLU und CFU für Biolumineszenz Mykobakterien unter bestimmten Bedingungen unter Beweis gestellt. In jedem Fall wird eine deutliche Verringerung des Luciferase - Assay - Signal, unabhängig von den zugrunde liegenden Ursache-andere als die tatsächliche Hemmung der Luciferase-Enzymaktivität würde eine Verringerung der M. tuberculosis Fitness innerhalb der Wirtszelle an. Daher würden diese Verbindungen von Interesse aus einem Screening Standpunkt Droge und nicht in der Methodenentwicklung ausgeschlossen werden sollen. Eine Alternative zu dem Luciferase-basierten Screening - Protokoll intrazellulär ist die automatisierte Fluoreszenzmikroskopie-basierter Ansatz 11, 27, 28, 29. die LuciferaseAssay-Ausgang wird mit einem Luminometer gemessen und die erhaltenen Daten sind quantitative, während Fluoreszenzmikroskopie erzeugt Bilder, die qualitativ sind. Jedoch durch geschickte Computerprogrammierung, können Bilder quantitative Daten zu erzeugen, werden analysiert. Darüber hinaus ermöglicht Fluoreszenzmikroskopie mehr Fluorophore gleichzeitig verwendet werden, die für das Sammeln wertvolle Parameter wie die Lebensfähigkeit der Zellen, Zellzahl und tatsächliche Infektionsrate sehr hilfreich ist. Wie könnte man vorhersagen, kommen diese Vorteile mit einigen Rückschlägen. Die anfängliche Investition auf automatisierten Fluoreszenzmikroskopie Ausrüstung ist ein Vielfaches größer als die Kosten eines Luminometers oder Fluorometer und ist daher außerhalb der Reichweite für viele Forschungslabors. Für diejenigen, die Zugang zu den Geräten haben, muss die Probenverarbeitung in Betracht gezogen Bildaufnahme und Datenanalyse vor werden. Diese beiden Schritte wirken sich auf den gesamten Zeitaufwand mit einem Anstieg der Größe der Bibliothek. Die Aufnahme zusätzlicher Fluoreszenzmarkierungen in Wirtszellen requires Fixierung, Färbung und Waschschritte, wodurch zusätzliche Benutzereingriff und Zeit Investitionen erforderlich macht. Darüber hinaus Fluoreszenzmikroskopie Datenerfassung und -analyse, obwohl automatisiert, erfordern immer noch deutlich mehr Zeit und Ressourcen als die einfache Luciferase-Assay-Anzeige. Daher ist das Luciferase-Reporter-basierte intrazellulärem Screening-Verfahren einfacher und in der Lage eines höheren Durchsatz. Die Luciferase-basierte intrazellulärem Screeningverfahren haben eine erhebliche Einschränkung im Vergleich zu dem Fluoreszenzmikroskop-basierte Screening-Verfahren. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass die Luciferase-Assay keine Daten in Bezug auf den Gesundheitszustand der Host-Makrophagen zur Verfügung stellt. Zytotoxische Verbindungen würden den Tod von Makrophagen bewirken, und somit können lebende Bakterien in das Medium freigesetzt werden würde, und auf die endgültige Luciferasetest Signal nicht mehr beitragen. Als Ergebnis scheinen zytotoxische Verbindungen , den Tod von intrazellulärem M. tuberculosis zu verursachen und somit generatea große Anzahl von Fehlalarmen. Um dieses Problem zu beheben, haben wir unsere Methode mit einem MTT-Test ergänzten die Zytotoxizität von Verbindungen auf Host-Makrophagen zu bewerten. Dieses Modul des Screening-Verfahrens gibt uns zusätzliche Informationen über die drugability von Verbindungen von Interesse und ermöglicht die frühzeitige Beseitigung von weniger als idealen Wirkstoffkandidaten. Alternativ kann man auch den Luciferase-basierten Assay intrazellulärem Vorbenutzung automatisierten Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wird. In Bildschirmen von großen Substanzbibliotheken ermöglicht dies für die schnelle und effiziente Bewertung der Verbindung Wirksamkeit in dem Makrophagen-Infektionsmodell. Als Ergebnis kann automatisierte Fluoreszenzmikroskopie für detaillierte Studien über bessere Kandidaten reserviert werden, wie in 11 durch eine zuvor veröffentlichte Studie dargestellt. Die niedrig Kosten und einfache Art des Luciferase-basierte intrazellulären Assays auch stark profitieren Forscher, die kleinen testen wollener chemische Bibliotheken. Insgesamt hat sich die Luciferase-basierte intrazellulären Assays bewiesen ein äußerst flexibles Werkzeug für die Forschung sein Labors aller Kaliber und für Projekte in verschiedenen Größen Screening.

Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose (TB) ist eine führende Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Arzneimittelempfindlichen TB ist eine behandelbare Krankheit, die für einen Zeitraum von 6 Monaten mehr Antibiotika erfordert. Trotz einer behandelbaren Krankheit zu sein, wurde TB Sterblichkeit schätzungsweise 1 1,5 Millionen im Jahr 2015 sein. In den letzten 10 Jahren wurden dort zunehmende Besorgnis über die Verbreitung von arzneimittelresistenten Tuberkulose M.. Mehrfach arzneimittelresistenter Tuberkulose (MDR-TB) als TB definiert, die mindestens Isoniazid (INH) und Rifampicin (RMP) beständig ist, und die meisten MDR-TB-Stämme sind auch resistent second-line TB Medikamente auszuwählen, wodurch Behandlungsoptionen Zu . Die Auswirkungen von Medikamentenresistenz eine größere Herausforderung für die Behandlung von Patienten schaffen-Koinfektion mit Human Immunodeficiency Virus (HIV); 400.000 Patienten starben weltweit von HIV-assoziierten TB im Jahr 2015 1. Enttäuschend, den Vereinigten Staaten Food and Drug AdministRation hat nur eine neues TB - Medikament gegen MDR-TB, Bedaquilin, in den letzten 40 Jahren 2 genehmigt. Die Fortschritte bei der Suche nach besseren und kürzeren TB-Therapien sind dringend erforderlich, um vorne zu bleiben im Kampf gegen TB und MDR-TB. Traditionell TB Arzneimittel Bildschirme sind unter in vitro - Wachstumsbedingungen in einem Wachstumsmedium durchgeführt, wobei Verbindungen zu einer wachsenden Kultur und ihre Wirksamkeit hinzugefügt werden die Mikroorganismen bei der Beseitigung der durch Zählen koloniebildenden Einheiten (CFU) auf einem festen Medium bestimmt. Als Keimzahlen arbeitsintensiv, zeitraubend und teuer werden verschiedene indirekte Methoden, um dieses Problem zu lindern entwickelt. Solche Verfahren umfassen die Lebensfähigkeit Alamar - Blau - Assay 3, die Bestimmung der Fluoreszenz 4 von grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder Lumineszenz 5 von Luciferase-exprimierenden Bakterien, und die Schätzung der Gesamt Adenosintriphosphat (ATP) 6, 7. Typische TB wird durch eine Infektion mit M. tuberculosis der Lunge charakterisiert, in dem sich die Bakterien befinden , und im Inneren der Phagosomen von Alveolarmakrophagen 8 nachzubilden. Die einfache in-Brühe kann phänotypische Bildschirm extrazelluläre Erreger passen; jedoch in der historischen Perspektive getroffen Verbindungen gegen M. tuberculosis diese Methode oft identifiziert verwenden , nicht die Erwartungen bei der nachgeschalteten Validierungsschritten in Infektionsmodellen zu entsprechen . Wir schlagen vor, dass TB Medikament am besten in einem intrazellulären Wirtszelle Infektionsmodell durchgeführt wird. Dennoch besitzen die intrazelluläre Modelle viele technologische und biologische Barrieren für Hochdurchsatz-Screening (HTS) Entwicklung. Eine große Hürde ist die Komplexität des Infektionsprozesses, beispielhaft durch zahlreiche Schritte und die aufwendigen Entfernung von extrazellulären Bakterien, die durch in-zwischen dem Waschen. Eine zweite große Hürde ist die lange Zeit rederungen, als Wachstumserkennung erfolgt normalerweise durch Zählen CFU auf Kulturplatten, ist ein Prozess, vervollständigen über 3 Wochen dauert. Eine Lösung für CFU Zählungen ersetzt wurde durch automatisiertes Fluoreszenz-Mikroskopie in Kombination mit fluoreszierenden Bakterien bereitgestellt. Jedoch erfordert diese Lösung eine Erstausrüstung Investition, die für viele Forschungslabors außer Reichweite ist. Eine einfache, kostengünstige und krankheitsrelevanten HTS Verfahren würde die Drug Discovery-Prozess erheblich verbessern. In dieser Studie berichten wir über ein neues, modulares HTS - System , das auf der Bereitstellung eine schnelle und hochskalierbaren, noch wirtschaftlich, Assay geeignet zur Bestimmung der Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis gerichtet ist. Dieses System besteht aus drei Modulen: (i) intrazelluläre, (ii) die Zytotoxizität und (iii) in-Broth-Assays. Das kombinierte Endergebnis liefert eine umfassende Beschreibung der Verbindung Eigenschaften, mit zusätzlichen Informationen in Bezug auf die mögliche Wirkungsweise. diese screening System in mehreren Projekten mit verschiedenen Substanzbibliotheken verwendet worden ist, die Wirkungsweise zielen, einschließlich der Analyse von Arzneimittel Synergie 9, -secreted die Stimulation von autophagy 10 und die Hemmung von M. tuberculosis Virulenzfaktor (nicht veröffentlicht). Verbindungen unbekannter Wirkungsweise haben auch 11 untersucht worden. Eine modifizierte Version dieses Verfahrens wurde auch durch unsere Industriepartner als primäre Screening - Verfahren zur Identifizierung neuer Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis 11 angenommen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>271210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween80</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine pH7</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Hydrocholoric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>351279212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>351269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M. tuberculosis H37Rv</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom white plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95-well flat bottom clear plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Tropix TR717</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

system for efficacy and cytotoxicity screening of inhibitors targeting intracellular mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Hochdurchsatz - Screening unter Verwendung von intrazellulären M. tuberculosis exprimieren das Luciferasegen 2A und Tabelle 1 enthalten die Rohdaten von dem Luminometer gesammelt, in relativen Lumineszenz - Einheiten ausgedrückt (RLU), zeigen die Wirkung einer Erhöhung der Konzentration des Arzneimittels TB Rifampicin auf M. tuberculosis innerhalb THP-1 - Zellen. 2A ist ein Streudiagramm der rohen Lumineszenz gemessen in RLU für verschiedene Konzentrationen von Rifampicin. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). 2B zeigt die prozentuale Verringerung der Lumineszenz in behandelten Wells im Vergleich zu den unbehandelten Vertiefungen. Die Daten zeigen , dass Rifampicin reduzieren&gt; 99,9% RLU aus intrazellulären M. tuberculosis in einer Konzentration von 0,1 ug / ml der Lage ist. Dies ist in Übereinstimmung mit dem previously veröffentlicht MIC zwischen 0,1 und 0,4 &amp; mgr; g / mL 16. Lumineszenz in jeder Vertiefung erzeugt wird , ist ein Hinweis auf die Gesamt - Luciferase ausgedrückt durch M. tuberculosis und ist somit ein Indikator für die Stoffwechsellage von M. tuberculosis in der gut. Es ist normal für rohe Leuchtstufen zwischen den Experimenten zu variieren. Als solches würde ein Vergleich der Rohdaten unzuverlässig Schlussfolgerungen erzeugen. Somit sollten die Daten gegen eine definierte negative Kontrolle normalisiert werden, die die Proben mit nur DMSO behandelt würden. Die resultierenden Werte können ausgedrückt werden als die prozentuale Verringerung in M. tuberculosis in den Vertiefungen (2B). Zytotoxizität Analyse unter Verwendung der MTT-Assays Der MTT-Test ist eine gut etablierte Assay für eukaryotische Zytotoxizität. Dieser kolorimetrischen Test zeigt lebende Zellen durch die Umwandlung von MTT (gelb) zupurpurfarbene Formazan. Dieser Assay ist ohne eine M. tuberculosis - Infektion durchgeführt , weil die Bakterien metabolisieren MTT fähig sind, die die beobachtete Toxizität der Verbindungen reduziert. Ein üblicher Vorschlag für die MTT - Assay beruht auf der Absorption bei 570 nm 17 Medien ohne den pH - Indikator Phenolrot zu verwenden. Jedoch ist das angesäuerte Extraktionspuffer in diesem beschriebenen Verfahren können Störungen durch Phenolrot 17 verursacht wird, minimieren. Abbildung 3 veranschaulicht die Zytotoxizität von einer zunehmenden Konzentration einer Testverbindung codiert G1-1H verursacht. Normalerweise wird ein 50% ige Hemmkonzentration (IC 50) eingesetzt , um den Grad der Zytotoxizität anzuzeigen. Im Fall von G1-1H, Konzentrationen von 10 um und 3 um liegen deutlich unterhalb der Konzentration 50 ICS. In-Brühe Aktivitätsanalyse unsing des Resazurin-Assay Der Resazurin - Test wird für die Analyse der Zytotoxizität in eukaryotischen Zellen üblicherweise verwendet, aber es kann auch lebende Bakterien verwendet wird , in 3 - Brühe zu überwachen. Der Resazurin-Test ist ein redox-basierter Assay ähnlich die MTT-Assay. Er misst NADPH Ebenen und NADPH-Dehydrogenase-Aktivität durch die Umwandlung von Resazurin in Resorufin, einem roten Fluorophor. Der einfachste und schnellste Weg, Wirksamkeit von Medikamenten zu bestimmen, ist für die niedrigste Behandlungskonzentration zu suchen, wo die Vertiefungen in der Farbe blau bleiben. Abbildung 4 zeigt einen Teil einer 96-Well - Platte zeigt , haben die Wirkung verschiedener Konzentrationen der Antibiotika - Apramycin auf Resazurin Umwandlung von M. tuberculosis. Die in-Brühe MIC wurde zwischen 2,5 und 5 &amp; mgr; g / ml bestimmt. Dies ist etwas höher als der zuvor veröffentlichte Wert von 1,5 ug / ml 18, aber es ist immer noch gut innerhalb der acceptable Bereich. In vielen Fällen ist die Farbänderung eher allmählich, so ist es schwierig, eine selbstbewusste Entscheidung zu treffen. Unter diesen Bedingungen ist es besser, die tatsächliche Menge an Resazurin Umwandlung unter Verwendung von entweder Absorption oder Fluoreszenz zu quantifizieren. Aufgrund der ähnlichen Absorptionseigenschaften von Resazurin und Resorufin, Absorption erfordert Messungen mit MHK - Bestimmung unter Verwendung von zwei verschiedenen Wellenlängen und komplexe Berechnungen 15. Daher ist die beste Methode , unter Verwendung von Fluoreszenz - 530- bis 560-nm - Anregungswellenlängen und eine 590-nm - Emissionswellenlänge zu messen, wie in 15 die Herstellerliteratur beschrieben. 4 stellt eine mögliche Quelle für mangelnde Übereinstimmung mit multiday Inkubationen verbunden , die Screening - Ergebnisse drastisch verändern könnte. Durch unsachgemäßes Befeuchten des Inkubators 37 ° C für dieses Experiment verwendet, Vertiefungen auf den Rand des p<html> lates litt deutlich mehr Verdunstung. Alle 15 DMSO-behandelten Vertiefungen sollen identisch sein, aber die Brunnen entlang der linken und oberen Kanten hatte Volumen reduziert. Diese Vertiefungen erscheinen auch verschiedene Farben als die anderen DMSO-behandelten Vertiefungen in der Mitte der Platte zu haben. Die gleiche Unbeständigkeit kann auch in 2,5 ug / ml Apramycin-behandelten Vertiefungen beobachtet werden. In diesem Fall würde das reduzierte Volumen führt auch zu einer quantitativen Messung mit einem Spektrophotometer und Fluorometer. Die Verdampfung wird signifikant für alle Experimente mit längeren Inkubationszeiten, so Pflegezentren getroffen werden müssen halten gut befeuchtete diese Quelle der Inkonsistenz zu vermeiden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig1.jpg" /> Figur 1: Verfahren Schema. Diagramm, das Testschema für 3 getrennten Module des Hochdurchsatz-Screening-Systems.<html> _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg“target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Daten aus einer intrazellulärer zur Prüfung der Wirksamkeit von Rifampicin bei der Beseitigung von M. tuberculosis innerhalb THP-1 - Zellen. (A) Diagramm der mittleren Lumineszenz Lese (in relativen Lumineszenz - Einheiten) für jede Behandlung (Rifampicin) Konzentration. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung des Mittelwerts für jede dreifache Ausfertigung. (B) Graph der berechneten prozentuale Verringerung der Lumineszenz , die durch eine Behandlung von Rifampicin verursacht, wobei höhere Werte eine größere Wirksamkeit anzuzeigen. Das 90% Hemmkonzentration (IC 90) , ist in diesem Fall irgendwo zwischen 0,01 und 0,1 ug / ml.nk &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative Daten aus einer Zytotoxizität (MTT) Assay die toxischen Wirkungen der Verbindung G1-1H auf Differenzierte THP-1 - Zellen untersuchen zu. Graph der berechneten „Prozent der Kontrolle“ Werte für jede Konzentration der Behandlungsverbindung G1-1H, wobei höhere Werte gesünderen THP-1-Zellen an. Der IC 50 ist in diesem Fall irgendwo zwischen 10 und 30 &amp; mgr; M. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55273/55273fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55273/55273fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig4.jpg" /> Abbildung 4: Repräsentative Daten aus einer Resazurin - Assay zum Untersuchen Sie die EIRKSAMKEIT von Apramycin bei M. tuberculosis Hemmen In-Brühe. Nur qualitative Daten werden in der Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) Labor aufgrund von Gerätebeschränkungen in diesem Fall gesammelt. Das Foto zeigt einen Teil einer 96-Well - Platte , die mit M. tuberculosis entweder DMSO behandelt oder unterschiedliche Mengen an Apramycin. Der DMSO-behandeln Wells zeigte eine Umwandlung von Resazurin Resorufin, wie durch die Farbumwandlung von blau nach rosa angegeben. Die Apramycin behandelten Proben unterzog sich deutlich die Farbumwandlung unter 5 &amp; mgr; g / mL. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55273/55273fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55273/55273fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> [Rifampicin] </td><td> Rep1 </td><td> rep2 </td><td> REP3 </td><td&gt; Durchschnitt </td><td> % Die Ermäßigung </td></tr><tr><td> 4 ug / ml </td><td> 184 </td><td> 190 </td><td> 210 </td><td> 195 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 1 ug / ml </td><td> 244 </td><td> 215 </td><td> 159 </td><td> 206 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 0,1 ug / ml </td><td> 1037 </td><td> 731 </td><td> 976 </td><td> 915 </td><td> 98 </td></tr><tr><td> 0,01 &amp; mgr; g / ml </td><td> 19200 </td><td> 24400 </td><td> 23919 </td><td> 22506 </td><td> 54 </td></tr><tr><td> 0 ug / ml </td><td> 39877 </td><td> 49655 </td><td> 57728 </td><td> 49087 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Rohdaten aus der Luciferase - Assay zur Bestimmung der intrazellulären ICS 90 von Rifampicin. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo: keep-mit-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> [G1-1H] </td><td> Rep 1 A570 </td><td> Rep 2 A570 </td><td> Rep 3 A570 </td><td> durchschnittliche A570 </td><td> % Der unbehandelten </td></tr><tr><td> 30 &amp; mgr; M </td><td> 0,056 </td><td> 0,056 </td><td> 0,055 </td><td> 0,056 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10 &amp; mgr; M </td><td> 0,518 </td><td> 0,488 </td><td> 0,492 </td><td> 0,499 </td><td> 62 </td></tr><tr><td> 3 &amp; mgr; M </td><td> 0,652 </td><td> 0,638 </td><td> 0,656 </td><td> 0,649 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 0 &amp; mgr; M </td><td> 0,822 </td><td> 0,782 </td><td> 0,815 </td><td> 0,806 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Rohdaten aus der MTT - Assay zur Bestimmung der Zytotoxizität von Testverbindung G1-1H bei Different Konzentrationen.

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System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

8.5K Aufrufe.  University of British Columbia.  Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst. 

Serie: System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...