Name: an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
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Desejamos agradecer à Johnson &amp; Johnson, à TB Alliance, à Astra Zeneca, à Rib-X e à Trius Therapeutics pela prestação de bedaquilina, PA-824 (pré-tonsanida), AZD5847, radezolid e tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner forneceram suporte com análise MALDI, métodos bioanalíticos, preparação do substituto caseu, síntese química e isolamento de caseum de coelho. Este trabalho foi realizado com financiamento da Fundação Bill e Melinda Gates, o prêmio # OPP1044966 e OPP1024050 para V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, bem como o financiamento conjunto da Fundação Bill e Melinda Gates e Wellcome Trust para um Centro de Excelência Para Lead Optimization para Doenças do Mundo em Desenvolvimento a P. Wyatt.

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde com a aprovação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso do NIAID (NIH), Bethesda, MD. Todos os estudos envolvendo o M. tuberculosis foram realizados num laboratório com nível de segurança biológica de contenção 3 (BSL-3). Modelo Infecção 1. Coelho e Coleção caseum <ol><li> Infect de coelhos Nova Zelândia brancos com M. tuberculosis usando um sistema de exposição de aerossóis só de nariz, como descrito anteriormente. 12, 13 permitir que a infecção progride para 12-16 semanas. Sedar os coelhos com 35 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina por via intramuscular, sacrificar os coelhos, com 0,22 ml / kg de pentobarbital de sódio por via intravenosa e a fenitoína de sódio e prosseguir com as necropsias. </li><li> Usando pinças e um bisturi, remove pulmões do ca peitoVidade. A partir de cada lobo pulmonar, dissecar cavidades individuais e grandes granulomas necróticos usando um bisturi. Cuidadosamente raspar fora caseu da cavidade e granuloma paredes. Pesar, gravar e armazenar amostras em tubos de 2 mL com tampa roscada a -20 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Irradia-se as amostras de caseu infecciosas a 3 MegaRad em gelo seco para torná-las não infecciosas e seguras para utilização num laboratório BSL-2. </li></ol> 2. Geração In Vitro de Substituto Caseum de células THP-1 <ol><li> Crescer monócitos THP-1 em meio RPMI 1640 (L-glutamina 2 mM e soro fetal bovino a 10%) em frascos de cultura de células T175 (80 mL / balão). Incubar os frascos numa atmosfera de CO2 a 5% a 37 ° C durante 3-4 dias. </li><li> Centrifugar a cultura de um balão T175 em dois tubos cônicos de 50 mL a 150 xg por 5 min. Descartar o sobrenadante e suspender o sedimento em 10 mL de meio RPMI 1640. </li><li> Pipetar 5 μL desta cultura em um tubo de 1,5 mL contendo 45 μL de tazul rypan. Mistura-se cuidadosamente por pipetagem. Transferir 10 uL para um hemocitómetro e contar o número de monócitos THP-1 viáveis ​​(sem corante), utilizando um microscópio óptico (ampliação de 10X). Calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura. Diluir com meio RPMI para a densidade final de 1,25 x 10 6 culas / mL. </li><li> Carregar 40 ml da cultura em uma placa de cultura de células grandes (50 x 10 6 culas / placa). Adicionar 40 uL de 100 uM de PMA (forbol 12-myristate13-etilo preparado em etanol) e permitir que as células a aderir durante a noite na incubadora. NOTA: A concentração final de PMA é de 100 nm. </li><li> Dilui-se o ácido puro oleico (OA) (0,89 g / mL) em etanol para a concentração de 0,1 M (ou seja 31,7 mL de OA em 968,3 mL de etanol). Dilui-se esta solução em meio fresco RPMI pré-aquecido a uma concentração de 10 mM. Dilui-se esta suspensão de OA a 0,4 mM (concentração final de trabalho), em meio RPMI pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Remova a mídia e não existentesDas células de cultura de células e adicionar suavemente 40 mL de OA 0,4 mM aos macrófagos THP-1 (THP-M). Incubar a 37 ° C na incubadora durante a noite. </li><li> Use um microscópio de luz com uma ampliação de 40x para confirmar visualmente a presença de numerosas inclusões de corpo lipídico em cada THP-M. Remover todo o meio RPMI das placas de cultura de células e lavar cuidadosamente as células aderentes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma pipeta serológica de 50 mL. NOTA: Os corpos lipídicos aparecem como estruturas esféricas pequenas e claras no citoplasma do THP-M. </li><li> Adicionar 40 mL de ácido etilenodiaminotetraacético 5 mM (EDTA) em PBS a cada placa. Incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Desmonte os macrófagos espumosos (FM) pipetando repetidamente para cima e para baixo sobre a superfície da placa inteira usando uma pipeta serológica de 10 mL. Transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e girar para baixo a 150 xg por 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 10 mL de PBS (terceira lavagem com PBS) aNd de transferência para um pré-pesados ​​15 mL mL tubos cônicos. Girar novamente para 150 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica e descartar. </li><li> Submeter as pastilhas de FM a 3 ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células e incubá-las a 75 ° C durante 20-30 min para desnaturar as proteínas na matriz. Armazenar os grânulos a -20 ° C até estar pronto para uso. </li></ol> 3. Ensaio de Diálise de Equilíbrio Rápido (RED) <ol><li> Preparar soluções-mãe 10 mM de todos os compostos de teste em dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir a soluções de trabalho de 500 μM em DMSO antes de cada ensaio. </li><li> Pesar o tubo contendo a pastilha substituta de caseu. Subtrair o peso do tubo vazio para derivar o peso do grânulo sozinho. Adicionar 2-3 esferas metálicas por tubo e, utilizando um homogeneizador de tecidos a 1200 golpes / minuto durante 1 minuto, interromper o caseu ou a matriz substituta em PBS (1: 9 p / v) para se obter a suspensão diluída 10x de cada matriz. </li><li> Spike 6,5 μL dos 500ΜM do composto de teste em 643,5 μL de homogeneizado para se obter a concentração final de 5 μM (≤ 1% de DMSO) e vórtex. </li><li> Coloque as inserções VERMELHAS na placa de base. Adicionar 200 μL da matriz droga-cravada na câmara doadora (anel vermelho) de cada inserto VERMELHO e 350 μL de PBS em cada câmara receptora. Preparar 3 insertos para cada composto de teste (amostras em triplicado). Selar a placa com um vedante de placa adesiva e incubar a 37 ° C no termomixador a 200 rpm (1 xg) durante 4 h. </li><li> Após a incubação, misturar suavemente o conteúdo das câmaras doador e receptor por pipetagem para cima e para baixo 2-3 vezes. Pipetar para fora alíquotas de 20 μL de homogeneizado das câmaras de dador e adicionar 20 μL de PBS limpo num tubo de 1,5 mL (1: 1). Do mesmo modo, pipetar para fora alíquotas de 20 μL de amostras de PBS das câmaras receptoras e adicionar 20 μL de homogeneizado limpo (correspondência de matriz). 8 NOTA: A correspondência de matriz elimina aEd para 2 curvas de calibração separadas (em homogeneizado e PBS) a serem feitas para análise quantitativa. O conteúdo da câmara doadora pode sedimentar ao longo do tempo. Misture suavemente o conteúdo por pipetagem antes de remover as alíquotas. </li></ol> 4. Quantificação de LC-MS e Análise de Dados <ol><li> Adicionar 160 μL de metanol: acetonitrilo 1: 1 contendo diclofenac 500 ng / mL ou verapamil 10 ng / mL (padrão interno) a cada tubo e vortex para precipitar as proteínas. Centrifugar a 10 000 xg durante 5 min para sedimentar o precipitado e transferir os sobrenadantes para placas de poço profundo de 96 poços para análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LCMS). 7 </li><li> Construir curvas de calibração de 1-1000 nM para cada composto de teste, mantendo a mesma composição de matriz que as amostras acima. Quantificar a concentração do composto de teste em amostras das câmaras doadora e receptora utilizando um método LC-MS. </li><li> Calcular a fracção não ligada ( f u ) oF o fármaco em matriz diluída usando a equação 1. Calcule o f u em matriz não diluída usando a equação 2 ( D = fator de diluição de 10). 14 <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Verificar a recuperação (balanço de massa) de cada composto utilizando a equação 3 para identificar compostos com estabilidade / metabolismo / questões de ligação não específicas. NOTA: Recuperação normalmente cai entre 70% e 130%. 15 <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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Não existem interesses financeiros concorrentes.

Lesões necróticas pulmonares e cavidades em pacientes infectados com tuberculose contêm subpopulações de bactérias que são recalcitrantes ao tratamento medicamentoso. Os núcleos caseosos destas estruturas são particularmente responsáveis ​​por abrigar estes persisters em um ambiente extracelular. Acredita-se que uma distribuição favorável de agentes anti-bacterianos nestes locais remotos seja um determinante importante da eficácia do fármaco contra a tuberculose. Antes da validação deste protocolo, não havia técnicas in vitro disponíveis que pudessem prever a distribuição de compostos de descoberta de fármacos em lesões caseosas. Como resultado, a avaliação da distribuição de fármacos nestes focos críticos dependia fortemente de modelos de infecção animal, estudos farmacocinéticos centrados na lesão e técnicas de imagirometria de espectrometria de massa MALDI. 5 , 17 O ensaio in vitro descreveuRe é um meio rápido e eficaz para prever a penetração da droga em lesões de tuberculose sem o tédio e custo de estudos in vivo em farmacocinéticas. O protocolo é uma modificação do ensaio de ligação de proteína do plasma que foi originalmente o uso pretendido do dispositivo VERMELHO. A homogeneização de amostras de tecido para uma consistência pipeta-capaz permite a ligação a ser medido usando o mesmo dispositivo de proteína de tecido. Este protocolo pode ser realizado com caseum se ele está disponível a partir de modelos de infecção animal. Como a Figura 1 explica, moléculas de fármaco se ligam a macromoléculas em caseum homogeneizado / substituto, mantendo-o na câmara de dador, ao passo que as moléculas de droga não ligada são livres de se difundir através da membrana semi-permeável para dentro da câmara receptor. A fracção não ligada (f u) equilibra-se entre ambos os compartimentos durante o período de incubação. Como a Figura 2 ilustra, compostos muito altamente ligado (f u ≤ 1%) que são almoSt inteiramente aprisionados dentro da câmara doadora não são eficazes para permear o caseu. Por outro lado, os compostos menos ligados (1% &lt; f u &lt;100%) são capazes de difundir para o núcleo caseoso em graus variáveis; Quanto maior o f u , mais extensivamente permeia a área necrótica. O protocolo pode também ser utilizado com uma matriz substituta derivada de macrófagos THP-1 carregados com lípidos que foram induzidos com ácido oleico. Várias condições para a indução da acumulação de corpos lipídicos foram testadas em THP-1s. Estes incluem hipoxia, exposição a M. tuberculosis irradiada e exposição a trehalose 6,6&#39;-dimicolato (TMD) derivado da parede celular micobacteriana. Verificou-se que a concentração final de incubação de ácido oleico de 400 μM induz a formação de picos de corpos lipídicos sem comprometer a viabilidade celular e a adesão. 7 A diluição de ácido oleico em meio pré-aquecido é crítica para garantir máximosL dissolução do ácido gordo. A matriz substituta resultante tem um conteúdo de colesterol comparável ao caseum verdadeiro, mas maior e menor teor de triglicéridos e proteínas, respectivamente. 7 Tal como a Figura 3 ilustra, a ligação de 18 compostos anti-tuberculose à matriz substituta correlaciona-se fortemente com a sua ligação ao caseu. O estudo recente que também incluiu compostos não comerciais com atividade bactericida indefinida provou que a matriz derivada de FM é um substituto efetivo do caseu. 7 Ao remover a necessidade de modelos de infecção animal, a matriz substituta aumenta com êxito o rendimento deste ensaio enquanto o torna mais rentável. Este versátil protocolo também pode ser usado para testar vários compostos simultaneamente (teste de cassete). Nós já demonstrámos que testar 5 combinações de fármacos, todas a 5 μM, em cada inserto utilizando este protocolo pode efectivamente classificar o compostoS com base nas suas afinidades de ligação ao caseu, poupando tempo e materiais. Um sexto composto de controlo tal como moxifloxacina pode ser adicionado à cassete como um controlo interno para assegurar a consistência entre ensaios e lotes de caseu / substituto. 7 Importante, o protocolo pode ser executado com tão pouco como 20 μL de um stock composto 10 mM (&lt;&lt; 1 mg de um composto). Esta é uma vantagem enorme no início do processo de descoberta de fármacos quando os químicos sintetizam quantidades limitadas de cada composto para fins de rastreio. O dispositivo do dispositivo VERMELHO é automação amigável; A pegada de microplaca da placa base torna-o compatível com sistemas automatizados projetados para lidar com placas padrão de 96 poços. Embora se tenha demonstrado que a matriz substituta imita com êxito as propriedades de ligação do caseu ex vivo ( Figura 3 ), reconhecemos que pode perfilar incorrectamente certos compostos. Os macrófagos THP-1 são comumente usados <eM&gt; técnicas in vitro para simular macrófagos alveolares no tecido pulmonar. No entanto, a matriz substituta derivada de THP-1 não tem a mesma composição que o material caseoso necrótico em lesões pulmonares. Como resultado, certas classes de compostos podem interagir de forma diferente com a matriz substituta. Além disso, o sucesso do ensaio depende da estabilidade do composto de teste na matriz caseosa. O caseum é uma matriz biológica que compartilha muitos componentes com o plasma e, portanto, este protocolo é suscetível a problemas de degradação do composto da mesma maneira que muitos testes baseados no plasma também. A este respeito, a matriz substituta derivada de THP-M é preferível porque o passo de desnaturação no protocolo remove a actividade enzimática, melhorando a recuperação total no final do ensaio. O ensaio de ligação substituto caseu é uma ferramenta útil na descoberta de fármacos para a tuberculose e está a ser utilizado em múltiplos programas de optimização de chumbo. Também pode ajudar aRegimes de combinação eficazes baseados na capacidade dos fármacos individuais para se dividirem nas várias camadas de tipos de lesão múltiplos. O protocolo poderia também ser adaptado para facilitar a descoberta de fármacos para outras doenças que são caracterizadas pela formação de lesões ou abscessos em que a penetração de fármaco é limitada mas crítica para o tratamento bem sucedido.

O tratamento da doença pulmonar tuberculosa requer distribuição eficaz de fármacos em diferentes tipos de lesões. As lesões necróticas e as cavidades contêm centros caseosos que abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a drogas ou &quot;persistentes&quot;. 1 , 2 A doença cavitária está associada a taxas de cura inferiores e mau prognóstico. 3 , 4 Estudos anteriores mostraram, usando técnicas quantitativas e de imagem, que a capacidade de penetrar o caseu varia significativamente de uma classe de droga para outra. 5 , 6 Estes métodos, no entanto, exigem o uso de modelos de infecção animal que são lentos e tediosos. Foi concebido um ensaio in vitro que mede a ligação do fármaco ao caseu ex vivo . Verificou-se que esta ligação estava inversamente correlacionada com a penetração do fármaco em granulomas caseosos e, por conseguinte, éusado como uma ferramenta de previsão. 7 Diálise de equilíbrio é considerado como o método padrão de ouro para estudos de ligação de proteína de plasma. O dispositivo rápido equilíbrio de diálise (VERMELHO) proporciona um sistema rápido, fácil de usar e fiáveis ​​para a realização de tais ensaios. 8 O dispositivo é constituído por dois componentes: de utilização única, descartáveis que consistem inserções de 2 câmaras separadas por um cilindro vertical de membrana semi-permeável; e placas de base reutilizáveis ​​que pode armazenar até 48 inserções de cada vez. A membrana de diise tem um 8 kDa de peso molecular de corte (MWCO) que é ideal para estudos de ligação a drogas macromolécula. A razão de área para volume elevada superfície do compartimento da membrana de diálise permite uma rápida e equilibração. Ambos os insertos e a placa de base foram validados para o mínimo de ligação não específica. A combinação do dispositivo VERMELHO com técnicas bioanalíticas fornece estimativas precisas sobre as fracções não ligadas de medicamentos em pLasma 8 , 9 Embora originalmente concebido para medir a ligação às proteínas plasmáticas, o dispositivo RED foi utilizado em vários estudos de ligação de tecidos utilizando homogeneizados. 10 , 11 Neste protocolo, medimos a ligação do fármaco ao caseu, os detritos necróticos excisados ​​das lesões necróticas e cavidades de coelhos infectados com tuberculose. A natureza acelular e não vascular do material caseoso facilita a homogeneização numa suspensão homogénea que é compatível com o ensaio. Dado que o caseu é tedioso para produzir e difícil de encontrar, o protocolo também foi validado para uso com uma matriz substituta que é preparada a partir de macrófagos espumosos. Os macrófagos derivados de monócitos THP-1 são induzidos com ácido oleico para acumular múltiplos corpos lipídicos que lhes conferem a sua aparência &quot;espumosa&quot;. Estas células carregadas de lípidos são colhidas eProcessado para produzir uma matriz que usamos como um substituto de caseu. Este estudo mostrou que a ligação do fármaco a esta matriz substituta se correlaciona bem com a ligação ao caseu, imitando eficazmente o processo in vivo que impede a penetração do fármaco no núcleo caseoso de granulomas e cavidades.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&amp;sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&amp;nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

A erradicação da tuberculose requer regimes medicamentosos que possam penetrar as múltiplas camadas de lesões pulmonares complexas. A distribuição de fármacos nos núcleos caseosos de cavidades e lesões é especialmente crucial porque abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a fármacos também vulgarmente referidas como persisters. Os métodos existentes para a medição da penetração de fármaco em lesões de tuberculose envolvem costosos e demorados estudos farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas ou de imagem. A medida in vitro da ligação do fármaco às macromoléculas de caseu foi proposta como uma alternativa a essas técnicas, uma vez que esta ligação dificulta a difusão passiva de moléculas de fármaco através do caseu. A diálise de equilíbrio rápido é um sistema rápido e confiável para realizar estudos de ligação a proteínas plasmáticas e tecidos. Neste protocolo, usamos um dispositivo de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco a homogenatos de caseu que é excised das lesões e as cavidades de coelhos infectados com tuberculose. O protocolo também descreve como gerar uma matriz de substituição de lípido carregado THP-1 macrófagos para usar em lugar de caseum. Este ensaio de ligação caseum / substituto é uma ferramenta importante na descoberta de drogas tuberculose e pode ser adaptado para ajudar o estudo da distribuição de drogas em lesões ou abcessos causados ​​por outras doenças.

Usando este protocolo, testámos centenas de compostos de desenvolvimento de tuberculose para a sua eficiência previsto no penetrante caseum. A Figura 1 visualiza os conceitos básicos do ensaio VERMELHO. A membrana de diálise das inserções VERMELHOS permite para pequenas moléculas não ligadas a difundir a partir do dador bem ao receptor bem como, finalmente, atingir um equilíbrio entre os dois compartimentos. As pequenas moléculas que são ligadas a macromoléculas, tais como proteínas ou lípidos estão presos no dador bem. A análise quantitativa das amostras de ambos os compartimentos permite o cálculo da fracção não ligada (f u) de cada molécula pequena no caseum ou matriz substituta. Esta fracção tem sido demonstrado que se correlacionam directamente com a penetração da droga na caseum in vivo. 7 A Figura 2 ilustra o uso de MALDI (laser assistida por matriz dessorção / ionização) spectro de massaMetry imagens, quanto maior o f u , mais extensivamente a droga difunde em caseu. Assim, isto concorda com a hipótese de que, à medida que as moléculas de fármaco se difundem para o rebordo exterior do caseu a partir da sua interface com camadas celulares da lesão, a ligação às macromoléculas caseosas sequestra o fármaco, impedindo-o de se difundir ainda mais no núcleo caseoso. Um painel de amostra de 18 fármacos anti-tuberculose está listado na Tabela 1 juntamente com o seu f u tanto no caso como no substituto. Como a Figura 3 ilustra, a matriz preparada a partir de macrófagos espumosos derivados de THP-1 é um substituto eficaz para o caseu verdadeiro. A ligação em ambas as matrizes se correlaciona fortemente entre si. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig1.jpg" /> Figura 1: Ilustração do ensaio RED. Durante a incubação, as moléculas de fármacos que permanecem não ligadas a macromoléculas ema matriz difusa através da membrana de diálise. Ao longo do tempo, um equilíbrio é estabelecido entre a concentração de moléculas de droga não ligada em ambos os poços de dador e receptor. Todas as macromoléculas (proteínas, lípidos, etc.) e as moléculas da droga ligadas são presos no interior da câmara do dador. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55559/55559fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig2.jpg" /> Figura 2: a penetração da droga in vivo. Relação entre a fracção não ligada (f u) e de difusão em caseum in vivo conforme determinado por MALDI (laser assistida por matriz dessorção / ionização) imagiologia espectrometria de massa por seis medicamentos anti-tuberculose. mapas de iões são representativos de lesões pulmonares e a intensidade do sinal é indicada pela barra de escala à esquerda. H<html> ematoxylin e Eosina (H &amp; E) Coloração de secções adjacentes é mostrado abaixo os mapas de iões. Preto / linhas de contorno brancas destacar o centro caseosa de cada lesão. Reproduzido (adaptada) com a permissão de Sarathy et al. 7 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55559/55559fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig3.jpg" /> Figura 3: Relação entre as fracções não ligadas (f u) de 18 medicamentos anti-tuberculose em caseum e a matriz de substituição. A linha de melhor ajuste foi determinada por meio de regressão linear. A qualidade do ajuste é expressa como o valor de R2. Reproduzido (adaptada) com a permissão de Sarathy et al. 7K &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td> Caseum f u (%) </td><td> Subrogado f u (%) </td></tr><tr><td> Ethambutol </td><td> 35,2 ± 4,4 </td><td> 38,8 ± 5,6 </td></tr><tr><td> Isoniazida </td><td> &gt; 99,9 </td><td> &gt; 99,9 </td></tr><tr><td> Acetil-isoniazida </td><td> &gt; 99,9 </td><td> &gt; 99,9 </td></tr><tr><td> P- aminosalicílico </td><td> 54,7 ± 1,4 </td><td> 51,1 ± 11,2 </td></tr><tr><td> Rifampicina </td><td> 5,13 ± 0,2 </td><td> 7,3 ± 0,6 </td></tr><tr><td> Rifapentina </td><td> 0,5 ± 0,1 </td><td> 1,1 ± 0,1 </td></tr><tr><td> Moxifloxacina </td><td> 13,5 ± 3,7 </td><td> 16,8 ± 1,8 </td></tr><tr><td> levofloxacina </td><td> 8,34 ± 0,4 </td><td> 16,3 ± 3,1 </td></tr><tr><td> Gatifloxacin </td><td> 16,3 ± 4,2 </td><td> 18,8 ± 2,9 </td></tr><tr><td> Linezolid </td><td> 29,3 ± 3,6 </td><td> 27,9 ± 2,2 </td></tr><tr><td> Posizolid </td><td> 10,7 ± 1,7 </td><td> 17,6 ± 4,5 </td></tr><tr><td> Sutezolid </td><td> 30,1 ± 8,7 </td><td> 21,7 ± 1,7 </td></tr><tr><td> Radezolid </td><td> 5,2 ± 0,8 </td><td> 7,6 ± 1,9 </td></tr><tr><td> Tedizolid </td><td> 8,8 ± 1,8 </td><td> 13,7 ± 2,7 </td></tr><tr><td> clofazimina </td><td> &lt;0,01 </td><td> &lt;0,01 </td></tr><tr><td> bedaquilina </td><td> &lt;0,01 </td><td> &lt;0,01 </td></tr><tr><td> PA-824 </td><td> 7,31 ± 2,2 </td><td> 3,6 ± 0,2 </td></tr><tr><td> OPC67683 </td><td> 0,04 ± 0,02 </td><td> 0,02 ± 0,002 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Fração não ligada ( f u ) dos fármacos de 18 TB testados no caseu e no ensaio de ligação substituto. Todos os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. Reproduzido (adaptado) com permissão de Sarathy et al . 7

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An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Aqui descrevemos um método de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco ao caseu de lesões e cavidades de tuberculose pulmonar. O protocolo também é usado com uma matriz espumosa derivada de macrófagos que é um substituto efetivo do caseu.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Nanyang Technological University

Research

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JoVE Core

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Nonlinear Pharmacokinetics

Introduction to Respiratory System Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

11.7K visualizações.  Rutgers.  Aqui descrevemos um método de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco ao caseu de lesões e cavidades de tuberculose pulmonar. O protocolo também é usado com uma matriz espumosa derivada de macrófagos que é um substituto efetivo do caseu. 

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A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Imunologia e Infecção

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

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Medicina

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ensaio de triagem de alto rendimento para Mycobacterium abscessus usando repórteres duplos

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Protocolo de triagem de drogas escalável para descoberta eficiente de tratamentos com M. abscessus

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

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A

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