Wir danken Laurent Limozin, Pierre Dillard und Astrid Wahl für fruchtbare Diskussionen über zelluläre Anwendungen fort. Wir danken auch Frederic Bedu von PLANETE Reinraum für seine Hilfe bei SEM Beobachtungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Europäischen Forschungsrat über Zuschuss Nr 307104 FP / 2007-2013 / ERC finanziert.

1. Reinigung Glasdeckel-Dias und Beobachtungskammern <ol><li> Ordnet die Glasabdeckung Schlitten auf einem mehr Diamagazin aus einem inerten Material wie Polytetrafluorethylen (PTFE). </li><li> Taucht das Fach mit Rutschen und die Beobachtungskammer in einer Tensidlösung (jedes Produkt zu empfehlen für die Reinigung von Quarzküvetten ist geeignet). </li><li> Unter Verwendung eines Ultraschallbades, ultra-beschallen in der Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Spülen Sie 5-mal mit Reinstwasser (18.2 MΩ.cm, 0,059 &amp; mgr; S / cm). </li><li> Ultra-Sonikat in Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Spülen Sie 10-mal mit Reinstwasser. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.5 und 1.6 zweimal. </li><li> Speicher in Wasser bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C) für bis zu einer Woche. </li></ol> 2. Herstellung von Protein-Nano-Punkte <ol><li> Die Ablagerung von Perlen <ol><li> Deposit die Suspension von Silica-Kügelchen (2% v / v, 70 &amp; mgr; l) tropft auf einem deckel Schieber (24 x 24 mm, Dicke 170 um) mit einer Neigung von 15 Grad gehalten wird. </li><li> Lassen Sie die Suspension für ca. 1 min verteilt, während das Glas alle 15 s um 90 ° Spiegeln. </li><li> Die Flüssigkeit unter Umgebungsbedingungen zu verdampfen. </li><li> Speicher in einem sauberen Glas oder PTFE Kammer bei Umgebungsbedingungen für bis zu 2 Tagen. </li></ol></li><li> Abscheidung von Aluminium <ol><li> Platzieren Sie die Folien (hergestellt in Abschnitt 2.1) in einer Radiofrequenz (RF) Magnetronzerstäubungsgerät 8, auf einem Drehtisch in einer Entfernung von etwa 105 mm aus einer Aluminium (99%): Silizium (1%) vorbei. </li><li> Abpumpen der Beschichtungskammer auf 2,6 x 10 -4 Pa eine Turbomolekularpumpe. Dieser Schritt ist wichtig für die Entfernung von gasförmigen Verunreinigungen möglich. </li><li> Einführung von reiner Argon-Atmosphäre (5N, 99,999%) mit einem Fluss von 10 sccm bei einem Druck von 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; Anmerkung: Der ankommende Argonfluss durch einen Massendurchflussregler und der Prozeßdruck wird überwacht, gesteuert wird, ein Druckmesser verwendet wird. Der Argongasstrom ist kontinuierlich und wird durch ein Gleichgewicht zwischen dem Einlass und Auslass Öffnen der Ventile gesteuert. </li><li> Schalten Sie den HF-Leistungsgenerator. HINWEIS: Hier wird ein typischer Bereich von 400-600 W Hochfrequenzleistung bei 13,56 MHz verwendet wurde. Der HF-Generator ist mit einem Anpassungsnetzwerk in einem kapazitiven Kopplungsmodus Plasma verwendet. Die reflektierte Leistung wird überwacht und minimiert die Netzwerkanpassung verwenden. </li><li> Nachdem das Plasma stabilisiert wird, Sputter für 2 min geschlossen, um den Verschluss zu halten mögliche Verunreinigungen von der Oberfläche des Targets zu entfernen. </li><li> Öffnen des Verschlusses und ermöglichen dem Sputter weiterhin für 60 min Aluminium auf der Glasträger mit einer Dicke von 200 nm abzuscheiden. </li><li> Schneiden Sie die Strömung von Argon, schließen Sie das Torventil die Turbomolekularpumpe aus der Abscheidungskammer und die Entlüftungsöffnung in die Kammer mit reinem n zu isolierenitrogen den Raumdruck zu erhalten. Wiederherstellen der aluminiumbeschichteten Folien. Speicher für bis zu einem Monat in einer sauberen und hermetisch verschlossenen Glas oder PTFE-Box unter Umgebungsbedingungen. </li></ol></li><li> Dampfabscheidung von Organosilan <ol><li> Tauchen Sie die Aluminium-beschichteten Objektträger, hergestellt in Schritt 2.2.6 in Reinstwasser bei Raumtemperatur und ultra-Sonikat für 30 s in einem Ultraschallbad (50 W, 50/60 Hz, zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Deposit 0,5 ml (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) am Boden eines Exsikkators. ACHTUNG: APTES ist ein Organosilan, das leicht verdampft und ist giftig. APTES sollte nur unter einer strömungs Kapuze und mit Handschuhen angefasst werden. </li><li> Setzen Sie die Objektträger aus Glas (hergestellt in 2.3.1) auf einem Keramik-Gitter und im Inneren der Exsikkator. </li><li> Schließen Sie den Exsikkator mit einer Membranpumpe und läuft bei maximaler Leistung für 30 min mit einem niedrigen Vakuum zu erzeugen. </li><li> Schließen Sie das Ventil des Exsikkator und schaltet die Pumpe ab. </li><li> Heizen Sie den Exsikkatorauf etwa 50 ° C für 1 h. </li><li> Öffnen Sie den Exsikkator und sammeln Sie die Dias. </li><li> Übertragung auf ein anderes sauberes Exsikkator zur Lagerung bis zu 48 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 30 ° C). </li></ol></li><li> Ablagerung der ersten Schicht von Protein - Rinderserumalbumin, markiert mit Biotin (BSA-Biotin) <ol><li> Legen Sie eine der hergestellten Folien in Abschnitt 2.3 auf einem PTFE-Träger. </li><li> Deposit 1 ml 25 ug / ml BSA-Biotin, gelöst in Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Lassen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 30 ° C). </li><li> Spülen 10 mal mit PBS. Lagern Sie die Probe für bis zu 24 h bei 4 ° C entfernt von der Lichtquelle. </li></ol></li><li> Die Entfernung der Aluminiummaske <ol><li> Inkubieren den Objektträger in einer Lösung von NaOH in PBS (hergestellt durch tropfenweise Zugabe von 1 M NaOH auf etwa 100 ml PBS pH≈12 zu erhalten) über Nacht bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). VORSICHT. NaOH ist ätzend und sollte mit Handschuhen angefasst werden. </li><li> Spülen10-mal in Reinstwasser. </li></ol></li></ol> 3. Die Ablagerung von Lipid Bilayer Stützter (SLB) <ol><li> Reinigen des Langmuir-Trog <ol><li> Entfernen des Wassers in dem PTFE Gehäuse der Langmuir-Trog mit einer Pumpe. </li><li> Reinigen Sie mit einem fusselfreien Vlies Einweg-Handtuch in Chloroform getränkt. VORSICHT. Chloroform ist giftig und soll in einem gut belüfteten Bereich manipuliert werden, mit einer Maske (oder unter einer Strom-Haube) und mit geeigneten Handschuhen. </li><li> Sauber 4mal mit lauwarmem Reinstwasser (40 bis 50 ° C). </li><li> Reinigen Sie mindestens 6 mal mit kaltem Reinstwasser. </li></ol></li><li> Abscheiden der ersten Lipidschicht <ol><li> Platzieren PTFE Tabletts in dem PTFE Gehäuse der Langmuir-Trog und dann füllt sie mit Reinstwasser. </li><li> Verwenden, um die Steuersoftware der Langmuir Vorrichtung den gemessenen Druck auf 0 mN / m einzustellen. </li><li> Verwenden, um eine gasdichte Glas / Metall-Spritze 30 ul einer 1 mg / ml Lipidlösung abzuscheiden (1, 2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin (DOPC) in Chloroform) auf der Oberfläche des Wassers. Das Chloroform verdampft und die Lipidmoleküle spontan eine Monoschicht bilden. </li><li> Verwenden, um die Steuersoftware der Lipid-Monoschicht durch Schließen der PTFE Barriere bis zum gewünschten Druck (27 mN / m für DOPC) zu komprimieren, erreicht ist. </li><li> Verwenden, um die Steuersoftware des Glasobjektträger in dem Abschnitt mit Hilfe eines motorisiertes Klemme 2.5.2 in das PTFE-Gehäuse bereit zu tauchen. </li><li> Halten der Folie in der Klemme, die senkrecht zu der Luft-Wasser-Grenzfläche. Mit der Steuer-Software es langsam zu erhöhen (15 mm / min) über die Schnittstelle, während einen konstanten Druck auf 27 mN / m gehalten wird. </li><li> In einer trockenen Umgebung entweder für die sofortigen Gebrauch oder für die Speicherung von bis zu 24 h bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li></ol></li><li> Abscheidung der zweiten Lipidschicht <ol><li> Aufrechterhaltung des Oberflächendruckes in dem Langmuir-Trog auf dem gewünschten Wert von 27 mN / m. Komprimieren Sie die Verwendung vonSteuersoftware der Langmuir-Vorrichtung und / oder eine geringe Menge an Lipid fügen den gewünschten Druck zu erreichen. </li><li> Platzieren Sie die Glasobjektträger tragen, die Lipid-Monoschicht, hergestellt in Abschnitt 3.2.6, horizontal auf der Oberfläche des Wassers. Stellen Sie sicher, dass jede Folie über einer PTFE-Schale schwimmt. </li><li> Schieben die Glasobjektträger nach unten, eine Folie zu einem Zeitpunkt, in sein entsprechendes Fach PTFE verwendet PTFE oder Metallpinzette, so dass sie in das Wasser eingetaucht sind. Vermeiden Sie die Folien Kippen während schieben. </li><li> Verwenden PTFE oder Metallpinzette, die PTFE Böden enthalten die Objektträger in einen Kristallisator mit Reinstwasser sicherstellen gefüllt zu übertragen, dass die Schieber nicht der Luft ausgesetzt sind. </li><li> Verwenden PTFE oder Metallpinzette zu übertragen, während unter Wasser arbeiten, ein zweischichtige beschichteten Glasobjektträger in eine Beobachtungskammer. HINWEIS: Die Beobachtungskammer wird unter Wasser in dem Kristallisator gegeben. Die Beobachtungskammer ist nach Maße und besteht aus einem PTFE-Ring mit einer Gummidichtung einesd Stahlgehäuse, die unter Wasser zusammengesetzt werden können, um eine wasserdichte Kammer, deren Bodenfläche der zuvor von dem Glasobjektträger mit der Lipiddoppelschicht beschichtet ist, hergestellt zu machen. </li><li> Schließen die Kammer während sie weiterhin unter Wasser zu arbeiten, und um sicherzustellen, dass ca. 1 ml Wasser wird in der Kammer gefangen. </li><li> Nehmen Sie die zusammengesetzte Kammer aus dem Wasser. Stellen Sie sicher, dass es wasserdicht und leckagefrei. </li><li> Setzen Sie die 1 ml ultrareinem Wasser, die in der Beobachtungskammer mit PBS durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul 10-fach PBS. Stellen Sie sicher, dass die Kammer nie frei von Flüssigkeit ist. </li></ol></li><li> SLB Blockierungsschritt <ol><li> Einführung von 100 ug / ml Rinderserumalbumin (BSA) in der Beobachtungskammer die Folie, hergestellt in Abschnitt 3.3.6 und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C) enthält. </li><li> Spülen Sie die Bilayer durch Entfernen und Hinzufügen von 500 ul 10-fach PBS. Die Bilayer kann 24 h bei 4 ° C aufbewahrt werden. </li></ol></li></ol> 4. Funktionalisierung mit Liganden <ol><li> Hinzufügen fluoreszierende oder nicht fluoreszierende Neutravidin (NAV, eine deglykosylierte Version von Avidin nicht bei pH 7 geladen) bei 2 &amp; mgr; g / ml in die Kammer, um die Folie in Abschnitt 3.4.2 für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° hergestellt, enthaltend C). </li><li> Spülen durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul 10-fach PBS. </li><li> Hinzufügen biotinylierten anti-CD3 bei 2 ug / ml in die Kammer, um den Schieber in Abschnitt 3.4.2 enthält, hergestellt. Bei Doppel Funktionalisierung des SLB und die Punkte, fügt Fc-ICAM-1 His-Tag bei 5 &amp; mgr; g / mL (hier die Doppelschicht aus DOPC + 1% Nitrilotriessigsäure (NTA) Lipiden hergestellt wird). Lassen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C). </li><li> Spülen durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul PBS 10mal </li><li> Ersetzen der PBS mit Zellmedium (PBS + 0,1% BSA) durch Zugabe und 500 &amp; mgr; l des Zellmediums 10 mal entfernt wird. </li><li> Lassen Sie 200 ul Zellmedium in der chambeR mit der Folie. </li><li> Platzieren Sie die Kammer für 10 min bei 37 ° C vor der Zugabe von Zellen. </li></ol> 5. Zellablage (Referenz 7 für Details) <ol><li> deponieren vorsichtig 400 ul der Zellsuspension in die Kammer. Inkubieren der Zellen für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Fix die Zelle mit 2% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei 37 ° C. Ersetzen des PFA mit PBS durch wiederholte Entfernung und Zugabe von 500 &amp; mgr; l PBS. </li></ol> 6. Beobachtung <ol><li> Proteo-lipidischen Nanomuster und SLB Fluidität <ol><li> Verwenden eines Fluoreszenzmikroskops dem Bild das Proteinmuster im Auflicht-Fluoreszenz - Modus geeignete Beleuchtungswellenlänge (639 nm) und Filterwürfel (zB hier EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688). HINWEIS: Die Intensität des Signals kann die Menge an Protein innerhalb und außerhalb des Punktes abzuschätzen quantifiziert werden. Verwenden, um eine geeignete Beleuchtungswellenlänge (330 nm) und Filter Würfel Bild mit der Doppelschicht (BP 365/12, FT 395, LP 397), die mit dunkelen Löchern hell erscheint. </li><li> Verwenden kontinuierliche Fotobleich (CPB) -Technik 13, 15 , um die Diffusionskonstante des Tracers Lipide in der Doppelschicht zu messen. Diese Beobachtung wird vorzugsweise kurz nach der SLB Abscheidung hergestellt. ANMERKUNG: Um die Diffusionskonstante, zwei Parameter gemessen, während CPB Prozess zu quantifizieren: die spezifische Bleichzeit des Farbstoffs (Taut) und die Abklinglänge des Fluoreszenzprofil des Halo um die gebleichte Fläche (Taud) gebildet ist. Die erste ist durch Aufzeichnen der Zeitentwicklung der Fluoreszenzintensität in der Mitte des beleuchteten Feldes während des CPB Verfahrens erhalten. Das zweite ist, die durch Auftragen der Intensitätsprofil am Rand des ausgeleuchteten Zone (gemittelt über 12 Zeilen und 5 Bilder nach dem stationären Zustand erreicht ist) erhalten. Die Kurven sind ausgestattet Taut und Taud zu erhalten. Die Diffusionskonstante wird durch ta gegebenuD 2 / Taut (D = <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die kritischen Schritte in dem oben beschriebenen Protokoll werden zur Bildung der Nano dots Protein verwandt oder der Hinterfüllen des Raumes um die Punkte, die durch einen unterstützten Lipiddoppelschicht. Der erste kritische Schritt in Bezug auf Protein-Nanopunkten ist die Herstellung der Wulstes-Maske. Die Reinigung des Deckelschlitten ist kritisch. Die Folien müssen entweder mit einer Reinigungslösung gereinigt werden, die für die Reinigung von Quarzküvetten, oder mit einem Sauerstoffplasma wird empfohlen. Andere Reinigungstechniken wie Eintauchen in Ethanol oder iso-Propanol Behandlung nicht machen das Glas nicht ausreichend hydrophil, und daher nicht die Bildung einer große Abdeckung bead einschichtigen unterstützen. Zur gleichen Zeit muss die Oberfläche der Folie mit dem nachfolgenden Schritt der Bildung des SLB von Langmuir-Blodgett - Technik 7, 15, 16 kompatibel sein. Der nächste entscheidende Schritt ist die Abscheidung und Entfernung von einemluminum. Wenn die Abscheidung über Sputtertechnik ist, wie hier geschehen, soll das Ziel mit Silicium dotiert werden (bei 1%). Andernfalls, wenn das Ziel aus reinem Aluminium hergestellt ist, ist die aufgebrachte Schicht hart mit der Alkalihydroxid-Lösung zu entfernen, wie oben beschrieben, wahrscheinlich wegen der Bildung von Aluminiumoxid und Dringen zwischen dampften Aluminiumschicht und Glasobjektträgern-Substrat. Die Dauer der Ablagerung bestimmt die Größe der Proteinpunkte 9 aber hier sind wir mit einer einzigen Abscheidungszeit und damit einzelner Punktgröße gearbeitet haben. Die Probe kann unter Umgebungsbedingungen für mehrere Monate nach der Aluminiumabscheidung und für etwa eine Woche nach der Ablagerung von BSA-Biotin gespeichert werden. Der zweite entscheidende Schritt betrifft die Abscheidung des SLB. Die Reinigung der Glasabdeckung-Schlitten ist wiederum ein entscheidender wichtiger Punkt. Wie sollte der Fall für jeden Langmuir-Blodgett Ablagerung Arbeit, die alle das verwendete Material aus Glas oder Po werdenlytetrafluoroethylene (PTFE) und sollte peinlich sauber sein. Nach dem Abscheiden der ersten Lipid-Monoschicht können die deckel Folien für ein paar Tage gelagert werden, aber nach der Ablagerung der zweiten einschichtigen, müssen sie sofort verwendet werden. Während wir das Protokoll für die Erstellung von Anti-CD3 - Nanopunkten zur Verwendung in T - Lymphozyten - Adhäsion Studien 9, 13 gezeigt haben, ist das Verfahren sehr flexibel und kann für jedes biotinylierte Protein angepasst werden. Die Zusammensetzung der Lipid-Doppelschicht lassen sich leicht verändert, und es kann ferner, falls gewünscht funktionalisiert werden. Ein wichtiger Punkt ist die mögliche unspezifische Absorption von Proteinen, insbesondere an der Lipid-Doppelschicht, die Punkte umgeben. Die Haupteinschränkung der Technik ergibt sich aus der Verwendung von kolloidalem bead-Selbstorganisation für die primäre Maske. Als eine Bottom-up-Technik, teilt es einige der Probleme aller dieser Ansätzezum Beispiel Mangel an Flexibilität und volle Kontrolle über die Musterform. Das Muster Gitter reflektiert notwendigerweise die Symmetrie der Wulst Maske und ist daher immer hexagonal. Die Form des Musters Motiv ist ein Kreis und wird durch eine Kombination von sicken Größe und die Dauer der Aluminiumabscheidung 9, 13 bestimmt. Alternative Techniken für die Steuerung der Punktgröße haben auch 14 vorgeschlagen worden, 17, 18. Substrate Nanostrukturen mit Proteinen, Proteinfragmenten oder Peptiden , wurden in der Vergangenheit zur Sonde Zelloberflächen - Wechselwirkungen, insbesondere Adhäsion Migration 19 und 20 umfangreich verwendet. Pionierarbeit hat gezeigt , dass Gewebe bildenden Zellen nicht auf Muster mit einer Steigung größer als eine gegebene Schwelle 21 und eine weitere Untersuchung sho auszubreiten<html> vermählen , daß die Längenskala dieses Phänomens durch die Größe der Talins eingestellt ist, der bei der Verknüpfung von Integrin - Rezeptoren an den Aktin - Zytoskelett 22 instrumental ist. in all diesen Studien wurden die Proteine ​​jedoch an Gold-Nanoteilchen verbunden, die sich auf dem Glas immobilisiert wurden. Im Rahmen von T - Zellen, Proteolipid - Membranen, die typischerweise Antigen - präsentierenden Zellen nachahmen, wurden grundlegende Aspekte der T - Zell - Funktion 6 ausgiebig genutzt zu verstehen. Ingenious Nanostrukturierungstechniken verwendet worden , um corrals zu schaffen , mit Metallbarrieren Trenn Proteins funktionalisierte SLB - Patches, der Einblick in die Struktur und die Konnektivität der T - Zell / APC - Schnittstelle 23 zur Verfügung gestellt hat. Diese Art von Nano-Strukturierung ist jedoch sehr verschieden von den Protein-Nanopunkten hier vorgeschlagen. Vor kurzem wurden Nanoclustern mit chemischer Bindung der Protein funktionalisierte Lipiden erstelltss = „Xref“&gt; 3, die auf der Folge der Rezeptor clustering beleuchten. Der Vorteil war, dass, im Gegensatz zu dem vorliegenden Fall ist die Cluster im Prinzip selbst mobil sein könnten. Allerdings ist eine solche spontan gebildeten Cluster notwendigerweise weniger gut in Bezug auf Größe und Dichte als vorgeformter Protein Nano Punkte hier beschrieben gesteuert. Wir sehen, dass das Protein Nano-Punkt verziert SLBs hier vorgestellten verwendet werden kann, verschiedene Aspekte der Zell-Zell-Adhäsion zu untersuchen. Eine offensichtliche Frage , die sich stellt , ist , ob, wie oben beschrieben , für die Gewebe bildenden Zellen 19 auch Lymphozyten eine intrinsische Längenskala mit Adhäsion verbunden. Vorläufige Ergebnisse scheinen , daß zumindest um anzuzeigen , wenn die Haftung durch den TCR - Komplex vermittelt wird, ist die Dichte der Liganden statt Abstand der definierende Parameter zum Spreizen und Aktivierung 10, 11, 12 <sup&gt; 13. Ob die Aufnahme von mobilen Liganden in den umgebenden SLB Auswirkungen dieser Beobachtung und wie die mobile und immobile Fraktionen zusammenarbeiten , ist eine mögliche Frage, die teilweise unter Verwendung adressierte selbstorganisierende SLB gebundenen Cluster 24. Eine weitere interessante Anwendung wird im Zusammenhang mit den mechano-Erfassungs sein , wo die Zelladhäsion / Aktivierung auf mobil und immobilisiertem Liganden wurde verschiedene gezeigt wird , nicht nur für T - Zellen , 7, 25 , sondern auch für Zellen , die gewöhnlich an die extrazelluläre Matrix 26 haften. Die beiden Hauptvorteile dieser Proteolipid-Muster sind die Kompatibilität der Substrate mit fortschrittlicher optischer Mikroskopie und den einfachen Zubereitung, die sie kompatibel mit Einsatz-and-Throw-Anwendungen macht. Im Anschluß an die Aluminiumabscheidung, alle Herstellungsschritte auf einem Standard-wet-lab durchgeführt werden kann bench. In der Zukunft kann es, daß das mit Aluminium beschichtete und Glas-gestützten bead-Masken in einer spezialisierten Einrichtung übertragen werden und wie und in biologischen Laboratorien für die Verwendung gespeichert hergestellt ins Auge gefasst werden, wenn erforderlich. In diesem Sinne sind wir der Meinung, dass diese Substrate das Potenzial haben, die Plattform der Wahl zu werden für die Untersuchung der Wechselwirkung von Zellen mit kontrollierter Nano gemusterten proteo-lipidic Membranen.

<html> Zelladhäsion erfolgt durch spezialisierte Zelladhäsionsmoleküle (CAMs), Proteine, die auf der Zellmembran, die zu ihrem Gegenstück der Bindung auf der extrazellulären Matrix oder auf einem anderen Zelle fähig sind. Auf adhärierten Zellen, die meisten Adhäsionsmoleküle , einschließlich der allgegenwärtigen Integrin und Cadherin, werden in Form von Clustern 1 gefunden. Die Wechselwirkung von T-Lymphozyten (T-Zellen) mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) stellt ein besonders treffendes Beispiel für die Bedeutung des Rezeptor-Cluster an der Grenzfläche zwischen den beiden Zellen gebildet - oft eine immunologischen Synapse bezeichnet. Bei der Bildung die erste Berührung mit dem APC, T - Zell - Rezeptoren (TCRs) auf der Oberfläche der T - Zellen - Form micron Skala Cluster , die dazu dienen , als Signalisierungsplattformen 2, 3, 4, und werden schließlich zentralisieren einen größeren zentralen supramolekularen Cluster zu bilden (cSMAC )lass = &quot;Xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Vor kurzem wurde es , dass auf der APC Seite gezeigt, die Liganden des TCR sind auch 8 gebündelt. Im Zusammenhang mit der T - Zell-APC - Interaktion, die Bereitstellung von Hybrid - Systemen, wo der APC durch eine künstliche Oberfläche funktionalisierte mit relevanten Proteinen nachgeahmt wird, vorgerückt ist unser Verständnis der synaptischen Schnittstelle 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In diesem Zusammenhang ist es höchst relevant APC-Mimetikum Oberflächen zu gestalten, dass ein oder mehr Aspekte der Zielzelle erfassen. Wenn beispielsweise Liganden auf unterstützte Lipiddoppelschichten aufgepfropft werden, können sie in der Ebene der Doppelschicht diffundieren, ahmen die Situation auf der APC Oberfläche und zur gleichen Zeit der Bildung des erlaubencSMAC 6, 7. Ähnlich haben die Cluster auf der APC nachgeahmt von 14 Inseln von Liganden in einem Meer von Polymeren , 9, 10, 11, 12, 13, zu schaffen. Allerdings haben diese beiden Merkmale bisher nicht kombiniert. Hier beschreiben wir eine neuartige Technik Nano-Dots von Anti-CD3 zu erzeugen (ein Antikörper, der den TCR-Komplexes Targets) von einer Lipiddoppelschicht mit diffundierenden Lipiden umgeben. Die Bilayer wird unter Verwendung von Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schäfer - Technik abgeschieden 7, 15, 16 und , falls gewünscht, könnte mit einem bestimmten Protein funktionalisiert werden - beispielsweise der Ligand der T - Zell - Integrin (genannt ICAM1). Darüber hinaus cou die anti-CD3-Protein dotsld mit einem anderen Antikörper oder CAM ersetzt werden. Während wir die Proteine, die für die zukünftige Nutzung als Plattform für die T-Zell-Adhäsion Studien gewählt haben, detailliert die Strategie hier kann für jedes Protein und sogar DNA angepasst werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Assistent, Karl Hecht KG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observation chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td>
			<td>Hella Analytics</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Labbox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizer&#160;</td>
			<td>Shott</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidine</td>
			<td>Thermo Fischer Scientifique</td>
			<td>84607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water MQ&#160;</td>
			<td>ELGA, Veolia France</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Corpuscular Inc</td>
			<td>147114-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A3648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A8549</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dansyl-PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810330C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>650471</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe&#160;</td>
			<td>Dominique Dustcher , France</td>
			<td>74453</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film balance</td>
			<td>NIMA</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>TIRF-III system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Target&#160;</td>
			<td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&#232;me&#160;</td>
			<td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Derzeit gibt es ein beträchtliches Interesse an in einem Meer von passivierten Oberfläche geordnete Anordnungen von Adhäsionsprotein Inseln zu schaffen für zellbiologische Untersuchungen. In den letzten Jahren hat es immer deutlicher, dass lebende Zellen reagieren, nicht nur auf die biochemische Natur der Moleküle ihnen vorgestellt, sondern auch auf die Art, wie diese Moleküle präsentiert werden. Erstellen von Protein Mikromuster wird deshalb jetzt Standard in vielen biologischen Laboratorien; Nanostrukturen sind auch zugänglich. Doch im Zusammenhang mit den Zell-Zell-Interaktionen, besteht ein Bedarf an Mustern nicht nur Proteine, sondern auch Lipid-Doppelschichten. Solche Dual proteo-lipidic Musterung ist bisher nicht leicht zugänglich. Wir bieten eine einfache Technik Protein Nanopunkte auf Glas und schlagen ein Verfahren zu schaffen unterstützten den Zwischenpunktraum mit einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) verfüllen. Vom Fotobleichen des Tracers enthalten fluoreszierende Lipide im SLB, zeigen wir, dass die Doppelschicht in-pl erhebliche aufweistane Fluidität. Funktionalisierung der Proteinpunkte mit fluoreszierenden Gruppen ermöglicht es uns, Bild sie und zu zeigen, dass sie in einem regelmäßigen hexagonalen Gitter geordnet. Die typische Punktgröße beträgt etwa 800 nm und der Abstand hier gezeigt, ist 2 um. Diese Substrate werden erwartet als nützliche Plattformen für die Zelladhäsion, Migration und mechano-Sensing-Studien dienen.

Die Fluoreszenzbilder wurden analysiert, um den Abstand und die Größe der Punkte zu messen. Typische Abstände wurden gefunden 1.900 ± 80 nm und typischer Punktgrßenauswahlmittel sein betrug 600 ± 100 nm (Figur 1g). Der Abstand wird durch die Größe der Perlen für die Maske verwendet, eingestellt. Die Punktgröße wird durch die sickenGröße sowie Abscheidebedingungen eingestellt. Der SLB ist eindeutig um die Protein - Punkte und nicht auf sie (Figur 2), mit perfekter Komplementarität zwischen den in SLB Abbildungskanal und die Punkte in dem NAV Abbildungskanal gesehen Löcher abgeschieden. Analyse der fortlaufenden Fotobleich Daten zeigen , daß die Lipide in der gemusterten Bilayer bleiben flüssig und haben eine typische Diffusionskonstante von 5 um² / s (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Herstellungsschritte. (a </strOng&gt;) Primärperlenmaske. Inset zeigt eine rasterelektronenmikroskopische (REM) Bild der Maske, mit Perlen von 2 &amp; mgr; m Durchmesser hergestellt und mit einer dünnen Schicht aus Aluminium bedeckt ist. Parameter in diesem Bild verwendet werden , sind: nominal Aluminiumdicke 200 nm bei 400 W RF, Anfangsdruck von 9 x 10 -7 Torr, 10 sccm Argon flux, 6,2 mTorr, abzubildenden Prozessdruck bei einer Beschleunigungsspannung von 5 kV abgesetzt. Die Bilder bestätigen Beobachtung mit optischer Mikroskopie (Bild nicht enthalten), bevor die Aluminiumabscheidung, die die Kügelchen in einer Monoschicht zentriert hexagonalen Gitter auf dem Glas-Objektträger angeordnet sind. (B) Sekundärmaske von Aluminium durch die Sputter - Abscheidung nach der Entfernung der primären bead-Maske erzeugt. (C) Abscheidung von Organosilan und BSA-Biotin , obwohl die Sekundärmaske. (D) Entfernung von Aluminium offenbart Nanopunkte BSA-Biotin. (E) Ablagerung von SLB. (F) Bindung an BSA-NaV Biotin. (G) Die Bindung<html> anti-CD3 NIW. Inset zeigt epi-Fluoreszenzbild der Nanopunkte-Arrays. Hier ist der NIW fluoreszierend markiert. Typische Punktgröße ist 600 ± 100 nm und typischer Abstand beträgt 1.900 ± 80 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55060/55060fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55060/55060fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig2.jpg" /> Abbildung 2: Komplementarität der nano-Punkt und SLB Muster. (A, b) Epi-Fluoreszenzbilder von fluoreszierenden Nano NaV Punkte und von SLB mit fluoreszierenden Tracers Lipiden. (C) zusammengesetzte Bild des NaV Punktes (rot) in dem Meer von SLB (grün) zeigt perfekte Komplementarität der NaV und SLB. Fast-Fourier-Transformation (FFT) Bild in der Einfügung anzeigt Fernordnung. Maßstabsbalken: 4 um.rge.jpg“target =‚_ blank‘&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig3.jpg" /> Abbildung 3: Quantifizierung des Lipids Diffusion in der SLB. (A) Epi-Fluoreszenzbild eines SLB vor dem Bleichen. Die Protein-Punkte zeigen, wie dunkle Löcher in einem hellen Meer von Lipiden auf. Die Feldblende begrenzt den beleuchteten Bereich. (B) Epi-Fluoreszenz von SLB Nach 50 s kontinuierlich Bleichen. Der Halo sichtbar innerhalb der Region durch die Feldblende begrenzt zeigt an, dass die Lipide mobil sind. Maßstabsbalken: 10 &amp; mgr; m. (C) Durchschnittsintensitätsprofil entlang der Kante des Feldblende (oben) und den Verfall der Intensität über die Zeit während des Prozesses beaching (unten). Diese Daten werden analysiert, um die Diffusionskonstante zu extrahieren, die in der Regel 5 um² / s ist.

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K Aufrufe.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen. 

Serie: Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.