Ringraziamo Laurent Limozin, Pierre Dillard e Astrid Wahl per continuare discussioni fruttuose su applicazioni cellulari. Ringraziamo anche Frederic Bedu dalla struttura camera bianca PLANETE per il suo aiuto con le osservazioni SEM. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Consiglio europeo della ricerca tramite concessione n ° 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.

1. pulizia del vetro Cover-diapositive e di osservazione Chambers <ol><li> Disporre il vetro di copertura-scorre su un vassoio multi-slide in materiale inerte, come politetrafluoroetilene (PTFE). </li><li> Immergere il vassoio con scivoli e la camera di osservazione in una soluzione di tensioattivo (qualsiasi prodotto consigliato per pulizia cuvette di quarzo è adatto). </li><li> Utilizzando un bagno ad ultrasuoni, ultra-sonicato nella soluzione di tensioattivo per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Lavare 5 volte con acqua ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0.059 mS / cm). </li><li> Ultra-ultrasuoni in soluzione di tensioattivo per 30 min a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Risciacquare 10 volte con acqua ultrapura. </li><li> Ripetere i punti 1.5 e 1.6 due volte. </li><li> Conservare in acqua a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C) per un massimo di una settimana. </li></ol> 2. Realizzazione di proteine ​​Nano-punti <ol><li> Deposizione di perline <ol><li> Deposit la sospensione di perline di silice (2% v / v, 70 mL) goccia a goccia su un coperchio-slitta (24 x 24 mm, spessore 170 um) tenuti con un&#39;inclinazione di 15 gradi. </li><li> Lasciate che la sospensione si sviluppa per circa 1 minuto, mentre sfogliando il vetro di 90 ° ogni 15 s. </li><li> Che il liquido evapori in condizioni ambiente. </li><li> Conservare in un bicchiere pulito o camera PTFE in condizioni ambiente per un massimo di 2 giorni. </li></ol></li><li> Deposizione di alluminio <ol><li> Porre i vetrini (preparati in sezione 2.1) all&#39;interno una frequenza radio (RF) magnetron sputtering attrezzature 8, su una tavola rotante ad una distanza di circa 105 mm dal in alluminio (99%): silicio (1%) porta. </li><li> Pump down della camera di deposizione a 2,6 x 10 -4 Pa utilizzando una pompa turbomolecolare. Questo passaggio è importante per la rimozione di eventuali impurezze gassose. </li><li> Introdurre pura atmosfera di Argon (5N, 99,999%) con un flusso di 10 sccm a una pressione di 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; NOTA: L&#39;argon flusso in ingresso è controllato da un controllore di flusso di massa e la pressione di processo è controllata mediante un manometro. Il flusso di gas argon è continua ed è controllato da un equilibrio tra l&#39;ingresso e l&#39;apertura delle valvole di uscita. </li><li> Accendere il generatore di potenza RF. NOTA: Qui, è stata utilizzata una gamma tipica di 400-600 W di potenza a radiofrequenza a frequenza 13,56 MHz. Il generatore RF viene utilizzato con una rete di adattamento in una modalità di accoppiamento capacitivo plasma. La potenza riflessa è monitorata e minimizzata utilizzando l&#39;adattamento rete. </li><li> Dopo il plasma è stabilizzato, sputter per 2 min mantenere l&#39;otturatore chiuso per rimuovere eventuali impurezze dalla superficie del bersaglio. </li><li> Aprire l&#39;otturatore e consentire lo sputtering proseguire per 60 min per depositare alluminio sul vetrino ad uno spessore di 200 nm. </li><li> Tagliare il flusso di argon, chiudere la valvola a saracinesca per isolare la pompa turbomolecolare dalla camera di deposizione e sfiatare la camera con pulito nitrogen per ottenere la pressione ambiente. Recuperare i vetrini rivestiti di alluminio. Conservare fino a un mese in una scatola di vetro o PTFE pulito e chiuso ermeticamente in condizioni ambientali. </li></ol></li><li> deposizione a vapore di organosilano <ol><li> Immergere il vetrino rivestito di alluminio-preparata nella fase 2.2.6 in acqua ultrapura a temperatura ambiente e ultra-ultrasuoni per 30 s in bagno ad ultrasuoni (50 W, 50/60 Hz, tra 20 e 30 ° C). </li><li> Deposito 0,5 mL di (3-amminopropil) -triethoxysilane (APTES) al fondo di un essiccatore. ATTENZIONE: APTES è un organosilano, che evapora facilmente ed è tossico. APTES devono essere trattati solo sotto un flusso cappuccio e con i guanti. </li><li> Mettere i vetrini (preparati in 2.3.1) su una griglia ceramica e posto all&#39;interno essiccatore. </li><li> Collegare l&#39;essiccatore ad una pompa a membrana e funzionare alla massima potenza per 30 min per generare un basso vuoto. </li><li> Chiudere la valvola di essiccatore e spegnere la pompa. </li><li> Scaldare l&#39;essiccatorea circa 50 ° C per 1 h. </li><li> Aprire un essiccatore e raccogliere le diapositive. </li><li> Trasferimento ad un altro essiccatore pulito per memorizzare fino a 48 ore a temperatura ambiente (da 20 a 30 ° C). </li></ol></li><li> Deposizione di primo strato di proteine ​​- sieroalbumina bovina marcata con biotina (BSA-biotina) <ol><li> Mettere uno dei vetrini preparati nella sezione 2.3 su un supporto in PTFE. </li><li> Cassetta 1 ml di 25 mg / ml BSA-biotina sciolti in tampone fosfato isotonico (PBS). Lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente (da 20 a 30 ° C). </li><li> Risciacquare 10 volte con PBS. Conservare il campione fino a 24 ore a 4 ° C al riparo dalla sorgente luminosa. </li></ol></li><li> Rimozione di maschera in alluminio <ol><li> Incubare i vetrini in una soluzione di NaOH in PBS (preparato da gocce di NaOH 1 M e circa 100 ml di PBS per ottenere pH≈12) durante la notte a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). ATTENZIONE. NaOH è corrosivo e deve essere maneggiato con i guanti. </li><li> Sciacquare10 volte in acqua ultrapura. </li></ol></li></ol> 3. Deposizione di supportati doppio strato lipidico (SLB) <ol><li> Pulizia della depressione Langmuir <ol><li> Rimuovere l&#39;acqua nel contenitore PTFE del trogolo Langmuir utilizzando una pompa. </li><li> Pulito con un panno monouso non tessuto privo di lanugine imbevuto di cloroformio. ATTENZIONE. Il cloroformio è tossico e deve essere manipolato in un&#39;area ben ventilata, con una maschera (o sotto flusso-cappa) e con i guanti appropriati. </li><li> Pulite 4 volte con acqua ultrapura tiepida (40 a 50 ° C). </li><li> Pulire almeno 6 volte con acqua ultrapura fredda. </li></ol></li><li> Deposizione del primo strato lipidico <ol><li> Posizionare i vassoi di PTFE nel recinto PTFE del trogolo Langmuir e poi riempirlo con acqua ultrapura. </li><li> Utilizzare il software di controllo dell&#39;apparato Langmuir per impostare la pressione misurata a 0 mN / m. </li><li> Utilizzare una siringa di vetro a tenuta di gas / metallo di depositare 30 microlitri di una / soluzione lipidica mL 1 mg (1, 2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) in cloroformio) sulla superficie dell&#39;acqua. Il cloroformio evaporare e le molecole lipidiche spontaneamente formano un monostrato. </li><li> Utilizzare il software di controllo per comprimere il monostrato lipidico chiudendo la barriera PTFE fino alla pressione desiderata (27 mN / m per DOPC) viene raggiunto. </li><li> Utilizzare il software di controllo di immergere il vetrino preparato in sezione 2.5.2 nel contenitore di PTFE utilizzando un morsetto motorizzato. </li><li> Tenere il vetrino, nel morsetto, perpendicolare all&#39;interfaccia aria-acqua. Utilizzare il software di controllo di aumentare lentamente (15 mm / min) attraverso l&#39;interfaccia, mantenendo costante la pressione a 27 mN / m. </li><li> Posto in un ambiente secco sia per uso immediato o per la conservazione fino a 24 ore a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li></ol></li><li> Deposizione del secondo strato lipidico <ol><li> Mantenere la pressione superficiale nel trogolo Langmuir al valore desiderato di 27 mN / m. Comprimere utilizzando ilsoftware di controllo del dispositivo e / o Langmuir aggiungere una piccola quantità di lipidi per ottenere la pressione desiderata. </li><li> Porre i vetrini trasportano il monostrato lipidico, preparato in sezione 3.2.6, orizzontalmente sulla superficie dell&#39;acqua. Assicurarsi che ciascuna slitta galleggia sopra un vassoio PTFE. </li><li> Spingere i vetrini giù, una diapositiva alla volta, nel suo vassoio di PTFE corrispondente con PTFE o metallo pinzette tale che sono immersi in acqua. Evitare di inclinare le diapositive mentre si spinge. </li><li> Utilizzare PTFE o metallo pinzetta per trasferire i vassoi di PTFE contenenti i vetrini in un cristallizzatore riempito con acqua ultrapura assicurandosi che i vetrini non sono esposti all&#39;aria. </li><li> Utilizzare PTFE o metallo pinzette per trasferire, mentre lavora sott&#39;acqua, un doppio strato rivestito vetrino in una camera di osservazione. NOTA: La camera di osservazione è posto sotto acqua all&#39;interno del cristallizzatore. La camera di osservazione è personalizzato e costituito da un anello in PTFE con una guarnizione in gommaintelaiature d&#39;acciaio d, che possono essere assemblati subacqueo per fare una camera stagna la cui superficie inferiore è realizzato dal vetrino precedentemente rivestito con il doppio strato lipidico. </li><li> Chiudere la camera pur continuando a lavorare sott&#39;acqua e assicurando che circa 1 mL di acqua è intrappolato all&#39;interno della camera. </li><li> Prendere la camera assemblato fuori dall&#39;acqua. Assicurarsi che è libero a tenuta d&#39;acqua e perdite. </li><li> Sostituire i 1 ml di acqua ultrapura presente nella camera di osservazione con PBS aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS per 10 volte. Assicurarsi che la camera non è mai priva di liquido. </li></ol></li><li> SLB passo blocco <ol><li> Introdurre 100 ug / ml di albumina di siero bovino (BSA) nella camera di osservazione contenente il vetrino preparato in sezione 3.3.6 e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Risciacquare bistrato rimuovendo e aggiungendo 500 pl di PBS per 10 volte. Il doppio strato può essere mantenuta 24 ore a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Funzionalizzazione con ligandi <ol><li> Aggiungere fluorescente o neutravidina non fluorescente (VPN, una versione deglicosilata di avidina non caricata a pH 7) a 2 ug / ml nella camera contenente il vetrino preparato in sezione 3.4.2 per 30 min a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Risciacquare aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS per 10 volte. </li><li> Aggiungere biotinilato anti-CD3 a 2 ug / mL alla camera contenente il vetrino preparato in sezione 3.4.2. Per doppia funzionalizzazione della SLB e puntini, aggiungere Fc-ICAM1 His-tag a 5 mg / ml (qui, il doppio strato è fatto di DOPC + 1% di acido nitrilotriacetico NTA) lipidi (). Lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Risciacquare aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS 10 volte </li><li> Sostituire la PBS con mezzo di cella (PBS + 0,1% BSA) aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri del mezzo cellulare 10 volte. </li><li> Lasciare 200 ml di media cella nel Chamber con la slitta. </li><li> Posizionare la camera per 10 min a 37 ° C prima di aggiungere le cellule. </li></ol> 5. cellulare Deposizione (rinvio 7 per i dettagli) <ol><li> depositare accuratamente 400 microlitri della sospensione cellulare nella camera. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C. </li><li> Fissare la cella con il 2% di paraformaldeide (PFA) per 15 min a 37 ° C. Sostituire il PFA con PBS mediante rimozione ripetuta e l&#39;aggiunta di 500 ml di PBS. </li></ol> 6. osservazione <ol><li> Proteo-lipidico Nano-modello e la fluidità SLB <ol><li> Utilizzare un microscopio a fluorescenza per l&#39;immagine del profilo proteico in modalità epi-fluorescenza utilizzando appropriata lunghezza d&#39;onda di illuminazione (639 nm) e cubi filtro (p.es. qui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688). NOTA: L&#39;intensità del segnale può essere quantificata per stimare la quantità di proteine ​​dentro e fuori il punto. Utilizzare opportuna lunghezza d&#39;onda di illuminazione (330 nm) ed fcubo ilter all&#39;immagine bistrato (BP 365/12, FT 395, LP 397), che appare luminoso con fori scuri. </li><li> Usare la tecnica continua fotobleaching (CPB) 13, 15 per misurare la costante diffusione dei lipidi traccianti nel doppio strato. Questa osservazione è preferibilmente realizzato subito dopo la deposizione SLB. NOTA: Al fine di quantificare la costante di diffusione, due parametri sono misurati durante CPB processo: il tempo sbianca specifica del colorante (teso) e la lunghezza di caduta del profilo fluorescente dell&#39;alone formata intorno alla zona sbiancato (TAUD). Il primo è ottenuto tracciando l&#39;evoluzione temporale della fluorescenza al centro del campo illuminato durante il processo di CPB. La seconda è ottenuta tracciando il profilo di intensità ai margini della zona illuminata (media su 12 linee e 5 immagini dopo il raggiungimento dello stato stazionario). Le curve sono montati avere tesa e TAUD. La costante diffusione è dato da tauD 2 / teso (D = <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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	<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster.">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immunological+Synapse:+A+Molecular+Machine+Controlling+T+Cell+Activation.">The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation.</a> Science. 285, 221-228 (1999).</li><li>Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-mediated+friction+determines+morphodynamics+of+spreading+T+cells.">Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells.</a> Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+viral+antigen+processing+generates+peptide-specific+MHC+class+I+cell-surface+clusters.">Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).</li><li>Pi, F., Dillard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Tunable+Organic+Nanodot+Arrays:+A+Versatile+Platform+for+Manipulating+and+Imaging+Cells.">Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells.</a> Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).</li><li>Deeg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation+is+determined+by+the+number+of+presented+antigens.">T cell activation is determined by the number of presented antigens.</a> Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).</li><li>Delcassian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+ligand+spacing+influences+receptor+triggering+in+T+cells+and+NK+cells.">Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells.</a> Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).</li><li>Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays.">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li><li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization.">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li><li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies.">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li><li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+intermembrane+distance:+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion.">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li><li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+tissue+surfaces+by+supported+membrane+coupled+ultra-thin+layer+of+hyaluronic+acid.">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li><li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography.">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li><li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+ordered+topographical+and+chemical+nano-features+from+anodic+alumina+templates.">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li><li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion.">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands.">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level.">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li><li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse.">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li><li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters.">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li><li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation.">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398 (2012).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi critiche nel protocollo sopra descritto sono legati alla formazione della proteina nano-punti o back-riempimento dello spazio intorno ai punti da un bistrato lipidico supportato. Il primo passo critico rispetto alle proteine ​​nano-dots è la preparazione del cordone maschera. La pulizia del coperchio-scivolo è critica. I vetrini devono essere sia pulito con una soluzione detergente che è raccomandato per pulizia cuvette di quarzo, o con plasma di ossigeno. Altre tecniche di pulizia come immersione in etanolo o trattamento iso-propanolo non rendono il vetro sufficientemente idrofila e quindi non supportano la formazione di un cordone monostrato grande copertura. Allo stesso tempo, la superficie del vetrino deve essere compatibile con la successiva fase di formazione della SLB da Langmuir-Blodgett tecnica 7, 15, 16. Il passo successivo è critica la deposizione e la rimozione di unluminum. Se la deposizione avviene tramite sputtering, come fatto qui, il bersaglio deve essere drogato con silicio (all&#39;1%). Altrimenti, se il bersaglio è in alluminio puro, lo strato depositato è difficile da rimuovere con la soluzione di idrossido alcalino come descritto sopra, probabilmente a causa della formazione di ossido di alluminio e compenetrazione tra lo strato di alluminio depositato ed il substrato vetrino. La durata della deposizione determina la dimensione dei punti proteici 9, tuttavia, qui abbiamo lavorato con un singolo tempo di deposizione e dimensione pertanto singolo punto. Il campione può essere conservato in condizioni ambiente per diversi mesi dopo la deposizione di alluminio e per circa una settimana dopo la deposizione di BSA-biotina. Il secondo passo cruciale riguarda la deposizione dello SLB. Pulizia del vetro di copertura-scivolo è di nuovo un punto cruciale importanza. Come è il caso per qualsiasi lavoro deposizione Langmuir-Blodgett, tutto il materiale utilizzato deve essere di vetro o di Polytetrafluoroethylene (PTFE) e dovrebbe essere scrupolosamente puliti. Dopo la deposizione del primo monostrato lipidico, i copri-vetrini possono essere conservati per un paio di giorni, ma dopo la deposizione del secondo monostrato, hanno bisogno di essere utilizzato immediatamente. Mentre abbiamo dimostrato il protocollo per la generazione di anti-CD3 nano-dots per l&#39;uso in studi linfociti T adesione 9, 13, la procedura è molto flessibile e può essere adattato per qualsiasi proteina biotinilata. La composizione del doppio strato lipidico può essere facilmente cambiata e può essere ulteriormente funzionalizzata se desiderato. Un punto importante da considerare è l&#39;eventuale assorbimento non specifico di proteine, in particolare sul doppio strato lipidico che circonda i puntini. La limitazione principale della tecnica deriva dall&#39;uso di colloidale-bead auto-assemblaggio per la maschera principale. Essendo una tecnica bottom-up, condivide alcuni dei problemi di tutti questi approcciper esempio, la mancanza di flessibilità e il pieno controllo della forma del modello. Il reticolo reticolo riflette necessariamente la simmetria della maschera tallone ed è quindi sempre esagonale. La forma del modello motivo è un cerchio ed è determinato dalla combinazione del cordone di dimensioni e la durata della deposizione di alluminio 9, 13. Tecniche alternative per il controllo della dimensione dei punti sono stati anche suggerito 14, 17, 18. Substrati nanomodelli con proteine, proteine-frammenti o peptidi sono stati ampiamente utilizzati in passato per sondare interazioni cellula-superficie, specialmente adesione 19 e migrazione 20. Pionieristica ha dimostrato che le cellule del tessuto formante riescono a diffondersi sui modelli con un passo maggiore di una certa soglia 21, e in seguito sho indagini<html> mer che la lunghezza scala di questo fenomeno è impostata dalla dimensione del Talins, strumentali nel collegare recettori di integrina alla actina citoscheletro 22. Tuttavia, in tutti questi studi, le proteine ​​sono state legate a oro nano-particelle, esse pure immobilizzato su vetro. Nel contesto delle cellule T, membrane Proteo-lipidico, tipicamente mimano cellule che presentano antigeni, sono stati ampiamente utilizzati per comprendere gli aspetti fondamentali della funzione delle cellule T 6. Tecniche di nano-patterning ingegnosi sono stati utilizzati per creare recinti con barriere metalliche proteine separazione patch SLB funzionalizzati, che hanno fornito comprensione della struttura e la connettività della cellula T / APC interfaccia 23. Questo tipo di nano-patterning è comunque molto diverso dalla proteina nano-punti proposti qui. Recentemente, nano cluster sono stati creati utilizzando linkage chimica delle proteine ​​funzionalizzato lipidiss = &quot;xref&quot;&gt; 3, che messo in luce la conseguenza di recettore clustering. Il vantaggio è che, a differenza del caso di specie, i cluster possono, in linea di principio essere se stessi mobili. Tuttavia, tali cluster spontaneamente formate vengono necessariamente meno ben controllati in termini di dimensioni e densità di preformati proteina nano-punti descritti qui. Prevediamo che la proteina SLB decorate nano-dot presentati qui può essere utilizzato per indagare i diversi aspetti di adesione cellula-cellula. Una domanda ovvia che si pone è se, come descritto sopra per tessuti formanti celle 19, linfociti anche avere un intrinseca lunghezza scala associata con adesione. I risultati preliminari sembrano indicare che almeno quando l&#39;adesione è mediata dal complesso TCR, la densità dei ligandi anziché spaziatura è il parametro di definizione per la diffusione e l&#39;attivazione 10, 11, 12 <sup&gt;, 13. Se l&#39;inclusione di ligandi mobili nei dintorni impatti SLB questa osservazione e come frazioni mobili e immobili lavorano insieme è una possibile domanda, parzialmente indirizzabile utilizzando SLB cluster legati autoassemblati 24. Un&#39;altra applicazione interessante sarà nel contesto di meccano-sensing dove adesione cellulare / attivazione su ligandi immobilizzati mobili ed hanno dimostrato di essere diversi non solo per le cellule T 7, 25, ma anche per le celle che abitualmente aderiscono alla matrice extracellulare 26. I due vantaggi principali di questi modelli Proteo-lipidico sono la compatibilità dei substrati con microscopia ottica avanzata e la facilità di preparazione che li rende compatibili con le applicazioni uso e getta. Successivamente alla deposizione di alluminio, tutte le fasi di preparazione possono essere eseguite su un banco di wet-lab norma. In futuro, si può prevedere che il tallone e maschere vetro supportato prodotte in una struttura specializzata vengono trasferiti e memorizzati nei laboratori di biologia per uso come e quando richiesto alluminio rivestito. In questa prospettiva, riteniamo che questi substrati hanno il potenziale per diventare la piattaforma di riferimento per lo studio della interazione delle cellule con membrane Proteo-lipidico nano-fantasia controllati.

<html> L&#39;adesione cellulare avviene attraverso le molecole di adesione cellulare specializzati (CAM), proteine ​​presenti sulla membrana cellulare che sono in grado di legarsi a loro controparte sulla matrice extracellulare o su un&#39;altra cella. Su cellule aderite, la maggior parte delle molecole di adesione tra cui l&#39;integrina onnipresente e caderina, si trovano in forma di cluster 1. L&#39;interazione dei linfociti T (cellule T) con cellule presentanti l&#39;antigene (APC) fornisce un&#39;illustrazione particolarmente sorprendente l&#39;importanza dei cluster recettori formata all&#39;interfaccia tra le due cellule - spesso chiamata sinapsi immunologica. Su formare il primo contatto con i recettori delle cellule APC, T (TCR) sulla superficie dei cluster scala forma cella micron T che servono come segnalazione piattaforme 2, 3, 4, e sono eventualmente centralizzati per formare un cluster centrale supramolecolare grande (cSMAC )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Recentemente, è stato dimostrato che sul lato APC, i ligandi del TCR sono raggruppati 8. Nel contesto di interazione cellule T-APC, l&#39;impiego di sistemi ibridi, in cui l&#39;APC viene imitato da una superficie artificiale funzionalizzata con proteine di interesse, ha notevolmente avanzato la nostra comprensione dell&#39;interfaccia sinaptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In questo contesto, è di grande rilevanza per la progettazione di superfici mimetiche APC che catturano uno o più aspetti della cellula bersaglio. Ad esempio, se ligandi sono innestate su bistrati lipidici supportati, possono diffondere nel piano del doppio strato, mimare la situazione sulla superficie APC e allo stesso tempo consentire la formazione dellacSMAC 6, 7. Analogamente, i cluster sulla APC sono stati imitato creando isole di ligandi in un mare di polimeri 9, 10, 11, 12, 13, 14. Tuttavia, queste due caratteristiche finora non sono stati combinati. Qui si descrive una tecnica innovativa per creare nano-dots di anti-CD3 (un anticorpo che bersaglia il complesso TCR) circondato da un doppio strato lipidico con i lipidi diffondenti. Il doppio strato viene depositato mediante Langmuir-Blodgett / tecnica Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 e, se desiderato, potrebbe essere funzionalizzato con una proteina specifica - per esempio, il legante di integrina cellule T (chiamato ICAM1). Inoltre, gli anti-CD3 punti proteina could essere sostituito con un altro anticorpo o CAM. Mentre abbiamo scelto le proteine ​​per uso futuro come piattaforma per gli studi di adesione cellulare T, la strategia dettagliato qui può essere adattato per qualsiasi proteina e persino il DNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Assistent, Karl Hecht KG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observation chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td>
			<td>Hella Analytics</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Labbox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizer&#160;</td>
			<td>Shott</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidine</td>
			<td>Thermo Fischer Scientifique</td>
			<td>84607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water MQ&#160;</td>
			<td>ELGA, Veolia France</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Corpuscular Inc</td>
			<td>147114-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A3648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A8549</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dansyl-PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810330C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>650471</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe&#160;</td>
			<td>Dominique Dustcher , France</td>
			<td>74453</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film balance</td>
			<td>NIMA</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>TIRF-III system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Target&#160;</td>
			<td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&#232;me&#160;</td>
			<td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Attualmente v&#39;è un notevole interesse per la creazione di array ordinati di isole di proteine ​​adesive in un mare di superficie passivata per gli studi di biologia cellulare. Negli ultimi anni, è diventato sempre più chiaro che le cellule viventi rispondono, non solo per la natura biochimica delle molecole presentati a loro, ma anche per il modo in cui queste molecole sono presentati. Creazione di proteine ​​micro-modelli è quindi ora di serie in molti laboratori di biologia; nano-modelli sono anche più accessibile. Tuttavia, nel contesto delle interazioni cellula-cellula, non v&#39;è la necessità di modello non solo proteine, ma anche doppi strati lipidici. Tale doppia patterning proteo-lipidica, non è stato finora facilmente accessibile. Offriamo una tecnica facile per creare proteine ​​nano-dots supportati su vetro e proporre un metodo per riempire lo spazio tra punti con un doppio strato lipidico supportato (SLB). Da fotometabolismo di tracciante lipidi fluorescenti incluse nel SLB, dimostriamo che il doppio strato presenta una considerevole in-plfluidità ane. Funzionalizzazione i puntini della proteina con gruppi fluorescenti ci permette di immagini di loro e per dimostrare che sono ordinate in modo regolare reticolo esagonale. La dimensione tipica punto è circa 800 nm e la spaziatura dimostrato qui è 2 micron. Questi substrati sono attesi per servire piattaforme utili per l&#39;adesione cellulare, la migrazione e studi meccano-sensing.

Le immagini di fluorescenza sono stati analizzati per misurare la distanza e la dimensione dei puntini. Spaziatura tipico è risultato essere 1.900 ± 80 nm e tipico dot-size era 600 ± 100 nm (Figura 1g). La spaziatura viene impostato dalla dimensione dei granuli utilizzati per la maschera. Dot-dimensioni è impostato dal tallone-size e condizioni di deposizione. La SLB è depositato unicamente attorno ai punti proteine e non sulla loro (figura 2), con perfetta complementarietà tra i fori osservati in canali di imaging SLB ei punti visti nel canale di imaging NAV. Analisi dei dati continui fotobleaching mostra che i lipidi nel doppio strato modellato rimanere fluida e avere una costante diffusione tipica su 5 μm² / s (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig1.jpg" /> Figura 1: Rappresentazione schematica di fasi di fabbricazione. (un </strong&gt;) maschera sferette. Inserto mostra un&#39;immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) della maschera, fatta con perline di 2 micron di diametro e ricoperta con un sottile strato di alluminio. Parametri utilizzati in questa immagine sono: alluminio spessore nominale 200 nm deposto a 400 W RF, pressione iniziale di 9 x 10 -7 Torr, Argon Flusso 10 sccm, pressione di processo 6.2 mTorr, ripreso in tensione di accelerazione di 5 kV. Le immagini confermano osservazione fornito con microscopia ottica (immagine escluso) prima deposizione di alluminio che le sfere sono disposte in un monostrato centrata reticolo esagonale sul vetro-scivolo. (B) maschera secondaria dell&#39;alluminio creato dalla deposizione per polverizzazione catodica dopo la rimozione del primario tallone maschera. (C) deposizione di organosilani e BSA-biotina se la maschera secondaria. (D) La rimozione di alluminio rivelare nano-dots di BSA-biotina. (E) Deposizione di SLB. (F) rilegatura NAV per BSA-biotina. (G) Binding<html> anti-CD3 al NAV. immagine epi-fluorescenza delle matrici nano-dots inserto mostra. Qui il NAV è fluorescente. Tipico dot-dimensioni è di 600 ± 100 nm e la spaziatura tipico è 1,900 ± 80 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55060/55060fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig2.jpg" /> Figura 2: complementarità del nano-dot e modello SLB. (A, b) immagini Epi-fluorescenza di fluorescenti NaV nano-puntini e di SLB con lipidi traccianti fluorescenti. (C) l&#39;immagine Composite dei puntini NaV (rosso) nel mare di SLB (verde) indica perfetta complementarità del NAV e SLB. immagini veloce di Fourier Transform (FFT) nel cestello indica ordine a lungo raggio. barra della scala: 4 micron.rge.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig3.jpg" /> Figura 3: Quantificazione di lipidi diffusione nel SLB. (A) un&#39;immagine Epi-fluorescenza di uno SLB prima sbianca. I punti di proteine ​​mostrano buchi scuri in un mare luminoso di lipidi. Il campo-diaframma limita l&#39;area illuminata. (B) Epi-fluorescenza SLB dopo sbiancamento continuamente per 50 s. L&#39;alone visibile all&#39;interno della regione delimitata dal campo diaframma indica che i lipidi sono mobili. barra della scala: 10 micron. (C) il profilo medio di intensità lungo il bordo del campo-membrana (in alto) e il decadimento di intensità nel tempo durante il processo di alaggio (in basso). Questi dati vengono analizzati per estrarre la costante di diffusione, che è tipicamente 5 μm² / s.

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione.

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K Views.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione. 

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ricerca

Bioingegneria

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.