Agradecemos a Laurent Limozin, Pierre Dillard y Astrid Wahl para continuar un debate fructífero sobre aplicaciones celulares. Agradecemos también a Frederic Bedu desde las instalaciones de sala limpia PLANETE por su ayuda con las observaciones de SEM. Este trabajo fue financiado en parte por el Consejo Europeo de Investigación a través de la subvención Nº 307104 FP / 2007-2013 / CEI.

1. limpieza de vidrio Cover-toboganes y cámaras de observación <ol><li> Organizar el vidrio de cubierta-se desliza sobre una bandeja de múltiples de cremallera realizado en un material inerte como politetrafluoroetileno (PTFE). </li><li> Sumergir la bandeja con toboganes y la cámara de observación en una solución de tensioactivo (cualquier producto recomendado para la limpieza de cubetas de cuarzo es adecuado). </li><li> El uso de un baño ultrasónico, ultra-sonicado en la solución de tensioactivo durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li><li> Enjuagar 5 veces con agua ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0,059 S / cm). </li><li> Ultra-sonicado en solución de tensioactivo durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li><li> Enjuague 10 veces con agua ultrapura. </li><li> Repetir los pasos 1.5 y 1.6 dos veces. </li><li> Tienda en agua a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C) durante hasta una semana. </li></ol> 2. La fabricación de proteínas Nano-puntos <ol><li> La deposición de perlas <ol><li> Deposit la suspensión de perlas de sílice (2% v / v, 70 l) gota a gota en una cubierta de corredera (24 x 24 mm, espesor de 170 micras) mantenidos a una inclinación de 15 grados. </li><li> Deje que la suspensión se extendió durante aproximadamente 1 min, mientras que dar la vuelta al vidrio de 90 ° cada 15 s. </li><li> Permitir que el líquido se evapore en condiciones ambientales. </li><li> Almacenar en un vidrio limpio o cámara de PTFE en condiciones ambientales durante hasta 2 días. </li></ol></li><li> La deposición de aluminio <ol><li> Colocar los portaobjetos (preparado en la sección 2.1) dentro de una frecuencia de radio magnetrón (RF) equipo de pulverización catódica 8, sobre una mesa que gira a una distancia de aproximadamente 105 mm a partir de una aleación de aluminio (99%): silicio (1%) de destino. </li><li> Bomba abajo de la cámara de deposición a 2,6 x 10 -4 Pa utilizando una bomba turbo-molecular. Este paso es importante para la eliminación de posibles impurezas gaseosas. </li><li> Introducir pura atmósfera de argón (5 N, 99,999%) con un flujo de 10 sccm a una presión de 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; NOTA: El flujo de argón entrante está controlado por un controlador de flujo másico y la presión del proceso se monitoriza utilizando un medidor de presión. El flujo de gas argón es continua y es controlado por un equilibrio entre la entrada y las válvulas de abertura de salida. </li><li> Encender el generador de potencia de RF. NOTA: En este caso, se utilizó un rango típico de 400-600 W de potencia de radiofrecuencia a 13,56 MHz de frecuencia. El generador de RF se utiliza con una red de adaptación en un modo de acoplamiento de plasma capacitivo. La potencia reflejada se supervisa y se reduce al mínimo el uso de la adaptación de la red. </li><li> Después se estabiliza el plasma, por pulverización catódica durante 2 minutos manteniendo el obturador cerrado para eliminar posibles impurezas de la superficie del objetivo. </li><li> Abra el obturador y permitir la pulverización catódica para continuar durante 60 min para depositar aluminio sobre el portaobjetos de vidrio hasta un espesor de 200 nm. </li><li> Cortar el flujo de argón, cerrar la válvula de compuerta para aislar la bomba turbomolecular de la cámara de deposición y ventilar la cámara con limpio nitrogen para obtener la presión ambiente. Recuperar los portaobjetos de aluminio recubiertos. Almacenar durante un máximo de un mes en una caja de vidrio o PTFE limpio y herméticamente cerrado en condiciones ambientales. </li></ol></li><li> deposición de vapor de organosilano <ol><li> Sumergir el portaobjetos recubierto de aluminio preparado en la etapa 2.2.6 en agua ultrapura a temperatura ambiente y ultra-sonicado durante 30 s en un baño ultrasónico (50 W, 50/60 Hz, entre 20 y 30 ° C). </li><li> Depósito de 0,5 ml de (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) en la parte inferior de un desecador. PRECAUCIÓN: APTES es un organosilano, que se evapora fácilmente y es tóxico. APTES deberán ser manejados solamente bajo una campana de flujo y con guantes. </li><li> Poner los portaobjetos de vidrio (preparado en 2.3.1) en una cuadrícula de cerámica y el lugar en el interior del desecador. </li><li> Conectar el desecador a una bomba de membrana y correr a la máxima potencia durante 30 min para generar un vacío bajo. </li><li> Cierre la válvula del desecador y apagar la bomba. </li><li> Calentar el desecadora aproximadamente 50 ° C durante 1 h. </li><li> Abrir el desecador y recoger las diapositivas. </li><li> Transferencia a otro desecador limpio para almacenamiento de hasta 48 h a temperatura ambiente (20 a 30 ° C). </li></ol></li><li> La deposición de la primera capa de proteína - albúmina de suero bovino marcado con biotina (BSA-biotina) <ol><li> Coloque una de las diapositivas preparadas en el apartado 2.3 sobre un soporte de PTFE. </li><li> Depósito de 1 ml de 25 mg / ml de BSA-biotina disuelto en tampón fosfato salino (PBS). Dejar durante 30 min a temperatura ambiente (20 a 30 ° C). </li><li> Enjuague 10 veces con PBS. Almacenar la muestra para un máximo de 24 horas a 4 ° C lejos de la fuente de luz. </li></ol></li><li> La eliminación de máscara de aluminio <ol><li> Incubar los portaobjetos en una solución de NaOH en PBS (preparado por adición gota a gota de NaOH 1 M a aproximadamente 100 ml de PBS para obtener pH≈12) durante la noche a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). PRECAUCIÓN. NaOH es corrosivo y debe ser manejado usando guantes. </li><li> Enjuague10 veces en agua ultrapura. </li></ol></li></ol> 3. Deposición de Apoyado bicapa lipídica (SLB) <ol><li> La limpieza de la artesa de Langmuir <ol><li> Eliminar el agua en el recinto de PTFE de la artesa de Langmuir usando una bomba. </li><li> Limpiar con una toalla desechable no tejido sin pelusa humedecido en cloroformo. PRECAUCIÓN. El cloroformo es tóxico y debe ser manipulada en un área bien ventilada, con una máscara (o bajo una campana de flujo) y con los guantes apropiados. </li><li> Limpio 4 veces con agua ultrapura tibia (40 a 50 ° C). </li><li> Limpias al menos 6 veces con agua ultrapura frío. </li></ol></li><li> La deposición de la primera capa de lípidos <ol><li> Colocar bandejas de PTFE en el recinto de PTFE de la artesa de Langmuir y luego llenarlo con agua ultrapura. </li><li> Utilice el software de control del aparato de Langmuir para ajustar la presión medida a 0 mN / m. </li><li> Usar una jeringa de vidrio impermeable a los gases / metal para depositar 30 l de una solución de lípidos 1 mg / mL (1, 2-dioleoil sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) en cloroformo) en la superficie del agua. El cloroformo se evapora y las moléculas lipídicas forman espontáneamente una monocapa. </li><li> Utilice el software de control para comprimir la monocapa lipídica mediante el cierre de la barrera de PTFE hasta la presión deseada (27 mN / m para DOPC) se alcanza. </li><li> Utilice el software de control para sumergir el portaobjetos de vidrio preparado en la sección 2.5.2 en el recinto PTFE mediante una abrazadera motorizado. </li><li> Mantenga la corredera, en la abrazadera, perpendicular a la interfaz aire-agua. Utilice el software de control para aumentar lentamente (15 mm / min) a través de la interfaz, mientras que el mantenimiento de una presión constante a 27 mN / m. </li><li> Colocar en un ambiente seco, ya sea para uso inmediato o para el almacenamiento de hasta 24 h a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li></ol></li><li> La deposición de la segunda capa lipídica <ol><li> Mantener la presión de la superficie en la cubeta de Langmuir en el valor deseado de 27 mN / m. Comprimir usando elsoftware de control del aparato de Langmuir y / o añadir una pequeña cantidad de lípido para alcanzar la presión deseada. </li><li> Colocar los portaobjetos de vidrio que llevan la monocapa lipídica, preparada en la sección 3.2.6, horizontalmente en la superficie del agua. Asegúrese de que cada corredera está flotando por encima de una bandeja de PTFE. </li><li> Empuje los portaobjetos de vidrio hacia abajo, una diapositiva a la vez, en su bandeja de PTFE correspondiente usando PTFE o de metal pinzas de tal manera que se sumergen en el agua. Evite inclinar las diapositivas mientras empuja. </li><li> Utilizar PTFE o de metal pinzas para transferir las bandejas que contienen PTFE las diapositivas en un cristalizador lleno de agua ultrapura asegurándose de que las diapositivas no se exponen al aire. </li><li> Utilice PTFE o de metal pinzas para transferir, durante el trabajo bajo el agua, un portaobjetos de vidrio recubiertos con bicapa en una cámara de observación. NOTA: La cámara de observación se coloca bajo el agua en el interior del cristalizador. La cámara de observación se hace y se compone de un anillo de PTFE con una una junta de goma de encargocarcasas de acero D, que se pueden montar bajo el agua para hacer una cámara estanca al agua, cuya superficie inferior está hecho de la placa de vidrio previamente revestida con la bicapa lipídica. </li><li> Cerrar la cámara sin dejar de trabajar bajo el agua y asegurar que aproximadamente 1 ml de agua queda atrapada dentro de la cámara. </li><li> Tomar la cámara ensamblada fuera del agua. Asegúrese de que está libre apretado de agua y las fugas. </li><li> Reemplazar las 1 ml de agua ultrapura presente en la cámara de observación con PBS mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces. Asegúrese de que la cámara nunca es desprovisto de líquido. </li></ol></li><li> SLB etapa de bloqueo <ol><li> Introducir 100 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en la cámara de observación que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.3.6 y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li><li> Enjuague la bicapa mediante la eliminación y la adición de 500 l de PBS 10 veces. La bicapa puede ser mantenido 24 horas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. La funcionalización con ligandos <ol><li> Añadir fluorescente o neutravidina no fluorescente (NAV, una versión desglicosilada de la avidina no cargado a pH 7) a 2 mg / ml en la cámara que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.4.2 durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° DO). </li><li> Enjuague mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces. </li><li> Añadir biotinilado anti-CD3 a 2 mg / ml a la cámara que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.4.2. Para doble funcionalización del SLB y los puntos, añadir Fc-ICAM-1 His-tag en 5 mg / ml (aquí, la bicapa está hecho de DOPC + 1% de lípidos de ácido nitrilotriacético (NTA)). Dejar durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li><li> Enjuague mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces </li><li> Sustituir el PBS con medio celular (PBS + BSA al 0,1%) mediante la adición y la eliminación de 500 l de medio celular 10 veces. </li><li> Deja 200 l de medio celular en el chambeR con la diapositiva. </li><li> Coloque la cámara durante 10 min a 37 ° C antes de añadir las células. </li></ol> 5. deposición de células (véase la referencia 7 para más detalles) <ol><li> depositar cuidadosamente 400! l de la suspensión celular en la cámara. Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Fijar la célula con 2% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a 37 ° C. Sustituir el PFA con PBS mediante la eliminación y la adición de 500 l de PBS repetido. </li></ol> 6. Observación <ol><li> Proteo-lipídica Nano-patrón y fluidez SLB <ol><li> Utilice un microscopio de fluorescencia a la imagen del patrón de proteínas en el modo de epi-fluorescencia utilizando longitud de onda apropiada de iluminación (639 nm) y cubos de filtro (por ejemplo, aquí, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688). NOTA: La intensidad de la señal se puede cuantificar para estimar la cantidad de proteína dentro y fuera del punto. Utilice una longitud de onda apropiada de iluminación (330 nm) y fcubo ILTER a la imagen de la bicapa (BP 365/12, FT 395, LP 397), que aparece brillante con agujeros oscuros. </li><li> Utilice fotoblanqueo continua (CPB) técnica 13, 15 para medir la constante de difusión de los lípidos de trazador en la bicapa. Esta observación se hace preferiblemente justo después de la deposición SLB. NOTA: Para cuantificar la constante de difusión, se miden dos parámetros durante el proceso de CPB: el tiempo de blanqueo específica del colorante (tensa) y la longitud de decaimiento del perfil fluorescente del halo formado alrededor del área blanqueada (TAUD). El primero se obtiene mediante el trazado de la evolución temporal de la intensidad de fluorescencia en el centro del campo iluminado durante el proceso de CPB. El segundo se obtiene representando el perfil de intensidad en el borde de la zona iluminada (promediado sobre 12 líneas y 5 imágenes después de que se alcanza el estado estacionario). Las curvas se ajustaron a obtener tensa y TAUD. La constante de difusión viene dada por tauD 2 / tensa (D = <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos en el protocolo descrito anteriormente se relacionan con la formación de la proteína nano-puntos o la parte posterior de llenado del espacio alrededor de los puntos por una bicapa de lípidos compatible. El primer paso crítico con respecto a la proteína de nano-puntos es la preparación de la perla-máscara. La limpieza de la cubierta de corredera es crítica. Los portaobjetos necesitan ser limpiados o bien con una solución de detergente que se recomienda para la limpieza de cubetas de cuarzo, o con plasma de oxígeno. Otras técnicas de limpieza como la inmersión en etanol o tratamiento iso-propanol no hagan al vidrio suficientemente hidrófilo y por lo tanto no apoyan la formación de una monocapa de perlas de gran cobertura. Al mismo tiempo, la superficie de la corredera tiene que ser compatible con la etapa posterior de formación de la SLB por Langmuir-Blodgett técnica 7, 15, 16. El siguiente paso crítico es la deposición y la eliminación de unaluminum. Si la deposición es a través de técnica de pulverización catódica, como se hace aquí, el objetivo debe ser dopado con silicio (al 1%). De lo contrario, si el objetivo está hecho de aluminio puro, la capa depositada es difícil de quitar con la solución de hidróxido alcalino como se describe anteriormente, probablemente debido a la formación de óxido de aluminio y la interpenetración entre la capa de aluminio depositado y el sustrato portaobjetos de vidrio. La duración de la deposición determina el tamaño de los puntos de proteínas 9, sin embargo, aquí se ha trabajado con un único tiempo de deposición y tamaño, por lo tanto solo punto. La muestra puede ser almacenado en condiciones ambientales durante varios meses después de la deposición de aluminio y por alrededor de una semana después de la deposición de BSA-biotina. El segundo paso crucial se refiere a la deposición del SLB. Limpieza de la cubierta de vidrio-deslizante es de nuevo un punto de crucial importancia. Como es el caso para cualquier trabajo de deposición de Langmuir-Blodgett, todo el material utilizado debe ser de vidrio o Polytetrafluoroethylene (PTFE) y debe ser escrupulosamente limpios. Después de la deposición de la primera monocapa lipídica, los ocultamientos diapositivas se pueden almacenar durante un par de días, pero después de la deposición de la segunda monocapa, que necesitan para ser utilizado inmediatamente. Si bien hemos demostrado el protocolo para la creación de anti-CD3 nano-puntos para el uso en estudios T de adhesión de linfocitos 9, 13, el procedimiento es muy flexible y se puede adaptar para cualquier proteína biotinilado. La composición de la bicapa lipídica se puede cambiar fácilmente y se puede funcionalizar adicionalmente si se desea. Un punto importante a considerar es la posible absorción no específica de proteínas, especialmente en la bicapa lipídica que rodea los puntos. La principal limitación de la técnica surge del uso de coloidal en perlas de auto-ensamblaje para la máscara primaria. Al ser una técnica de abajo hacia arriba, que comparte algunos de los problemas de todos estos enfoquespor ejemplo, la falta de flexibilidad y control total sobre la forma de patrón. La celosía patrón refleja necesariamente la simetría de la máscara de talón y es por lo tanto siempre hexagonal. La forma del motivo patrón es un círculo y se determina por una combinación de grano de tamaño y la duración de deposición de aluminio 9, 13. Las técnicas alternativas para controlar el tamaño de los puntos también se han sugerido 14, 17, 18. Sustratos nano-patrones con proteínas, proteína-fragmentos o péptidos se han utilizado ampliamente en el pasado para sondear las interacciones de la superficie celular, especialmente la adhesión 19 y la migración 20. El trabajo pionero ha demostrado que las células formadoras de tejido-no pueden propagarse en los patrones con un paso mayor que un umbral dado 21, y aún más sho investigación<html> casó que la longitud escala de este fenómeno es fijado por el tamaño de Talins, que son instrumentales en la vinculación de receptores de la integrina para el citoesqueleto de actina 22. Sin embargo, en todos estos estudios, las proteínas se unieron a nano-partículas de oro, que a su vez se inmovilizaron sobre el vidrio. En el contexto de las células T, las membranas proteo-lipídica, típicamente imitan células presentadoras de antígeno, se han utilizado ampliamente para entender aspectos fundamentales de la función de las células T 6. Técnicas de nano-patronamiento ingeniosos se han utilizado para crear corrales con barreras de metal de proteína separar parches SLB funcionalizados, que han proporcionado información sobre la estructura y la conectividad de la célula T / APC interfaz 23. Sin embargo este tipo de nano-patrón es muy diferente de la proteína nano-puntos que aquí se proponen. Recientemente, nano cúmulos fueron creados usando unión química de los lípidos de proteínas funcionalizadoss = &quot;xref&quot;&gt; 3, que a arrojar luz sobre la consecuencia de la agrupación de receptores. La ventaja es que, a diferencia del presente caso, los grupos podrían, en principio, ser ellos mismos móvil. Sin embargo, tales grupos formados espontáneamente son necesariamente menos bien controlados en términos de tamaño y densidad que el pre-formadas de proteínas nano-puntos descritos aquí. Prevemos que la proteína SLB decoradas nano-dot presentan aquí se puede utilizar para investigar diferentes aspectos de la adhesión célula-célula. Una pregunta obvia que surge es si, como se describe anteriormente para las células que forman tejido 19, los linfocitos también tiene una longitud de escala intrínseca asociada con la adhesión. Los resultados preliminares parecen indicar que, al menos, cuando la adhesión está mediada por el complejo TCR, la densidad de ligandos en lugar de separación es el parámetro que define para la difusión y la activación 10, 11, 12 <sup&gt; 13. Si la inclusión de ligandos móviles en los impactos SLB que rodean esta observación y cómo las fracciones móviles e inmóviles trabajan juntos es una pregunta posible, dirigida en parte usando SLB grupos unidos autoensambladas 24. Otra aplicación interesante será en el contexto de mecano-detección, donde la adhesión celular / activación en ligandos móviles y inmovilizados mostraron ser diferentes no sólo para las células T 7, 25, sino también para las células que habitualmente se adhieren a la matriz extracelular 26. Las dos principales ventajas de estos patrones proteo-lipídico son la compatibilidad de los sustratos con microscopía óptica avanzada y la facilidad de preparación que los hace compatibles con las aplicaciones de uso y tirar. Después de deposición de aluminio, todas las etapas de preparación se pueden llevar a cabo en un banco de laboratorio húmedo estándar. En el futuro, se puede prever que el aluminio-recubiertas y apoyado por el grano de cristal-máscaras producidos en una instalación especializada son transferidos y almacenados en laboratorios de biología para su uso como cuando sea necesario. Teniendo esto en cuenta, creemos que estos sustratos tienen el potencial de convertirse en la plataforma de elección para el estudio de la interacción de las células con membranas proteo-lipídica nano-modelado controladas.

<html> La adhesión celular se lleva a cabo a través de moléculas especializadas de adhesión celular (CAMs), las proteínas presentes en la membrana celular que son capaces de unirse a su contraparte en la matriz extracelular o en otra célula. En células adheridas, la mayoría de las moléculas de adhesión, incluyendo la integrina ubicua y cadherina, se encuentran en la forma de los grupos 1. La interacción de los linfocitos T (células T) con células presentadoras de antígeno (APCs) proporciona una ilustración particularmente notable de la importancia de grupos de receptores formados en la interfaz entre las dos células - menudo se llama una sinapsis inmunológica. Tras la formación de la primera contacto con los receptores de las células APC, T (TCR) en la superficie del encofrado de celdillas micras racimos escala T que sirven como señalización de las plataformas 2, 3, 4, y son finalmente centralizado para formar un clúster supramolecular central más grande (cSMAC )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Recientemente, se demostró que en el lado de APC, los ligandos de la TCR también se agrupan 8. En el contexto de la interacción de células T-APC, el despliegue de sistemas híbridos, en el que el APC es imitado por una superficie artificial funcionalizado con proteínas relevantes, se ha avanzado en gran medida nuestra comprensión de la interfaz sináptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . En este contexto, es muy relevante para diseñar APC superficies miméticas que capturan uno o más aspectos de la célula diana. Por ejemplo, si los ligandos se injertan en bicapas lipídicas compatibles, que pueden difundirse en el plano de la bicapa, imitar la situación en la superficie de APC y al mismo tiempo permitir la formación de lacSMAC 6, 7. Del mismo modo, los racimos en la APC se han imitado mediante la creación de islas de ligandos en un mar de polímeros 9, 10, 11, 12, 13, 14. Sin embargo, estas dos características hasta ahora no han sido combinados. Aquí se describe una nueva técnica para crear nano-puntos de anti-CD3 (un anticuerpo que se dirige el complejo TCR), rodeada por una bicapa lipídica con lípidos que se difunden. La bicapa se deposita usando Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer técnica 7, 15, 16 y si se desea, podría ser funcionalizada con una proteína específica - por ejemplo, el ligando de la integrina de células T (llamado ICAM1). Además, el anti-CD3 puntos de proteínas COUld ser reemplazado con otro anticuerpo o CAM. Si bien hemos elegido las proteínas para uso futuro como plataforma para los estudios de adhesión de células T, la estrategia se detalla aquí se puede adaptar para cualquier proteína e incluso ADN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Assistent, Karl Hecht KG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observation chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td>
			<td>Hella Analytics</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Labbox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizer&#160;</td>
			<td>Shott</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidine</td>
			<td>Thermo Fischer Scientifique</td>
			<td>84607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water MQ&#160;</td>
			<td>ELGA, Veolia France</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Corpuscular Inc</td>
			<td>147114-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A3648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A8549</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dansyl-PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810330C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>650471</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe&#160;</td>
			<td>Dominique Dustcher , France</td>
			<td>74453</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film balance</td>
			<td>NIMA</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>TIRF-III system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Target&#160;</td>
			<td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&#232;me&#160;</td>
			<td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Actualmente existe un gran interés en la creación de matrices ordenadas de islas de proteínas adhesivas en un mar de superficie neutralizada para estudios biológicos celulares. En los últimos años, se ha vuelto cada vez más claro que las células vivas responden, no sólo a la naturaleza bioquímica de las moléculas que se les presentan, sino también a la forma en que se presentan estas moléculas. La creación de proteínas micro-patrones tanto, es ahora estándar en muchos laboratorios de biología; nano-patrones son también más accesible. Sin embargo, en el contexto de interacciones célula-célula, hay una necesidad de patrón no sólo proteínas sino también bicapas lipídicas. Tal patrón de doble proteo-lipídica hasta ahora no ha sido fácil acceso. Ofrecemos una técnica fácil para crear proteínas nano-puntos apoyados sobre vidrio y proponer un método para rellenar el espacio entre puntos con una bicapa lipídica compatible (SLB). Desde foto-blanqueo de trazador lípidos fluorescentes incluyen en la SLB, se demuestra que la bicapa exhibe considerable en-plane fluidez. Funcionalización de los puntos de proteínas con grupos fluorescentes nos permite la imagen de ellos y demostrar que están ordenados en una red hexagonal regular. El tamaño típico de punto es de aproximadamente 800 nm y la separación demostrado aquí es de 2 micras. Se espera que estos sustratos para servir como plataformas útiles para la adhesión celular, la migración y estudios mecano-de detección.

Las imágenes de fluorescencia se analizaron para medir el espaciamiento y tamaño de los puntos. Se encontró espaciamiento Típica ser 1900 ± 80 nm y dot-tamaño típico fue de 600 ± 100 nm (Figura 1g). La separación es fijado por el tamaño de las perlas usadas para la máscara. El tamaño de punto se establece por el cordón de tamaño, así como condiciones de deposición. El SLB se deposita únicamente alrededor de los puntos de proteínas y no en ellos (Figura 2), con complementariedad perfecta entre los agujeros visto en el canal de formación de imágenes SLB y los puntos observados en el canal de formación de imágenes NAV. Análisis de los datos fotoblanqueo continua muestra que los lípidos de la bicapa modelada permanecer fluido y tienen una constante de difusión típico de 5 μm² / s (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig1.jpg" /> Figura 1: Representación esquemática de las etapas de fabricación. (una </strong&gt;) máscara de microesferas primario. El recuadro muestra una imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la máscara, hecha con gotas de 2 m de diámetro y cubierto con una fina capa de aluminio. Parámetros utilizados en esta imagen son: espesor de aluminio nominal 200 nm depuesto en 400 W RF, la presión inicial de 9 x 10 -7 Torr, Argon fundente de 10 sccm, presión de proceso 6,2 mTorr, proyectado en voltaje de aceleración de 5 kV. Las imágenes confirman la observación hecha con microscopía óptica (imagen no incluido) antes de la deposición de aluminio que las perlas están dispuestas en una monocapa centrado red hexagonal en el cristal-diapositiva. (B) la máscara secundaria de aluminio creado por la deposición por pulverización catódica después de la eliminación de la principal bead-máscara. (C) Deposición de organosilano y BSA-biotina aunque la máscara secundaria. (D) La eliminación de aluminio revelando nano-puntos de BSA-biotina. (E) La deposición de SLB. (F) Unión de navegación para BSA-biotina. (G) Encuadernación<html> anti-CD3 a NaV. imagen epi-fluorescencia de las matrices de nano-puntos recuadro muestra. Aquí, el NAV es marcado con fluorescencia. dot-El tamaño típico es de 600 ± 100 nm y el espaciamiento típico es 1900 ± 80 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55060/55060fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig2.jpg" /> Figura 2: complementariedad de los nano-punto y el patrón SLB. (A, b) Imágenes de Epi-fluorescencia de fluorescentes NaV nano-puntos y de SLB con lípidos trazador fluorescente. (C) Imagen compuesta de los puntos NaV (rojo) en el mar de SLB (verde) muestra perfecta complementariedad de la NAV y SLB. imagen transformada rápida de Fourier (FFT) en el recuadro indica orden de largo alcance. Barra de escala: 4 m.rge.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig3.jpg" /> Figura 3: Cuantificación de difusión de lípidos en el SLB. (A) Imagen de Epi-fluorescencia de un SLB antes del blanqueo. Los puntos de proteínas aparecen como agujeros oscuros en un mar brillante de los lípidos. El campo de membrana limita el área iluminada. (B) Epi-fluorescencia de SLB después de la decoloración de forma continua durante 50 s. El halo visible dentro de la región delimitada por el campo-diafragma indica que los lípidos son móviles. barra de escala: 10 m. (C) el perfil promedio de intensidad a lo largo del borde del campo de membrana (arriba) y la decadencia de la intensidad con el tiempo durante el proceso de varada (abajo). Estos datos se analizan para extraer la constante de difusión, que es típicamente 5 μm² / s.

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K vistas.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración. 

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Investigación

Bioingeniería

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.