This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

1. Kultivieren von Zellen auf Micropost Arrays Hinweis: Alle Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, um die Sterilität zu gewährleisten. Die hier angegebenen Volumina sind für T25 Zellkulturflaschen. Das Zellkulturmedium Rezept und Zellaussaatdichte für Knochenkrebszelllinien HuO9 und M132 optimiert. <ol><li> Bereiten Sie eine Zellkultur für die Aussaat auf eine micropost Array. <ol><li> Untersuchen Sie den Zellkulturqualität, indem die Kulturflasche auf einem Standard-Lichtmikroskop. Sicherzustellen, dass die Zellen eine typische Wachstum und Morphologie durch Schätzen, wie viel von der Kulturflasche Boden bedeckt. Eine Abdeckung von 70% -80% entspricht einer gesunden Wachstumsrate. Achten Sie auf die Höhe der schwimmenden Zellen, wie sie abgestorbene Zellen und / oder einen überwucherten Kultur zu repräsentieren. </li><li> Trypsinize Zellen durch Entfernen Medium und Waschen mit 4 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -Puffer. Hinzuzufügen 0,8 ml 1x Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Inkubation bei RT, bis die Zells dislodge, die etwa 2-4 min dauert. Überprüfen Sie den Prozess mit dem Mikroskop und gelegentlich die Flasche klopfen sanft um das Verdrängen zu unterstützen. </li><li> 5 ml Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptavidin (Pen / Strep)), um die Reaktion zu stoppen und zu waschen Restzellen, die still sitzen auf der Unterseite des Kolbens ist. Anschließend pipettiert diese Suspension nach oben und unten mehrere Male, um eine homogene Mischung zu erhalten. Sicherstellen, dass alle Lösungen in der ursprünglichen Wachstumsbereich der Flasche pipettieren, um eine effektive Verdrängen zu gewinnen. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in in ein 15 ml Röhrchen und zentrifugieren Sie es mit einem Tischzentrifuge bei 0,5 × g für 3 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellet in 5 ml Medium durch Auf- und Abpipettieren 5 mal. Achten Sie darauf, um die Erzeugung von Luftblasen zu vermeiden, während dies zu tun. </li><li> Bestimmen Sie die Zelldichte mit Hilfe eines Zellzählung Kammer und eine Licht microscope. Überprüfen Sie die Zellsuspension in Zellzählung Kammer für Zellaggregate und sorgen nur Einzelzellen für die nachfolgende Experiment haben. Pipette wieder nach oben und unten mehrere Male, wenn die Zellen dazu neigen, Aggregate, sie zu trennen bilden. </li><li> Verdünnen der Zellsuspension mit ausreichender Medium, um ein Zelllösung von 25.000 Zellen / ml zu erhalten. Gut mischen durch Invertieren des geschlossenen Rohr mehrmals. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine micropost Array für Zellaussaat. Kritische Anmerkung: auf die micropost Array Sie pipettieren nicht direkt, da dies möglicherweise die microposts schaden, vor allem, wenn unerwünschte Luftblasen eingebracht werden. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass die micropost Array trocknet nie aus, wie auftretende Kapillarkräfte zu Kollabieren der microposts führen. <ol><li> Legen Sie das Glassubstrat mit dem micropost Array Seite nach oben in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte mit Hilfe einer Pinzette und nass ist es durch Zugabe von 1 ml Ethanol (99%). Inkubieren bei Raumtemperatur für 20-30 sec. </li><li> Verdünnen Sie das Ethanolstufenweise durch Zugabe von ungefähr 1 ml sterilem entionisiertem Wasser (DI-Wasser) an der Bettseite und Absaugen ungefähr 1 ml unter Verwendung einer Transferpipette oder Absaugvorrichtung. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens 3 mal. </li><li> Ersetzen den DI-Wasser mit PBS-Puffer auf die gleiche Weise durch Zugabe und Absaugen von ungefähr 1 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. </li><li> Ersetzen Sie den PBS-Puffer mit mittlerer durch Zugabe und Absaugen etwa 1 ml Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. </li></ol></li><li> Pipette 1 ml Zelllösung (25.000 Zellen) auf der jeweils vorbereitet micropost Array. Schließen Multiwellplatte und überträgt es auf einen Inkubator (CO 2 5%, 37 ° C). Lassen Sie die Zellen anhaften und wachsen auf der Oberseite des microposts für 6 -7 Std. </li><li> Untersuchen Sie den Klebeprozess gelegentlich unter Verwendung eines Licht ein Mikroskop. Überprüfen Sie, dass die meisten der Zellen erscheinen ausge über mehrere microposts verbreiten. </li></ol> 2. Fixing &amp; Färben von Zellen Hinweis: Alle Schritte undVolumina hier angegebenen sind für eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte. Es empfiehlt sich, zu einem Zeitpunkt, um ein Austrocknen der Vertiefungen nach dem Ansaugen einer Flüssigkeit, die in einem Kollabieren der microposts führt vermeiden verarbeiten nicht mehr als vier der zwölf Vertiefungen. <ol><li> Aspirat Medium aus dem Bohrloch und waschen Zellen 2x mit 1 ml PBS-Puffer. Achten Sie darauf, um eine sanfte Kraft aufzubringen, während dem Waschen mit PBS, um Zelltrümmer, die auf dem micropost Array während der Inkubation angesammelt entfernen und toten Zellen zu lösen. </li><li> Befestigen Sie die Zellen mit 0,5 ml 3,7% gepufferte Formaldehydlösung für 5 min. </li><li> Ersetzen Sie die Formaldehyd-Lösung durch Waschen der micropost Array 2x mit 1 ml sterilem DI-Wasser. </li><li> Färben die Zellen mit Farbstoff (0,05% Coomassie Brilliant Blue in 50% Wasser, 40% Ethanol und 10% Essigsäure) für ca. 90 sec. Waschen Sie überschüssige Färbelösung off 2x mit 1 ml sterilem DI-Wasser. 1 ml VE-Wasser auf Array micropost. </li><li> Überprüfen Färbungsergebnis mit einem Lichtmikroskop. Wiederholen tHE-Färbung Schritt, wenn Zellkörper ist zu schwach, um sichtbar gemacht werden. </li><li> Shop micropost Arrays mit den gefärbten Zellen auf der Oberseite in einem Kühlschrank bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, sie unter Wasser zu allen Zeiten zu halten. </li></ol> 3. Cell Imaging Hinweis: Schritt 4 gilt nur für Mikroskope, ohne unendlich korrigierte Optik. <ol><li> 2 ml VE-Wasser in eine Petrischale mit einer dünnen Glasboden für hochauflösende Bildgebung. </li><li> Bringen micropost Array mit einer Pinzette in den bildgebenden Schale mit dem microposts nach oben zeigt. </li><li> Legen Sie die Imaging-Petrischale auf einem beweglichen Tisch eines Lichtmikroskops. </li><li> Drehen des Kompensationsrings des Objektivs zur Bilderzeugung verwendet, bis die Anzahl auf der Skala stellt die Gesamtdicke aller Materialien entlang des optischen Pfades für die Fehlanpassung der Brechungsindizes des Glassubstrats, das Siliconelastomer und der Flüssigkeit auf der Oberseite zu kompensieren. Dies sollte zu einem hellen Erscheinungsbild der microposts führenKerne. </li><li> Schließen Sie die Blende auf der Beleuchtungsseite nach unten auf 50% und keine Phasenkontrastringe zu entfernen aus dem Strahlengang ermöglicht eine gewöhnliche Hellfeld-Modus. </li><li> Richten Sie die micropost Array, das die microposts bilden eine horizontale Linie über das Beobachtungsfeld. Definieren Sie einen Startpunkt (zB links oben) und bewegen Sie die Petrischale schrittweise über die Bühne Scannen des micropost Array während der Einnahme von zahlreichen Bildern. </li><li> Nehmen Sie alle Bilder mit der höchsten Auflösungseinstellung für die Kamera mit einem 20X oder 40X-Objektiv. Ziel ist es, eine einzelne Zelle in der Mitte des Bildes haben. </li><li> Kehren entlang der z-Achse durch das Substrat, bis die micropost Spitzen scharf sind. Verwenden Sie die Feinabstimmung Fokusrad des Mikroskops und drehen Sie ihn in Richtung Konzentration auf die micropost unten für ca. 2-3 &amp; mgr; m. </li><li> Stellen Sie die Standard-Bildgebungsverfahren, indem sie Testbildreihe aus einem Feldabschnitt fegt durch die Bildaufnahmeparameter ein zu einer Zeit (zB Belichtungszeit,Blendeneinstellung, Lampeneinstellungen usw.). Analysieren Sie Bilder mit MechProfiler und bestimmen einen geeigneten Parametersatz für eine schnelle und zuverlässige Analyse. </li></ol> 4. Bildanalyse mit Open Source Software &quot;MechProfiler&quot; Hinweis: Alle Software-Funktionen können Sie mit einem Zeigegerät mit der linken Maustaste aktiviert werden. Allerdings wird ein ausgebildeter Bediener die dokumentierten Tastenkombinationen entwickelt, um auf der linken Hälfte der Tastatur, um eine effiziente zweihändige Bildverarbeitung zu ermöglichen verwenden. <ol><li> Starten Sie Bildanalyse-Software MechProfiler und öffnen Sie eine Reihe von Bildern, die durch Klicken auf &quot;Öffnen&quot;, analysiert werden müssen. </li><li> Setzen Sie alle Parameter in den &quot;Settings&quot; Abschnitt von dem Software-Entwickler gegeben. Bestimmen Sie die Parameter, die benutzerdefinierte konfiguriert werden müssen (dh Kontur Schwelle und Minimalabstand) nach den im Einzelnen von der Software Handbuch beschriebenen Pflegehinweise. </li><li> Bild zu analysierens one-by-one durch Zuschneiden sie an den Bereich von Interesse unter Verwendung &quot;Crop&quot; (klicken und ziehen Sie mit gedrückter Maustaste nach unten). Klicken Sie doppelt in der gezeichneten Rechtecks, um diese Aktion zu beenden. </li><li> Markieren jedes sichtbare Zellkontur one-by-one, indem Sie auf &quot;Draw Zell Konturen&quot; und verwenden Sie das Fadenkreuz zum Zeichnen einschließlich aller microposts die Zelle zugeordnet ist. </li><li> Entsorgen Sie alle unerwünschten microposts indem Sie auf &quot;Verwerfen Beiträge&quot; und verwenden Sie das Fadenkreuz zum Zeichnen. Schließen Sie alle microposts, die in eine Zelle außerhalb des Bildausschnitts gehören, oder dass sich aus einem anderen Grund, aber nicht von der Zelle von Interesse abgelenkt wird. </li><li> Starten Sie die Software-Unterprogramm &quot;finden Zentroide&quot; per Mausklick. Stellen Sie die Filtereinstellung direkt neben dem &quot;Suchen Zentroide&quot; drücken, bis alle microposts registriert sind, die mit einem roten Kreuz in der Mitte zu sehen ist. Wenn die Filtereinstellung zu niedrig ist microposts werden ignoriert, wenn sie zu hoch multiple Positionen werden für eine einzelne micropost markiert werden. Halten Sie die Filtereinstellung während einer Analysesitzung konstant. </li><li> Verwenden Sie die manuelle Bearbeitungsfunktion &quot;Manual Edit&quot; für die Flächenschwerpunkte mit mehreren oder verpasste micropost Positionen. Benutzen Sie die Maus, um das Fadenkreuz micropost in Frage durch Klicken und Ziehen sie über auswählen. Doppelklicken Sie innerhalb des Rechtecks ​​und legen Sie die fehlenden roten Marker in der vergrößerten Bildausschnitt, der automatisch schließt. Entsorgen eines solchen micropost wenn sie außerhalb der Zelle gezogen Kontur ist (siehe Schritt 4.5), bevor Sie fortfahren. </li><li> Finden Sie die ideale micropost Gitter durch die Aktivierung der Funktion &quot;Grid&quot; mit einem Mausklick. Achten Sie darauf, die Position entspricht der wahren micropost Kopf, durch einen blauen Ring dargestellt ist, im Inneren der Zelle gezogen Umriss. </li><li> Korrigieren Sie alle fehl am Platz Gittermacher innerhalb der Zelle Bereich, in dem über die entsprechende Funktion &quot;Manuel Edit&quot; mit einem Mausklick erforderlich. Verwenden Sie das Fadenkreuz, um die micropost in qu wählenestion durch Klicken und Ziehen sie über. Doppelklicken Sie in der erscheinenden Rechtecks ​​und legen Sie die fehlenden blauen Marker in der vergrößerten Bildausschnitt, der automatisch schließt. </li><li> Über die Schaltfläche &quot;berechnen Biegungen&quot; per Mausklick, um ein Histogramm der berechneten Ablenkungswerte auf der Basis der Differenz zwischen der Position eines micropost innerhalb des Bildausschnitts und der erzeugten idealen Raster zu erhalten. </li><li> Speichern Sie die vollständige Analyse einschließlich der Wertetabellen durch einen Mausklick auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Fahren Sie mit der Bildanalyse, entweder, indem Sie auf &quot;Ansicht zurücksetzen&quot; und zu analysieren, einen anderen Bildausschnitt oder Mausklick auf &quot;nächstes Bild&quot;, das bequem mit der rechten Tastatur Cursor-Taste durchgeführt werden. </li></ol> 5. Datenanalyse - Mechanoprofiling <ol><li> Öffnen Sie die Datei &quot;results.xls&quot; mit einem Büro Tabellenkalkulationsprogramm aus dem Ordner mit den analysierten Bilder. Sie enthält die Daten all berechneten Werte einschließlich aller micropost Biegungen und Standard-Derivat Maßnahmen wie Arbeit (dh Substratverformungsenergie) von der Zelle analysiert. </li></ol>

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The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

Diese Arbeit zielt darauf ab, den Bereich der Traktionskraftmikroskopie durch im wesentlichen Senkung technischen und praktischen Markteintrittsschranken voraus. Diese Barrieren kommen von zwei Seiten. In erster Linie sind die zahlreichen nicht-triviale technische Herausforderungen, die überwunden werden müssen reproduzierbar herzustellen und experimentell zu beauftragen eine micropost Array werden. Zweitens ist die in ähnlicher Weise nicht-triviale Bedarf an einer zuverlässigen halbautomatische Analyse von Einzelzellen-Kräfte - unter Berücksichtigung, dass ein typisches Experiment kann die Analyse von Hunderten oder sogar Tausenden von Zellen erforderlich. Die oben beschriebenen Techniken wurden entwickelt, basierend micropost Traktionskraftmikroskopie zugänglich innerhalb der Zellbiologie Labors, die keinen Wohnsitz Engineering-Kompetenz zu machen. Die in diesem Artikel vorgestellten Sensoren und Analysetechniken ermöglichen sollten Nicht-Experten, um leicht und genau zu analysieren, die von Einzelzellen ausgeübten Kräfte. Abgesehen von Zugang zu einem Zellbiologie lab mit mindestens einer Mitte-Grade-Hellfeld-Mikroskop, die beschriebenen Verfahren erfordern einige zusätzliche technische Elemente. Hier die meisten Benutzer gültig Traktionskraftmikroskopie-Experimente mit noch wenig Erfahrung durchführen können, trotz der Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der Technik. Dennoch gibt es drei kritische Aspekte im dargestellten Protokoll, berücksichtigt werden müssen. Zunächst ist es notwendig, sicherzustellen, dass die micropost Arrays immer mit Flüssigkeit bedeckt, um, daß ihr Zusammenbruch aufgrund von Kapillarkräften zu vermeiden. Zweitens muss man Abbildungsparameter für erworbene micropost Bilder, die am besten, indem Reihe von Bildern des gleichen Feldposition, während unterschiedlicher Belichtungszeit, Blende Blende und Kompensationsring Stellung gemacht wird zu optimieren. Es ist wichtig, die richtige Brennebene für die micropost Spitze zu finden, und dieser Aspekt dauert einige Erfahrung angesichts der geringen räumliche Tiefe der Sensoranordnungen. Drittens muss man die offen zugänglich Bildanalyse-Software MechProfiler discusse downloadenhier D, für die ein detailliertes Handbuch und Trainingsbeispiele sind auf der Downloadsite. Nach einiger Erfahrung mit der Software von Beispielen mit dem Handbuch zu analysieren, sollte der Benutzer machen Sie Testbilder auf dem Imaging-Setup verwendet werden soll, um so geeignete Mikroskopeinstellungen konfigurieren. Basierend auf den erhaltenen Bildern sollte die Kontur Schwellenwert ähnlich optimiert werden. Ein einzelnes Bild micropost können von einem geschulten Benutzer innerhalb einer Minute mit dem Open-Source-MechProfiler Software unabhängig davon, ob es eine oder mehrere Zellen enthält, analysiert werden, so dass die Erzeugung von statistisch relevante Ergebnisse (Analyse von mehreren hundert Zellen) innerhalb weniger Stunden . Ein weiterer Aspekt, eine Abstimmungs erfordert die Optimierung eines angelegten Zell Färbeverfahren. Wenn Zellen übermäßig gefärbt, kann die Software nicht den richtigen Positionen micropost registrieren. Auf der anderen Seite, wenn die Färbung zu schwach ist, ist es mehr Aufwand durch den Benutzer zu erfassen, einen erfordert&quot;True&quot; Zellkontur als dünne Zell Vorsprünge können verpasst werden. , Durch Anlegen einer festen Protokoll der Zellfärbung und Array-Bildgebungsverfahren der Bereich für diesen Fehler wird jedoch annehmbar niedrige. Während dieser Arbeit wurden verschiedene Zell Färbeverfahren getestet, basierend auf verschiedenen Konzentrationen an Kristallviolett, die Anwesenheit von Tensiden wie Tween 20 oder Triton-X, oder eine Kombination von Farbstoffen, die durch Zugabe von Eosin. Dennoch ist die Intensität der Färbung sowie dessen Stabilität wesentlich von Experiment variiert, zu experimentieren. Nur der Einsatz von Brilliant Blue G wie oben beschrieben, zeigten eine akzeptable Zellfärbung Robustheit kombiniert mit genügend Intensität, um immer noch die dünnen Zell Umriss, aber ohne mit dem entwickelten Kontur anfahren. In der Regel gibt es Optionen, um die vorgestellte Technik ändern. Zum Beispiel durch die Kombination der Hellfeld-Techniken hier mit Fluoreszenz-Mikroskopie Färbung Organellen vorgestelltwie der Kern oder die Aktin-Filament-Netzwerk, das zusätzliche Informationen über die zugrunde liegenden Zellprozesse im Zusammenhang mit der Zellmechanik bieten kann. Außerdem wurde unter Verwendung langkettige Dialkyl carboxycyanines (DiI und DiO) die microposts fluoreszierend. 14. Allerdings ist es wichtig, jede Abweichung von der vorgestellte Technik steuern. Die ergänzenden den 10 und 11 veranschaulichen mögliche Fallstricke. Bilder einer Coomassie-Blau-G gefärbt NIH 3T3-Fibroblasten-Zell im grünen Fluoreszenzkanal (10B und 10C) mit dem inversen Mikroskop genommen eine Erläuterung der wichtigsten micropost Körper aber nicht ihre Tipps, was zu einer fehlerhaften Positionsanalyse (10E). Trotz der besten Bemühung, nach dem Umschalten von Hellfeld (10A), die micropost Spitzen nicht abgebildet werden, die aufgrund der Absorption des Fluoreszenzsignals von der Zelle Fleck sein könnte auszurichten. Dies steht im Gegensatz zu images mit der gelben Fluoreszenzkanal eines aufrechten Mikroskops (11B-11F) aufgenommen, bei denen mehrere scharfe Bilder zu erhalten, kann entlang der z-Achse. Hier muss der Benutzer sicherstellen, daß das Bild mit der Bildebene an der Spitze (11C) irgendwo näher am micropost Sumpf entnommen und nicht zu vermeiden, fordern fehlerhafte Ablenkungswerte. Es sei darauf hingewiesen, dass es auch technische Beschränkungen für micropost Assays werden. Zum Beispiel ist die Genauigkeit eines detektierten Auslenkung abhängig von der Qualität der optischen Einrichtung. Mikroskope sind oft für Fluoreszenz-Bildgebung, wobei die Lichtempfindlichkeit der angeschlossenen Kamera hat eine höhere Priorität als eine große Anzahl von Pixeln. Natürlich führt dies zu Bildern mit einer größeren Pixelgröße. Weiterhin sollte beachtet werden, dass Hellfeld-Bilder können nicht erkennen, ob Zellprotrusionen die Substratunterseite erreicht werden. Allerdings waren die kommerziellen micropost Arrays mit Hilfe der konfokalen getestetMikroskopie. Es wurde festgestellt, dass Zellen scheinen die binären Beschichtung, die nur auf die Adhäsion fördert micropost Spitzen und nicht für den Rest der micropost Anordnung annehmen. Ein weiterer Faktor ergibt sich aus der Positionsfehler der micropost Array, das gezeigt wurde, dass 0,2 &amp; mgr; m sein. Gemeinsam mit dem vorgegebenen Federkonstante von 2,8 nN / &amp; mgr; m führt dies zu einem Fehler im Kraft Auslesen von 0,6 nN. Ein weiteres Hindernis für micropost Assays beruht auf der Tatsache, daß die aufgebrachten Kräfte von microposts durch mehrere Zellen geteilt nicht bestimmt werden kann. Daher können nur isolierte Einzelzellen untersucht werden. Eine spezifische Beschränkung für die vorgestellt Protokoll ergibt sich aus der korrekten Anwendung der sensible Kontur Ansatz, der ein gewisses Maß an Ausbildung für den Benutzer, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten erfordert. Ferner für eine schnellere Analyse der Benutzer Bilder aufzunehmen, wobei das micropost Array ausgerichtet ist eine horizontale oder eine vertikale Linie entlang der Kante des Beobachtungsfeldes zu bilden. Despite die Tatsache, dass die Software-Algorithmus zur Bestimmung microposts innerhalb einer hexagonalen Gittergeometrie wird nicht um einen Drehwinkel begrenzt die Abbildung microposts mehr als 5 ° außeraxial machen es schwierig, zu einem Bildabschnitt zu beschneiden, ohne mit inkompletten microposts, was dann zu einem Versagen der Funktion &quot;Grid&quot;. In einem solchen Fall kann der Benutzer die integrierte Drehfunktion vor dem Start des micropost Positionen analysieren zu verwenden. Das beschriebene Verfahren wurde hauptsächlich angewendet, um zwei Knochenkrebszelllinien, eine elterliche Zelllinie mit dem Namen HuO9, und eine abgeleitete hochmetastatisch Linie laut M132 charakterisieren. In diesem Zusammenhang wurden mehr als sechshundert Einzelzellen-Bilder in Hellfeld-Modus aufgenommen und mit Hilfe der MechProfiler Software analysiert. Die anschließende Data Mining ergab, dass der Elternzelllinie HuO9 übt etwas mehr Kraft, und in der Regel deckt mehr microposts pro Zelle als Zellen aus dem metastatischen Zelllinie M132. Jedoch sind die Zellenwurden in verschiedenen Stadien des Zellzyklus zum Zeitpunkt der Fixierung, die geeignet sind, den breiten Bereich der Ergebnisse trugen synchronisiert und daher. Indem sie Live Cell Bilder über Zeiträume von bis zu 24 Stunden wurde festgestellt, dass nach dem Verteilen viele Zellen bleiben auf ihre Ausgangsposition, während andere zu migrieren, Verbreitung, trennen und wandern wieder mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten (siehe Zusatz Videos). Dies zeigt an, dass das mechanische Profil einer Zelle oft nicht konstant und kann stark in einer Zellpopulation oder sogar innerhalb einer einzigen Zelle in Abhängigkeit von der aktuellen Aktivität variieren. Ein weiterer Faktor könnte sein, dass auf einem micropost Array eine Zelle gezwungen, diskrete Migrationsschritte, um einen anderen micropost, die im Gegensatz zu klassischen TFM, wo Zellen haften an flachen Oberflächen und kann mit Minuten-Schritten zu migrieren ist zu erreichen durchzuführen. , Um diese kleinen Schritte analysieren, ist es jedoch erforderlich, um Fluoreszenzbilder von focal adhesion Punkte zu nehmen, die den Zugang zu sehr fortgeschrittenen m erforderticroscopes und sehr aufwendige Bildanalyse-Software. Nichtsdestotrotz ist die Verteilung der mechanischen Profile innerhalb größeren Populationen oft noch ein bestimmendes Merkmal einer Zelllinie. Somit ist ein Verfahren mit hohem Durchsatz, die Charakterisierung ermöglicht einer großen Anzahl von Zellen erforderlich. Das Handbuch Abbildungsverfahren und Open-Access-Software hier präsentierten birgt ein großes Potenzial für die Skalierung zur vollautomatischen Mikroskopsysteme. Zusammenfassend ein robuster Traktionskraftmikroskopie Ansatz vorgestellt, in einem Standard-Zelle Biologie-Labor ohne weiteres annehmbar ist. Der gesamte Workflow von der Zellaussaat zur Bildanalyse ist einfach und effektiv. Während die hier beschriebenen Protokolle sind voll funktionsfähig sind Verbesserungen im Gange, um die Analysealgorithmen anpassen, um in der Lage, auch hand micropost Arrays mit orthogonalen Layouts und der Entwicklung von Verfahren, die die Analyse von Bildsequenzen aus lebenden Zellen zu vereinfachen. In Zusammenhang mit den Ergebnissen für Knochenkrebszelle lines, die hier beschriebenen Ansätze können zu Rasterzellen aus klinischen Biopsien verwendet, um zu beurteilen, ob solche Tests können prognostischen Wert zu halten, so dass Ärzte, um die metastatischen Potential der Biopsie Zellen aus dem Knochenkrebspatienten vorherzusagen. Ein solcher Assay würde die therapeutische Strategien zu beeinflussen. Andere mögliche Anwendungen beziehen sich auf Tests pharmazeutisch aktiven Verbindungen auf mechanisch aktive Zellen, wie Zellen der glatten Muskulatur oder Herzmuskelzellen, die möglicherweise in Gründung Wirksamkeit oder Toxizität eines Arzneimittels zu unterstützen.

Mechano empfindlichen zellbasierte Assays ermöglichen die Untersuchung von adhärenten Zellen, mit einer breiten Palette von Anwendungen, die die zentrale Rolle, die Mechanik in der Zellbiologie spielen reflektieren. Diese Anwendungen konzentrieren sich oft auf die zugrunde liegenden Mechanismen, die subzelluläre Prozesse oder Ganzzellverhalten zu fahren. Einerseits können externe Umweltfaktoren, wie die extrazelluläre Matrixzusammensetzung oder Matrixsteifigkeit dramatischen Einfluss auf die mechanischen und biologischen Antwort der Zelle. 1 Das gleiche kann nach der Verwendung von vielen Klassen von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen beobachtet werden, deren Wirkungen sind häufig unter Verwendung von Zellkulturmodellen charakterisiert. 2 auf der anderen Seite genotypischen Eigenschaften, wie sie durch spontane oder experimentell induzierter Genmutationen verursacht werden, können starke Änderungen Zellphänotypen, die mit Veränderungen im Zytoskelett Struktur und Funktion zugeordnet sind induzieren. 3 Diese Beispiele sind nur ein paar der vielen möglichenThemen, für die mechanische Phänotypisierung der Zellen von Bedeutung ist, und alle diese sind zweckmäßigerweise mit micropost Arrays untersucht. Zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels, haben rund 200 Artikeln veröffentlicht worden beschreiben zell micropost Interaktion. Diese Arbeiten diskutieren theoretische Aspekte der micropost Ablenkung Grundlagen sowie praktische Hinweise zu deren Herstellung. Der erste Artikel der Wechselwirkung von Zellen und flexible micropost Arrays beschreibt, wurde von Tan und Kollegen im Jahr 2003 4 veröffentlicht Im Gegensatz zu klassischen Traktionskraft-Mikroskopie (TFM), wo kontinuierliche weichen Substraten verwendet werden, um Nanonewton-Wägezelle Kontraktilität, Tan et al schätzen. ein Verfahren beschrieben, unter Verwendung von mehreren eng beabstandeten vertikalen Balken aus Silikonelastomer hergestellt. Die Hauptvorteile dieser Technik ergeben sich aus zwei Hauptfunktionen. Erstens, um die Zell-Substrat scheinbare Steifigkeit zu ändern braucht man nur die micropost Abmessungen verändern, währendDie Substratzusammensetzung ansonsten konstanten und wodurch Unterschiede in der Oberflächentopologie und Chemie. Zweite microposts handeln wie einzelne Federn, die diskret mit Kraft und räumlichen Auflösungen in der Größenordnung von einzelnen fokalen Adhäsionen untersucht werden kann und die analytischen Herausforderungen, die inhärent analoge Analyse durch Standard-TFM sind zu reduzieren. Heute ist die Palette von Anwendungen für micropost Arrays stark gerade die Abbildung der Kräfte für ein paar Einzelzellen überschreitet. So berichtet Akiyama die Verwendung eines isolierten Rückengefäß Gewebe von einem Falter Raupe als Aktuator für eine micropost Array, um ein Insekt mit Muskelkraft betriebene autonome Mikroroboter zu entwickeln. 5 Allerdings haben die meisten Veröffentlichungen zur microposts auf Studien von Erkrankungen wie Infektionen oder Krebs. Zum Beispiel haben micropost Arrays verwendet, um die Krafterzeugung von gebündelten Typ IV-Pili von Neisseria gonorrh studierenOEA Kolonien, die mit Signalkaskaden Verbesserung Infektion assoziiert ist. 6 Andere haben microposts verwendet, um Brustkrebszellen mit pharmazeutischen Verbindungen zur Förderung der Zytoskelett behandelt zu studieren. 7 Ablenkung eines micropost wird oft mit klassischen Balkentheorie beschrieben, für einen Freischwinger mit einem Ausgabeaufschlag unter der Annahme der Zelle misst nur auf die Spitze der micropost. Hier wird die aufgebrachte Kraft F, die eine Durchbiegung δ verursacht, hängt von der micropost des &quot;Biegesteifigkeit&quot; k und wird berechnet durch: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) mit E, I, und L der Elastizitätsmodul, Flächenträgheitsmoment und Strahllänge auf. Allerdings ergibt sich aus dieser Gleichung geben nur einen allgemeinen Angleichung der Kräfte am Werk, da Strahl Scher- und Biege sowie Substrat Verziehen nicht in ac getroffenGraf. In Anbetracht, dass microposts werden typischerweise aus weichen Materialien wie Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt -basierte Silikonkautschuk müssen diese Faktoren einbezogen werden. . Schoen et al gezeigt, daß es eine solche Korrekturfaktor auf der Basis des Seitenverhältnisses des micropost (L / D) und der entsprechenden Polymer Poissonzahl v 8 Es wird durch gegeben.: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Mit T-Neigung (v) ein Neigungskoeffizienten, die Anpassungsparameter a = 1,3, wie in dem gleichen Artikel gefunden werden enthält: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Das bedeutet, dass ein micropost korrigiert Steifigkeit k corr ist das Produkt aus dem reinen Biegesteifigkeit k = k Kurve und der Korrekturfaktor Korrgegeben durch: <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Daher sollten Zellkraftberechnungen unter Verwendung des verfeinerten Variante der Gleichung (1) gerade lesen werden: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) Die Auswirkungen der Korrektur offensichtlicher, sobald typische Werte für micropost Abmessungen eingesetzt werden. Zum Beispiel ein 15-Mikron lang micropost mit einem kreisförmigen Querschnitt und einem Durchmesser von 5 um aus PDMS-basierten Silikonkautschuk führt zu einem Korrekturfaktor von 0,77 und somit eine korrigierte Berechnung würde der ausgeübten Kräfte Zelle um 23% zu überschätzen. Dies wird umso schwerer für microposts mit kleineren Seitenverhältnisse. Traditionell wurde micropost Bildanalyse auch auf idealisierten Strahlbiegetheorie basiert. Im Jahr 2005 die Gruppe, die die Verwendung von MICR-Pionieropost Arrays veröffentlichte eine Bildanalyse-Software für micropost Analyse geeignet 9 Die Software benötigt eine Software-Lizenz und der Benutzer muss drei Bilder für jede Position zu nehmen. jeweils einer aus oberen und unteren Ebenen der micropost im Sendemodus und ein anderer in der Fluoreszenzmodus mit dem gefärbten Zelle. Nach einem Vergleich der oberen und unteren Positionen für jede micropost die Software bestimmt einen Kraftvektor Feld und berechnet damit verbundenen Parameter wie Kraft pro Beitrag. Andere Softwarepakete bestehen und deren Analyse Prinzipien werden kurz in die entsprechenden Artikel, die sie beschreiben, erwähnt, aber diese Analysesoftwarepakete sind in der Regel nicht öffentlich verfügbar. 10,11 Die micropost Anordnungen zum Abbilden von Zellkräften konstruiert werden kann als welche entweder in einer orthogonalen micropost Layout oder einem hexagonalen ein, von denen die letztere den Vorteil haben äquidistanten Abstände zwischen allen benachbarten microposts klassifiziert werden. Typische microposts have einen runden Querschnitt und ihre Abmessungen im Bereich von 1,0 um bis 10 um im Durchmesser und 2 bis 50 um in der Länge. 4 jedoch microposts mit elliptischen oder quadratischen Querschnitt haben ebenfalls berichtet. 12,13 Die Verwendung von PDMS-basierten Silikon-Mischungen als micropost Material ermöglicht zum Addieren Nanopartikel in der Mischung. Zum Beispiel das Hinzufügen Cobaltnanostäbe ermöglicht eine magnetische Aktivierung des micropost und somit gibt einen weiteren Freiheitsgrad, um mögliche experimentelle Designs. 14 Die meisten Gruppen auf flachen starren Substraten wie Deckglas oder in einer Petri-Schale produzieren ihre micropost Arrays. Allerdings Mann und Mitarbeiter berichteten kürzlich über eine micropost Array auf einem dehnbaren Membran gebildet. 15. Dies ermöglicht die Anwendung von Zelldehnungskräfte an anhaftenden Zellen während des Studiums lebenden Zellen subzellulären dynamischen Reaktionen in Bezug auf Zellkontraktilität. Die breite Anwendung und die meisten Established Verfahren zur Herstellung micropost Arrays auf Weich-Lithographie, wie in den Protokollen der aufschluss Sniadecki und Kollegen. 16-18 Kurz Standardreinraumprozesse beschrieben werden, verwendet werden, um die Mikrostrukturen auf einem Siliziumwafer unter Verwendung von Fotolack SU8 Ganzes erzielt. Dies wird durch ein Kopierverfahren, bei dem der Silikonkautschuk über die Strukturen ihre Übertragung in Formen gegossen, gefolgt. In einem zweiten Schritt diese Formen werden verwendet, um die anfängliche Mikrostruktur unter Verwendung von Silikonkautschuk auf einem gewählten Substrat replizieren. Doch trotz der großen und wachsenden Zahl von Publikationen, um ihre Anwendung beziehen, zur Schaffung einer Herstellungsprozess für microposts nimmt sehr viel Zeit sogar für Mikrotechnik-Experten; es gibt viele Prozessschritte, die Optimierung und Anpassung an die spezifischen Testumgebung und micropost Layout benötigen, um ein akzeptables Qualitätsniveau zu liefern. Kommerzielle micropost Arrays sind jetzt in einer ready-t verfügbaro-Nutzung (&quot;off-the-shelf&quot;) Format mit einer gleichbleibend hohe Qualität. Als solche sind sie eine Alternative zu dem Vor-Ort-Erzeugung erforderlichen komplizierten und langwierigen Herstellungsprozess. In dieser Arbeit wurde ein im Handel erhältlicher micropost Array zur Abbildung zellulärer Kräfte mit einem einzigen Bild Hellfeldmikroskopie verwendet. Noch wichtiger ist in diesem Artikel beschrieben und dokumentiert eine voll funktionsfähige Open Source-Software mit dem Namen MechProfiler, die zum Download als Begleitmaterial zu diesem Manuskript zur Verfügung steht. Eine aktiv gepflegte Version der Software finden Sie auch bei http://www.orthobiomech.ethz.ch gefunden werden. Die Kombination aus einem &quot;off-the-shelf&quot; Assay und einem kompatiblen Open-Source-Analyse-Software deutlich senkt die Eintrittshürde, um genaue TFM Experimenten zu erreichen. Forscher ohne Zugang zu entweder Reinraumanlagen oder Software-Entwicklungskompetenz können zelluläre Kräfte erfolgreich zu analysieren. Es einem Benutzer ermöglicht, auf den mechanos konzentrierenensitivity Assay Ausgangs anstatt die Technologie selbst, und macht Zugkraftmessungen zur Verfügung, um eine breitere Gemeinschaft. Darüber hinaus ist dies ein wichtiger Schritt, um den Weg zur vollautomatischen Überprüfungen micropost Arrays zu ebnen. Die MechProfiler Analyse-Software verarbeitet Bilder in Dateiformat TIFF, PNG, BMP und JPG. Bilder können unter Verwendung von Fluoreszenz, Phasenkontrast und Hellfeld-Lichtmikroskopie genommen werden. Die Standalone-Programm läuft zusammen mit dem freien Matlab Compiler Runtime (verfügbar unter: Abbildung 12) und die zugrunde liegenden Algorithmen erlauben schlanke Bildverarbeitung, die dem Benutzer ermöglicht, Bilder mit einzelnen oder mehreren Zellen in etwa 1 min zu verarbeiten. Ferner können diese Zellen entweder lebenden oder &quot;fixiert&quot;. Die MechProfiler Software kann die Datenanalyse Durchsatz stark zu erhöhen, indem sie sich auf die Reproduzierbarkeit der Qualität kommerzieller micropost Anordnungen, genauer gesagt, die Standard &amp; #8220; nicht abgelenkten &quot;Position jeder Eintrag in der Anordnung gegen ein ideales Raster ausgegangen werden (für das Gitter in der für diese Studie verwendeten Arrays Fertigungsabweichungen betrugen weniger als 100 nm). Kurz öffnet man eine Auswahl von Bilddateien für die Analyse, schneidet sie in den Bereich von Interesse definiert, die Beiträge von Zellen bedeckt oder die verworfen werden müssen, bestimmt die Postpositionen, berechnet die Durchbiegungen / Kräfte gegen idealen Rasters und schließlich speichert alle zellspezifischen Daten mit der Möglichkeit für den Export, darunter zu einem Standard-Office-Tabellenkalkulation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS-buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropost array&#160;</td>
			<td rowspan="2">MicroDuits</td>
			<td rowspan="2">MPA-col1/FN</td>
			<td>Micropost dimensions:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td>
			<td>&#216;= 6.4 &#181;m, l=18.2 &#181;m; grid=&#160;13 &#181;m, kcorr= 2.87 nN/&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100.983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td>Coomassie blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol ACS p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>WillCo Wells BV</td>
			<td>GWSb-3522</td>
			<td>35 mm diameter, aperture 22&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-100 Eclipse</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3-L3</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Camera controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS Fi2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Aufrufe.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

Serie: Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Studieren Zellrollen Trajectories auf Asymmetric Rezeptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Forschung

Biotechnik

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., global gene expression, cell division) encountered within living cells. However, such systems, used in conventional macro-scale bulk reactors, often fail to exhibit the dynamic behaviors and efficiencies characteristic of their living micro-scale counterparts. Understanding the impact of internal cell structure and scale on reaction dynamics is crucial to understanding complex gene networks. Here we report a microfabricated device that confines cell-free reactions in cellular scale volumes while allowing flexible characterization of the enclosed molecular system. This multilayered poly(dimethylsiloxane) (PDMS) device contains femtoliter-scale reaction chambers on an elastomeric membrane which can be actuated (open and closed). When actuated, the chambers confine Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reactions expressing a fluorescent protein, allowing for the visualization of the reaction kinetics over time using time-lapse fluorescent microscopy. Here we demonstrate how this device may be used to measure the noise structure of CFPS reactions in a manner that is directly analogous to those used to characterize cellular systems, thereby enabling the use of noise biology techniques used in cellular systems to characterize CFPS gene circuits and their interactions with the cell-free environment.

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Plombierbare Femtoliter Kammer Arrays für Zellfreie Biologie

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

Interfacing Mikrofluidik mit Mikroelektrode Arrays für das Studium neuronale Kommunikation und axonalen Signalausbreitung

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

Human iPSC-Derived Cardiomyozyte Networks auf Multiwell Micro-Elektroden-Arrays für recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

Herstellung von Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays für In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.