Wir erkennen die Unterstützung von Mike Muntifering und Matt Kofron mit konfokaler Bildgebung und Gail Macke mit histologischen Verfahren. Diese Arbeit wurde teilweise von der National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 DS) unterstützt.

Die Tiere wurden in pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Die Mäuse wurden nach Protokollen genehmigt durch CCHMC Institutional Animal Care und Use Committee (Cincinnati, OH USA) behandelt. Mäuse in diesen Studien verwendet wurden, in einem gemischten Hintergrund gehalten. 1. Ganze Berge X-Galactosidase-Färbung <ol><li> Euthanize schwangere Frau bei E11,5 bis E14,5, durch CO 2 Inhalation. Setzen Sie Tiere in CO 2 Kammer, laden Sie die Kammer mit CO 2. Pflegen Sie Tiere in der Kammer für mindestens 5 min. Führen Sie sekundäre Methode der Euthanasie durch Genickbruch. </li><li> Saubere Bauchbereich mit Ethanol (EtOH) 70% und führen Laparotomie mit einem einzigen Bauchmittelschnitt. Nutzen chirurgische Scheren und Standardmuster (gerade gesägten) Zange. </li><li> Isolieren Gebärmutterhörner Zange und einer feinen Schere verwenden und sofort setzen Gewebe in Petrischale gekühlt enthaltenden PBS-Lösung. Pflegen Gewebe auf Eis, bis Sie fortfahrenzur Isolierung von Embryonen. </li><li> Isolieren Embryonen von Gebärmutterhörner. Präparieren embryonale trachealen Lungengewebe Binokular mit. Nutzen Sie feine Spitze Pinzette und Schere zu halten und das Gebärmuttergewebe durchlöchern und concepti die Embryonen freizugeben. <ol><li> Entfernen Eihüllen bleiben. Mit Hilfe von Nadelklingen geschnitten Kopf von Embryonen und unteren Körperteil unterhalb des Zwerchfells. Finde Leber als Wahrzeichen. </li><li> Nach Isolierung des Thoraxbereich des Embryos, gehen lateralen Seiten der Körperwand, der Wirbelsäule und des Herzens unter Verwendung von Nadelklingen zu entfernen. Achten Sie darauf, während das Herz Entfernen zu vermeiden Luftröhrengewebe zu verletzen. Schließlich vorsichtig, trennen Sie die Speiseröhre aus der Luftröhre durch die Speiseröhre mit Hilfe von Nadelblätter ziehen. Pflegen Gewebe in PBS-Lösung auf Eis. </li></ol></li><li> Platz Gewebe in 4 ml Schraubdeckel Fläschchen unter Verwendung von Glas oder Transferpipetten. Fix trachealen Lungengewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 30 min. Nach der Fixierungspülen Gewebe mit PBS. Während dem Spülen X-gal - Färbung - Lösung ( je 5 mm K 3 Fe (CN) 6, (100 &amp; mgr; l 0,5 M Lager) 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 &amp; mgr; l 0,5 M Lager) 2 mM MgCl 2, vorbereiten ( 20 &amp; mgr; l 1 M Lager) 0,01% NaDOC (50 &amp; mgr; l 2% Lager), 0,02% NP 4 O (100 &amp; mgr; l 2% Lager), 1 mg / ml X-gal (500 &amp; mgr; l von 20 mg / ml Brühe) und 9,13 ml Wasser destilliert, um ein Endvolumen von 10 ml zu bringen). </li><li> Entfernen Sie alle verbleibenden PBS und 2 ml X-gal-Färbung Lösung für das Glasfläschchen. Legen Sie Fläschchen in Fach auf Schüttler. Stain Gewebe 1 bis 2 h in X-gal-Färbelösung. Inkubieren des Gewebes in X-gal-Lösung für 4 Stunden zur weiteren Verarbeitung und Einbettung. </li><li> Die Reaktion durch Waschen Gewebe in 3% Dimethylsulfoxid-PBS. Spülen in PBS, 3-mal für jeweils 5 min waschen und lagern in 70% Ethanol. </li><li> Füllen Petrischalen mit einem 1% Agarose / PBS-Lösung. Lassen Sie Agarose erstarren. Mit Glastransferpipetten, legen Sie das Gewebe auf Agarose-coated Platten mit PBS-Lösung gefüllt. Fotografieren ganze Halterungen ein Binokular mit. Wählen Sie den entsprechenden Filter für Hell. </li><li> Um besser zu Websites von X-gal-Färbung Prozessproben für Paraffineinbettung und Schneiden unterscheiden. Prüfmuster in feinen Rasterkassetten. <ol><li> Zur Verarbeitung von Proben für die Paraffineinbettung eines automatisierten Prozessor verwenden und einen kurzen Zyklus wie folgt aufgestellt: sechs Änderungen von Alkohol: 5 min erste Änderung und 3 min pro jede verbleibende Veränderung. Drei Änderungen von Xylen: 5 min erste Änderung und 3 min nächsten zwei Änderungen. Die vorherigen Schritte werden bei 30 ° C durchgeführt wird. Schließlich führen drei Änderungen von Paraffin bei 62 ° C: 25 min, 8 min und 5 min. </li></ol></li><li> Orient Proben zum Einbetten mit Gewebe einzubetten Boot flach auf dem Boden liegend. Sorgfältig Paraffin fügen Sie das Einbetten von Boot zu füllen. Kühlen Sie sofort auf kalte Platte Station bis Paraffin erstarrt der Einbettung. Entfernen Block vom Boot einbetten. Mit einem Mikrotom, erzeugen 6 um sexionen. Berg Abschnitte auf vorbehandelte Spangen und trockenen Folien auf Folie wärmer Satz bei 42 ° C für 1 Stunde. </li><li> Backen Sie gleitet über Nacht in einem Ofen bei 56 ºC. Die Objektträger in Racks. Deparaffinisieren Träger mit drei Änderungen von 100% Xylen, jeweils 10 min. Verwenden Sie Schalen gefüllt mit 200 ml Xylen Färbung. </li><li> Rehydrieren Folien unter Verwendung von abgestuften Serie EtOH (100%, 70%, 50% und 30%, 1 min pro Schritt) zu PBS, bevor sie für 10 bis 30 sec mit Nuclear Fast Red Gegenfärbung. Spülen Sie Objektträger mit Leitungswasser dreimal für jeweils 5 min über Kernechtrot zu entfernen. </li><li> Entwässern Dias in einer abgestuften EtOH-Serie (50%, 70% und 100% EtOH) vor dem Waschen in drei Änderungen von Xylen (20 taucht jede Änderung) und Abdeckung Abrutschen mit Xylen auf Basis Eindeckmedien. </li></ol> 2. Lektin Färbung <ol><li> Präparieren E13.5 und E14.5 trachealen Lungengewebe als 1,1 bis 1,4 in Schritten beschrieben. Mit Glastransferpipetten Ort Gewebe in Schraubdeckel Fläschchen. Fix trachealen Lungengewebe mit 2 ml2% PFA-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Nach der Fixierung spülen Proben in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten zu waschen. </li><li> Bereiten Blocking-Puffer, in der Regel um ein Endvolumen von 10 ml Lösung. Mit 0,1 g BSA (1%) auf 8 ml PBS. Erlauben BSA aufzulösen. Fügen 0,2 ml Ziegenserum (2%) 0,03 ml von Triton X-100 (0,3%). Bringen Endvolumen auf 10 ml mit PBS. Block Proben für 1 Stunde in 0,5 ml Puffer bei Raumtemperatur blockiert. </li><li> Entfernen Blockierungspuffer eine Transferpipette und ersetzen mit Lektin Lösung, die aus 50 ug / ul Lektin, 10% Ziegenserum und PBS. Verwenden Sie 250 ul Lektinlösung pro Probe. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Achten Sie darauf, das Glas Fläschchen mit Gewebe mit Aluminiumfolie zu bedecken. Nach Inkubation mit Lektin-Lösung gründlich Proben in PBS dreimal für 10 min. </li><li> Platz Explantate in Agarose-beschichteten Petrischalen genug PBS, die Proben zu decken. Fotografieren ganze Halterungen ein Fluoreszenz-Binokular mit. Wählen Sie das geeignet friate Filter zur Detektion Fluoreszenz. Lectin PNA ist in der Regel an GFP gekoppelt. </li></ol> 3. Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung und konfokale Mikroskopie <ol><li> Isolieren trachealen Lungengewebe, Transfer zum 4 ml Glas Schraubverschluss Fläschchen und fixieren über Nacht in 4% PFA. E11,5 Gewebe kann in 2% PFA fixiert werden. Shop in Methanol 100%. Die Proben können bei -20 ° C mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Entfernen Sie unter Verwendung von Methanol Transferpipette und Permeabilisierung Proben Dent Bleach mit (4 Teilen Methanol, 1 Teil DMSO und 1 Teil 30% H 2 O 2) für 2 Stunden. Hydrats Gewebe in einer abgestuften Reihe von Methanol in PBS verdünnt, wie folgt: 100% Methanol, 75% Methanol, 50% Methanol, 25% Methanol, 100% PBS. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur während jeder Stufe der Hydratisierung. </li><li> Block Gewebes in 0,5% Blockierungsreagenz in PBS verdünnt (siehe Materialien für Details) für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren. </li><li> Verdünnte primärer Antikörper in BlockingLösung (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) und Inkubation Proben über Nacht bei 4 ° C. Waschproben mit PBS fünfmal bei Raumtemperatur. Führen Sie jede Wäsche für 1 Stunde. </li><li> Anwenden sekundären Antikörper bei einer 1: 500-Verdünnung in 0,5% Blockierungslösung. Wählen Sie sorgfältig Sekundärantikörper Bindung zwischen Sekundärantikörper zu verhindern. über Nacht bei 4 ° C in einem dunklen Raum inkubieren. Waschproben dreimal für 20 min bei Raumtemperatur. Dehydratisieren Proben in einer abgestuften Reihe von Methanol in PBS verdünnt, wie folgt: 25% Methanol, 50% Methanol 75% Methanol, 100% Methanol, 10 min jeden Schritt. Stellen Sie sicher, dass die Proben mit Aluminiumfolie bedeckt bleiben und minimieren Belichtung: HINWEIS. Gewebe kann nun bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden, bis photographiert. </li><li> Transfer - Proben , um benutzerdefinierte Stufe Platten, entfernen Methanol und klar mit etwa 200 ul Murrays klare Lösung 19,20 (2 Teile Benzylbenzoat, 1 Teil Benzylalkohol) sofort befErz-Bildgebung. Fotografieren Sie mit einem konfokalen Mikroskop. Verarbeitung und Analyse von Bild Imaging-Software. </li></ol> 4. Zellproliferation <ol><li> Injizieren E11.5 trächtigen Mäusen intraperitoneal mit einer Lösung von BrdU in einer Konzentration von 100 ug BrdU / g Körpergewicht. Sacrifice weiblich, wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben und isolieren Embryonen bei E12,5 oder E13.5. Mit Messerklingen, die Verbrauchs Köpfe und unteren Teil des Körpers unterhalb Brusthöhle. </li><li> Legen Sie thorakalen Gewebe in 4 ml Fläschchen Kappe schrauben und reparieren in 1 ml 4% PFA über Nacht. Waschproben mit PBS zweimal für 5 min und entwässern Proben durch eine Ethanolreihe in destilliertem Wasser bis zu 70% Ethanol verdünnt, wie folgt: 30%, 50% und 70% Ethanol, 5 min jeden Schritt. <ol><li> Prüfmuster in mittlerer Größe Bildschirm-Kassetten. Prozess Gewebe für Paraffineinbettung mit und automatisierten Prozessor. Stellen Sie einen Zyklus wie folgt zusammen: sechs Änderungen von Alkohol für jeweils 8 min, drei Änderungen von Xylen für 6 min jeweils drei cHanges von Paraffin, 25 min, 9 min und 8 min. </li></ol></li><li> Einbetten in Paraffin, das Gewebe in gewünschte Position auszurichten 6 um quer zu erzeugen oder Längsschnitte, wie in Abschnitt 1. Platz Abschnitte auf Folien beschrieben und ermöglichen Gewebe haften auf Folie wärmer Satz bei 42 ° C für 1 Stunde gleiten. </li><li> Backen Sie Dias, auf ihren Seiten, über Nacht in einem Ofen bei 56 ° C. Die Objektträger in Kunststoff-Racks. De-Paraffin säubern Folien durch Eintauchen in drei Änderungen von 100% Xylene, 10 min pro Wechsel. Verwenden 200 ml Xylol vollständig zu Folien unterzutauchen. Rehydrieren Folien unter Verwendung von abgestuften Serie EtOH (100%, 70%, 50% und 30%, 5 min pro Schritt unter Rühren) zu PBS (5 min). </li><li> Führen Antigen-Retrieval 10 mM Citratpuffer, pH 6 Zu 100 ml Citratpuffer Mischung 18 ml 0,1 M Citrat-Citronensäure-monohydrat und 82 ml 0,1 M Natrium herzustellen. <ol><li> Platz Proben in Kunststoff Färbetrog gefüllt mit Antigen-Retrieval-Lösung und Mikrowelle für 6,5 min bei hoher Leistung. In distilled Wasser Glasküvette für verdampfte-Citrat-Puffer und reheat bei 40% Leistung für 6 min zu kompensieren. </li><li> Füllen Sie Coplin Glas mit Wasser nach oben, und aufwärmen wieder bei 40% Leistung für 6 min. Mikrowelle Zeiten können auf Mikrowelle benutzt variieren. </li><li> Erlauben Folien für 20 min bei Raumtemperatur vor dem Waschen Folien in destilliertem Wasser für 1 min, gefolgt von PBS für 5 Minuten abkühlen lassen. Nach dem PBS waschen Blockobjektträger für 2 Stunden in TBS Blockierungslösung (2,425 g Tris-Base und 8,765 g NaCl verdünnt in 1 l destilliertem Wasser) 10% Eselserum und 1% BSA enthält. </li></ol></li><li> Hinzufügen primären Antikörpern, verdünnt in Blockierlösung (TBS, enthaltend 10% Eselserum und 1% BSA). BrdU (Mitose-Marker), Nkx2.1 (Atemwege Epithel), Sox9 (Zellen, die wird Anlass zu Knorpel geben) und αSMA (glatte Muskelzellen). Inkubiere Objektträger über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie Overlay-Methode Antikörper zu erhalten. Bewerben 180 ul Antikörper an eine Dichtung und befestigen Sie dann Schieber als ob DeckglasKlingeln. </li><li> Trennen Dichtung durch Schieber in destilliertes Wasser getaucht wird. Nach dem Entfernen der Dichtung, nicht gebundenen primären Antikörper waschen von sechs 5 min wäscht Durchführung mit TBS 0,1% Tween-20 enthält. <ol><li> Inkubiere Objektträger mit Antikörper Sekundär verdünnten Lösung bei einer Verdünnung von 1 in Blockierungs: 200, 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wählen Sekundärantikörper sorgfältig unerwünschte Bindung zwischen ihnen zu verhindern. Entfernen ungebundenen sekundären Antikörper, indem es drei 5 Minuten Waschungen mit TBS, das 0,1% Tween. </li><li> Waschen Sie Folien in 0,1 M Tris-Base zweimal für 5 min und dann 0,05 M Tris-Base zweimal für 5 min. Die Objektträger können in 0,05 M Tris-Base gelassen werden, während coversliping mit Montage Medien mit oder ohne DAPI (1,5 ug / ml). Shop Dias in Dia-Ordner bei 4 ° C und vor Licht schützen, indem Ordner mit Aluminiumfolie abdecken. </li></ol></li><li> Visualisieren Färbung und Fotografie unter Verwendung eines automatisierten Fluoreszenzmikroskop. Graf markierte Zellen und Gesamt Zellen pro Feld fotografiert bei20X und 40X, um zu bestimmen Verhältnisse von Zellen zu Gesamtzellen vermehren. </li></ol>

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&quot;Die Autoren haben nichts zu offenbaren.&quot;

Veranstaltungen der Morphogenese der Atemwege zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden, insbesondere die für die Strukturierung der leitenden Atemwege erforderlichen Prozesse. Frühere Studien haben ex vivo - Techniken verwendet , wobei die Entwicklung Explantate kultiviert werden an der Luft-Flüssigkeit - Zwischenphasen - oder eingebettet in Matrigel 21,22. Diese Studien haben gezeigt, wie Wachstumsfaktoren, die Strukturierung der Entwicklungs Trachea und die Bildung von Trachealknorpels beeinflussen. Eine Einschränkung dieser Studien ist , daß die Architektur des Gewebes nicht richtig gehalten wird , und daher kann sie nicht ganz die in vivo Verfahren der Chondrogenese rekapitulieren. Der Ansatz, den wir übernahm die Rolle des Wnt - Signal in den Prozess der Durchführung von Atemwege zu untersuchen Musterung in - vivo - Studien in Verbindung mit whole mount Färbetechniken, Immunofluoreszenz und Imaging enthalten. X-gal-Färbung von whole mount Gewebe, gefolgt von sectioning und Gegenfärbung, stellt Vorteile gegenüber der Färbung von Paraffinschnitten. Ganze Berge Färbung ermöglicht die direkte Detektion von Stellen, an denen Wnt / β-Catenin-Aktivität wirksam ist. Darüber hinaus bestimmt im Mesenchym genaue Standorte der gefärbten Explantate sectioning wobei die Aktivität sich als Entwicklung fortgeschritten ist. Letzteres ist eine bessere und genaue Anzeige als Nachweis der Expression von β-Galactosidase-Enzyms in Paraffinschnitten. Während die enzymatische Aktivität in den Abschnitten festgestellt werden konnte, wird diese Prozedur Kryoabschnitte erfordern, die zu erzeugen, nicht immer einfach sein wird, und die Architektur von kleinen Proben nicht erhalten kann. Eine Einschränkung in dem Protokoll in diesem Dokument beschrieben wird, ist, dass die Verarbeitung von Proben für die Paraffineinbettung nach whole mount-Färbung einen Verlust des Signals führen. Deshalb müssen Proben länger in X-Gal-Lösung zu bleiben und einen kürzeren Zyklus für Paraffineinbettung verwendet werden sollte, gutes Signal auf Abschnitte zu erhalten. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Verarbeitung von kleinen Gewebe für Paraffineinbettung wird in Verringerung der Größe des Gewebes führen. Dies ist ein unerwünschtes Ergebnis, während sie mit verringerten Menge an Gewebe zu arbeiten. Daher entwickelten wir eine kurze Zyklusverarbeitung, die gleichzeitig für eine ausreichende Konservierung der Struktur ermöglicht, ohne in der Größe des Gewebes verursacht Reduktion. Auf der anderen Seite, ganze Immunofluoreszenz Durchführung der Prüfung nach der Technik , die von Ahnfelt-Ronne 23 beschrieben modifiziert, tridimensional Visualisierung des Entwickelns tracheale und pulmonale Gewebe erlaubt, mit einer definierten Expressionsmuster von Proteinen durch Schlüsseltranskriptionsfaktoren wie Nkx2.1 codiert und Sox9. Wenn gewünscht, kann die gesamte Halterung Färbung als konfokale Gestützte z Stapel von Bildern dargestellt werden, unterschiedliche Tiefen des trachealen Lungengewebe zeigt. Während kleine Explantate Bebilderung, Clearing- des Gewebes sollte in einer Tischplatte durchgeführt werden. Wir verwendeten dicke Metallindividuelle Bühnenplatten mit optischen Boden gemacht, wo Proben gelöscht und abgebildet. Dies verhindert den Verlust von Material, während kleine Gewebe Übertragung nach dem Schritt zu löschen. Während ganze Berg Immunofluoreszenz eine geeignete Technik zur Färbung von kleinen Gewebe ist, erkennen wir auf die Technik Grenzen. Insbesondere beobachteten wir unähnlich Leistungen von Antikörpern, die Antigen besser in den Abschnitten erkennen als auf ganze Berg gegenüber. Dieses Problem kann die Leistung der Technik entgegen, wenn keine alternativen Antikörper verfügbar sind. Es ist auch möglich, dass die Verwendung von Methanol und Clearing mit Murray klar beobachtet eine negative Auswirkung auf das Signal haben kann. In Zukunft werden wir andere nicht-organischen Clearing - Lösungen zu testen und das Protokoll richtig zu diesem Zweck 24 einzustellen. Eine letzte Überlegung ist, dass ganze Berg wird die Studie von einigen Proteinen in einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt zum Ausdruck zu ermöglichen. In früheren Berichten wurde die Nützlichkeit gezeigtPNA - Lektin - Färbung mesenchymalen Verdichtungen in den Abschnitten von Luftröhrengewebe 21,25 zu erkennen. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine Methode, durch die die Färbung in ganze Berg wurde durchgeführt, die eine bessere Visualisierung der Regionen der Trachea erleichtert, wobei wird der Knorpel gebildet werden. Während der Durchführung Pflege Lektin-Färbung sollte bei der Verwendung der entsprechenden Konzentration von Lektin nicht über Fleck platziert werden, als im Handel erhältliche PNA-Lektin an GFP gekoppelt ist. Auto-Fluoreszenz des Gewebes kann die Ergebnisse erschwert verschleiern Bands zu unterscheiden entsprechenden Verdichtungen mesenchymalen. Schließlich wird in vivo - Markierung von Gewebe mit BrdU gefolgt von Schneiden und Immunfluoreszenzanfärbung ist eine mögliche Technik der Zellproliferation zu bestimmen , die Vorteile gegenüber typischen und statische Färbung wie PPh3 oder PCNA 26,27 präsentiert. Die letztere Technik stellt Beschränkungen, wie Färbung auf die variieren jeZellzyklus-Stadium. Dieses Problem wird durch unsere beschriebene Technik beseitigt. In vivo - Markierung durch das Einbetten, sectioning und Immunofluoreszenz gefolgt Kombination erlaubt uns , dass epithelialen Wnt zu bestimmen Liganden die Differential Proliferation von Sox9 und α-SMA - exprimierenden Zellen ausgleichen , die 7 Anlass zu Trachealknorpels und Muskeln geben. Zusammengefasst ein Ansatz mit mehreren Technik, um die Strukturierung der Entwicklung der Atemwege zu studieren ermöglicht eine tiefe Analyse der Rolle der Wnt-Signalweg in Atemweg Morphogenese durch. Diese Studien bestimmt, die genauen Stellen von Wnt / β-Catenin in den trachealen Gewebe sowie induktiven und instruktive Signalisierungs vom Trachealepithel vorgesehen, die für die Spezifikation, differentielle Proliferation von trachealen Mesenchym Zelllinien, sowie der Knorpelbildung erforderlich ist. Unsere Zukunft Richtungen sind die Optimierung der ganze Berg Färbung für kürzlich identifizierten WlsZielgene, sowie die Durchführung von whole mount Immunofluoreszenz in Kombination mit Lektin Färbung.

Respirationstrakt Entwicklung wird durch embryonaler Tag 9 (E9) mit dem Auftreten von Nkx2.1 - positiven Zellen in der Bauch endodermalen foregut 1,2 eingeleitet. Ösophagus-Trachealtubus Trennung wird durch E11.5 lösen , wenn die Rohre als getrennte Einheiten unterschieden werden kann, die jeweils 3 durch mesenchymale Gewebe umgeben. Wnt - Signalisierung spielt eine Schlüsselrolle in der Spezifikation des Respirationstraktes wie Deletion Wnt2 und Wnt2b durch die splanchnic Mesenchym und Löschung von β-Catenin von der endodermalen respiratorischen Epithels exprimiert wird in Lunge agenesis 4,5 führen. Unsere früheren Studien festgestellt , dass das Löschen von Wls, einer Ladung Rezeptor vermittelnde Sekretion aller Wnt - Liganden, von den endodermaler Atemwege führt zu Lungenhypoplasie, Mängel bei der pulmonalen Gefäßentwicklung und Fehl Strukturierung der trachealen Mesenchyms 6,7. Diese Daten unterstützen die Bedeutung der epithelial-mesenchymalen cross sprechen bei der Zelldifferenzierung und der Beschreibung , wie es auch in anderen Studien 8,9 gezeigt wurde. Die Untersuchung der frühesten Stadien der Lungenentwicklung stützt sich auf genetische, in vitro und ex vivo - Techniken , die uns besser erlaubt haben , Mechanismen zu verstehen , Atem Identität Fahr 16.10. Ganze Lunge Explantatkulturen am Luft Flüssigkeit Interphase wurden in frühen Stadien der Lungenverzweigungs Morphogenese 10,17,18 die Effekte der Wachstumsfaktoren zu untersuchen weithin verwendet. Während dieses Verfahren als Auslesen von morphologischen Veränderungen verwendet wird, wie beispielsweise Verzweigungs Morphogenese und Genexpressionsmodulation, ist es für das Studium der frühen Stadien des Entwicklungsprozesses begrenzt, da die Kultur selbst nicht die Entwicklung der Vaskulatur 17 unterstützt. Entwicklung Trachealknorpels erfordert längere Inkubationszeiten, die nicht mit dieser Kultur-Technik kompatibel sind. Um Analyze die Rolle der Wnt-Signal während der Atemwege Bildung haben wir Standardtechniken angepasst auf die Bedürfnisse unserer embryonalen Studien zu erfüllen. Wir haben Volumina geändert, Färbungszeiten, Bearbeitungs Radfahren für Paraffineinbettung und den Zeitpunkt für die Reinigung der Tracheal-Lungengewebe. Das Hauptziel der Techniken in der vorliegenden Studie beschrieben Optimierung war die frühesten Stadien der trachealen Entwicklung bei Mäusen zu analysieren, die von E11 bis E14,5 stattfinden. Unter Verwendung der Reportermäuse Linie Axin2LacZ wir genau bestimmten Stellen von Wnt / β-Catenin - Aktivität in der Entwicklung von trachealen Mesenchym. Wir haben auch Lektin Färbeverfahren für ganze Berg Luftröhrengewebe angepasst. So konnten wir mesenchymalen Verdichtungen zu visualisieren und zu Websites, vorherzusagen, wo Chondrogenese stattfinden wird. Die Färbung der ganze Berg und Abschnitte von embryonalem Gewebe erhalten von WlsShhCre Mäuse, gepaart mit erweiterten Mikroskopietechniken, erlaubt uns , die Rolle der Wnt - Liganden durch die tra produziert zu enthüllenCheal Epithel in trachealen Musterung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti Sox9 ab.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>1:400 , rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Sox9 ab.</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-20095</td>
			<td>1:50, rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5228</td>
			<td>1:2k, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX2.1 ab.</td>
			<td>Seven Hills</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1:100, guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX2.1 ab.</td>
			<td>Seven Hills</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1:400, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brdu ab.</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB1893</td>
			<td>1:200, sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brdu ab.</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-32323</td>
			<td>1:4k, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 7381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Alexa fluor Molecular probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaDOC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>89905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP4O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher brand super-frost plus</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (16%)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11K413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Component of TSA kit #2&#160;&#160;&#160; ( T20932)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrDu</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-loc cassettes Histoscreen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C-0250-GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy cassettes</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>BC0109</td>
			<td>Available in different colors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red&#160; Kernechtrot 0.1%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4641-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>399000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro knives</td>
			<td>FST</td>
			<td>10318-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 ceramic coated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5CO</td>
			<td>FST</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon i90</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Wide field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NikonA1Rsi</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MS 16 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaging processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying wnt signaling during patterning of conducting airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Wnt / β-Catenin-Aktivität Ganze Berge Lac-Z - Färbung wurde in Tracheal-Lungengewebe von Embryonen aus Reporter Axin2 Lac -Z Mäuse 11 getrennt nachgewiesen werden . Seiten der Färbung zeigen Wnt / β-Catenin-Aktivität. Analyse von Abschnitten ganze Berg Färbung bestimmt, dass Wnt / β-Catenin-Aktivität im Mesenchym der Trachea vorhanden war und in Mesenchym der peripheren Regionen der Entwicklung der Lunge. In WlsShhCre Embryonen (worin Sekretion von Wnt - Liganden aus dem Epithel des Atemtrakts wurde aufgehoben) Lac-Z - Färbung war fast nicht vorhanden (Abbildung 1). Mesenchymale Verdichtungen in trachealen Mesenchyms Ein entscheidender Schritt in Chondrogenese ist der Prozess, durch den mesenchymalen Zellen r zu geben, vom Schicksal bestimmtise kondensieren zu Knorpel. Diese enge Aggregationen von Zellen als mesenchymale Verdichtungen bekannt. Um zu testen, ob der Mangel an in WlsShhCre Mäusen beobachtet Knorpel zu einer Abwesenheit von mesenchymalen Kondensationen, Tracheal Lungengewebe von Schwangerschaftsalter E12.5 bis E14.5 zurückzuführen waren mit PNA-Lektin gefärbt. Bei E13.5 und E14.5, Fluoreszenz wurde an den Standorten als periodische Bands in der trachealen Mesenchyms erkannt, wo Knorpel gebildet werden. Mangel an nachweisbare Fluoreszenz in dem trachealen Gewebe WlsShhCre Embryos zeigt , dass endodermalen Wnt - Signalisierung an das tracheale Mesenchym für mesenchymale Kondensationen erforderlich ist (Abbildung 2). Atemwegszell Spezifikation Whole Mount Immunofluoreszenz von trachealen Lungengewebe bestimmt das Expressionsmuster von Sox9, Nkx2.1 und αSMA bei E11,5. In der Luftröhrengewebe ist Grenze Sox9 Ausdrucked zum Mesenchym der Trachea als kontinuierlicher Streifen (Pfeil in 3A und B) , während in der Entwicklungslungen Sox9 an der Peripherie des respiratorischen Epithels (Pfeilköpfe in 3A, B und C) beobachtet wird. Nkx2.1 stellt einen deutlichen Expressionsmuster auf dem Epithel der Trachea der Lunge beschränkt. Verhindern, dass die Sekretion von Wnt-Liganden aus Epithel verursacht verminderte Expression von Sox9 in trachealen Mesenchyms aber keinen Einfluss auf Sox9 Expression im peripheren Lungenepithels. Expression von αSMA nicht ohne weiteres in trachealen Mesenchym detektiert jedoch Färbung wurde auf der Ebene des Larynx (gelber Pfeil, 3) und des Magens (3) detektiert. Die Zellproliferation bei der Entwicklung von Trachea Proliferation in Epithel und Mesenchymder Trachea wurde nach in vivo - Markierung von Gewebe mit BrdU nachgewiesen. Die Abschnitte der Luftröhrengewebe wurden mit Antikörpern, die BrdU, Sox9 und αSMA gefärbt. Das Proliferationsprofil in der Trachea Mesenchym zeigt an, dass die Konzentrationen von Sox9 gefärbten Zellen-Proliferation unterziehen ist höher als das Niveau der αSMA färbten Zellen unterzogen Proliferation. Dieses Proliferationsmuster scheint in WlsShhCre Tracheen (Abbildung 4) rückgängig gemacht werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53910/53910fig1.jpg" /> Abbildung 1: Wnt / β-Catenin - Aktivität wirksam ist , in trachealen Mesenchyms E13.5 trachealen Lungengewebe, isoliert von Axin2-LacZ und WlsShhCre. Axin2-LacZ Mäuse wurden gefärbt mit X-gal (A und B). Die Abschnitte der trachealen Lungengewebe wurden mit schnell rot (A &#39;, B&#39;) gegengefärbt . Beachten Sie das Fehlen von X-galFärbung in WlsShhCre; Axin2-Lac-Z Mäuse Abwesenheit von Wnt / β-Catenin - Aktivität (B &#39;) zu demonstrieren. E14.5 Gewebe aus Axin2 LacZ - Mäusen gefärbt mit X-gal zeigt Seiten der zukünftigen Knorpelringe (C); jedoch wurde Axin2 Aktivität zur Peripherie (Pfeilspitze) beschränkt der mesenchymalen Kondensationen (Pfeil) (D). Maßstabsbalken A, B und C = 500 &amp; mgr; m; B &#39;, D&#39; und D = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53910/53910fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53910/53910fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53910/53910fig2.jpg" /> Abb . 2: mesenchymale Kondensation in Luftröhrengewebe entwickeln E13.5 Tracheal-Lungen - Explantate wurden mit PNA - Lektin gefärbt. Steuerluftröhrengewebe die Regionen zeigt , waren kondensiert mesenchymalen Zellen dargestellt (Pfeile A </strong&gt;, C). Keine mesenchymalen Kondensationen wurden in WlsShhCre Mäusen (B und Pfeil in D) detektiert. C und D zeigen geringere Vergrößerung von trachealen-Lungengewebe in A und B gezeigt. Maßstabsbalken A und B = 1 mm; C und D = 2 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53910/53910fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53910/53910fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53910/53910fig3.jpg" /> Abbildung 3: Expressionsmuster in prächondrogenen ganze Berg Trachea Nkx2.1 und Sox9 Färbung wurde in E11,5 Explantate nachgewiesen.. Panel A zeigt ein Bild eines Kontrollgewebe, während Feld B einen optischen Abschnitt eines 20 &amp; mgr; m Kontrollgewebe zeigt. Notieren Sie sich den Mangel an mesenchymalen Expression von Sox9 in WlsShhCre Gewebe (Pfeil in C), but Aufrechterhaltung der peripheren Expression von Sox9 (Pfeilspitze in C). αSMA Färbung auf einem niedrigen Niveau in trachealmesenchyme von E11.5 Gewebe nachgewiesen wurde , aber in den Larynx - Bereich (gelbe Pfeilspitze in D und E), Magen (S) und restlichen Herzgewebe (CT) (E) beobachtet. Nkx2.1 ist in Epithel entwickeln Trachea und die Lungen (D, E) ausgedrückt. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53910/53910fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53910/53910fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53910/53910fig4.jpg" /> Abb . 4: Die Zellproliferation Muster in prächondrogenen Mesenchyms Abschnitte E13.5 Embryonen wurden mit anti BrdU, Sox9 und αSMA Antikörper gefärbt. Panels C und D sind höhere Vergrößerungen von A </strong&gt; und B ein . Gepunkteten Linien stellen Grenzen des trachealen Epithels. Hinweis Sox9 gefärbten proliferativen Zellen (Pfeilspitze C) und αSMA gefärbten proliferativen Zellen (Pfeilspitze in D). T = Trachea, E = Speiseröhre. Maßstabsbalken A und B = 50 &amp; mgr; m, C und D = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53910/53910fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53910/53910fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Die Verwendung von Reporter - Mäuse gekoppelt ganze Berg und Abschnitt Färbung, Mikroskopie und in - vivo - Tests erleichtert die Analyse der Mechanismen , die die normale Strukturierung der Atemwege zu Grunde liegen. Hier beschreiben wir, wie diese Techniken zur Analyse der Wnt-Signal während trachealen Entwicklung beigetragen.

Studieren Wnt Signaling Während Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K Aufrufe.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.  Die Verwendung von Reporter - Mäuse gekoppelt ganze Berg und Abschnitt Färbung, Mikroskopie und in - vivo - Tests erleichtert die Analyse der Mechanismen , die die normale Strukturierung der Atemwege zu Grunde liegen. Hier beschreiben wir, wie diese Techniken zur Analyse der Wnt-Signal während trachealen Entwicklung beigetragen. 

Serie: Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Methode der Untersuchung Palatal Fusion mit statischen Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em&gt; In Vivo</em&gt; Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...