Dieser Satz von standardisierten Protokollen kann verwendet werden, um neue Einblicke in den überlegenen Augensulkus (SOS), eine kürzlich entdeckte Struktur des sich entwickelnden Auges, zu bieten. Diese Protokolle ermöglichen es jedem Experimentator auf der ganzen Welt, das SOS während der Entwicklung von Zebrafischaugen klar zu visualisieren. Beginnen Sie, indem Sie heterozygote Wachstumsdifferenzierung Faktor sechs A männlichen und weiblichen Zebrafisch auf getrennten Seiten eines Teilers in einem Tank mit entchlorten Wasser am Abend vor ihrer Paarung.
Am nächsten Morgen entfernen Sie die Trennwand und lassen Sie die Fische für nicht mehr als 30 Minuten züchten. Am Ende der Brutzeit sammeln Sie die Embryonen in Petrischalen mit E3-Medium für ihre Inkubation in einem 28,5-Grad-Inkubator. Nach 20 Stunden nach der Befruchtung den Überstand durch das E3-Medium ersetzen, das 0,004%1-Phenyl-2-thiourea ergänzt, um die Pigmentproduktion zu verhindern, und die Embryonen durch Lichtmikroskopie untersuchen, um zu bestätigen, dass sie sich alle in einem geeigneten Entwicklungsstadium befinden.
Legen Sie die Proben unter ein Sezierendes Mikroskop. Entsorgen Sie alle entwicklungsunreifen Embryonen und verwenden Sie feine Zangen, um die Kränze sanft auseinander zu ziehen. Visualisieren Sie das SOS, das als Einzug oder Linie am dorsalen Rand des Auges erscheinen kann.
Sortieren Sie dann die Embryonen, die SOS-Verschlussverzögerung zeigen, von denen, die dies nicht tun. Um diese Embryonen mit einem Seziermikroskop zu fotografieren, bereiten Sie eine Petrischale mit 1%Agarose in E3-Medium vor und stechen Sie leicht in die Mitte der Agarose, um ein flaches Loch zu schaffen, in das das Eigelb des Embryos gelegt werden kann. Dann legen Sie einen anästhesierten Embryo seitlich auf die Agarose.
Um die Embryonen mit einem zusammengesetzten oder konfokalen Mikroskop abzubilden, übertragen Sie einen Embryo in eine 35-Millimeter-Petrischale, die einen kleinen Bolus aus nicht gegelter 1%niedriger Schmelzpunkt-Agarose enthält, in das E3-Medium und verwenden Sie eine feine Angelschnur, um den Embryo schnell in der seitlichen Position zu positionieren. Wenn die Agarose abgekühlt ist, gießen Sie genügend E3-Medium in die Schale, um die Agarose zu bedecken und verwenden Sie eine 20x Wasser-Immersion objektivLinse, um das SOS zu visualisieren. Ziehen Sie nach der Bildgebung die Agarose vorsichtig aus dem Embryo und fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd oder lassen Sie den Zebrafisch seine Entwicklung fortsetzen.
Um das SOS durch fluoreszierende mRNA-Expression zu visualisieren, verwenden Sie ein Mikroinjektionsgerät, um 300 Piktogramme verbesserter GFP-CAX mRNA in Embryonen im Einzellstadium zu injizieren. Verwenden Sie dann ein fluoreszierendes Stereoskop, um Embryonen mit heller, verbesserter GFP-Expression zu überprüfen und Bilder der Embryonen durch eines der gezeigten bildgebenden Verfahren zu erhalten. Für die immunfluoreszierende Färbung von embryonalen Zebrafischen laminin, dechorinatieren Sie die Embryonen wie nachgewiesen und fixieren Sie die Embryonen in einem Mikrozentrifugenrohr in frisch zubereitetem 4%Paraformaldehyd für zwei Stunden auf einem Raumtemperatur-Shaker.
Am Ende der Fixierung die Embryonen viermal in PBS plus Tween oder PBST waschen, fünf Minuten pro Wäsche, gefolgt von Einer Durchlässigkeit in 10 Mikrogramm pro Milliliter oder Proteinase K bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Waschen Sie die permeabilisierten Embryonen viermal in PBST, wie gezeigt, und blockieren Sie die Embryonen in 5%Ziegenserum und zwei Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin in PBST für ein bis zwei Stunden auf einem Raumtemperatur-Shaker. Am Ende der blockierenden Inkubation die Embryonen in den primären Antilaminin-Antikörper von Interesse bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Shaker inkubieren.
Am nächsten Morgen die Embryonen fünfmal in PBST für 15 Minuten pro Wäsche waschen und das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem lichtgeschützten Shaker mit einem geeigneten Sekundärantikörper kennzeichnen. Am nächsten Morgen die Embryonen viermal in PBST für 15 Minuten pro Wäsche waschen und die Embryonen in eine kleine Petrischale mit frischem PBST legen. Mit feinen Zangen, sanft stören die Dotter und entfernen Sie die Eigelbzellen durch mildes Abkratzen der Dottersäcke.
Übertragen Sie die entyolkierten Embryonen in frisch zubereitetes 30%Glycerin in PBS, stellen Sie sicher, dass die Embryonen auf die Lösung gestellt werden, und übertragen Sie so wenig wie möglich von der vorherigen Lösung und warten Sie, bis die Embryonen auf den Boden des Rohres sinken. Wenn die Embryonen den Boden des Behälters erreicht haben, übertragen Sie sie in sequenzielle 50% und 70%Glycerin in PBS-Lösungen, wie gerade gezeigt. Nachdem die Embryonen auf den Boden des 70%-Glyzerinbehälters gesunken sind, übertragen Sie die Proben auf eine kleine Plastikschale für Sezieren und trennen Sie die Embryonen nach trägen zu den Hinterhirnen.
Mit feinen Sezierwerkzeugen bewegen Sie einen Kopf auf eine Glasrutsche mit so wenig Glyzerin wie möglich und legen Sie vorsichtig einen feinen Minutienstift in die Vorhirnkammer vom Inneren ein, wobei Sie nach unten drücken, um die rechte und linke Kopfhälfte voneinander zu trennen. Wenn der Kopf vollständig auf der Mittellinie verfüllbar ist, montieren Sie jede Seite der Kopflinie nach unten, Augenseite nach oben. Das SOS ist durch das Sezieren des Mikroskops bei 20 bis 23 Stunden nach der Befruchtung und durch Differentialinterferenzkontrast-Bildgebung als dünne Linie im dorsalen Auge zu beobachten, die die Nasen- und Diezeitliche Hälfte der sich entwickelnden Netzhaut trennt.
Darüber hinaus kann ein subtiler Einzug in der dorsalen Grenze des Auges sichtbar sein. Nach der immunfluoreszenten Färbung von Laminin kann die dünne Linie als Kellermembran bestätigt werden. Wenn sich der SOS-Verschluss verzögert, kann seine längere Anwesenheit als ausgeprägte Spalte in der rückenden Seite des Auges unter einem Sezierendes Mikroskop beobachtet werden.
Bei der Beobachtung unter einem zusammengesetzten Mikroskop mit Differentialinterferenzkontrast-Bildgebung ist dieses Merkmal noch stärker ausgeprägt, wenn die Nasen- und Zeitseiten des Auges durch das SOS getrennt sind, das als Linie im dorsalen Auge deutlich sichtbar ist. Durch die 28-stündige Nachdüngung bei Wildtyp-Zebrafischen zeigt die Lamininfärbung deutlich, dass das SOS vollständig geschlossen ist, was dies zur idealen Bühne für die Überwachung von Verzögerungen bei der Schließung von Spalt. Die Injektion von verbesserter GFP-CAX mRNA ermöglicht die Visualisierung der Zellmembranen von lebenden oder festen Embryonen zur Verfolgung von Veränderungen in der Morphologie der Zellen, die zu einem SOS-Verschluss führen.
Die Visualisierung des SOS kann schwierig sein, da es eng und vorübergehend ist. Es ist jedoch zwingend erforderlich, dass Sie bei der Bewertung von Schließungsverzögerungen zu späteren Zeitpunkten eine konsistente Bewertungsmethode beibehalten. Diese Techniken können mit experimentellen Manipulationen kombiniert werden, um genetische Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren, die die richtige SOS-Bildung und -Schließung beeinflussen.
