Nós reconhecemos a assistência de Mike Muntifering e Matt Kofron com imagem confocal e Gail Macke com os procedimentos histológicos. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 para DS).

Os animais foram alojados em condições sem agentes patogénicos. Os ratos foram tratados de acordo com os protocolos aprovados pela CCHMC Institutional Animal Care e Use Committee (Cincinnati, OH EUA). Os ratinhos utilizados ao longo destes estudos foram mantidas num fundo misto. 1. Montagem Total X-galactosidase Coloração <ol><li> Eutanásia fêmea grávida em E11.5 a E14.5, por inalação de CO 2. Coloque animais em CO 2 câmara, carregar a câmara com CO 2. Manter animais em câmara para mínimo de 5 min. Executar método secundário da eutanásia por deslocamento cervical. </li><li> Limpo área abdominal com etanol (EtOH) a 70% e realizar uma laparotomia com uma única incisão na linha média abdominal. Utilize uma tesoura cirúrgica e padrão standard (serrilhadas reta) fórceps. </li><li> Isolar cornos uterinos usando uma pinça e tesouras finas e imediatamente colocar o tecido na placa de Petri contendo refrigerados solução PBS. Manter o tecido em gelo até processopara isolamento de embriões. </li><li> Isolar embriões de cornos uterinos. Dissecar tecido traqueal do pulmão embrionário usando microscópio de dissecação. Utilize uma pinça de ponta fina e uma tesoura para segurar e perfurar o tecido uterino e concepti liberando os embriões. <ol><li> Remover restantes membranas embrionárias. Com a ajuda de lâminas de agulha cortar a cabeça de embriões e menor parte do corpo abaixo do diafragma. Localize fígado como um marco. </li><li> Após o isolamento da região torácica do embrião, prosseguir para remover os lados laterais da parede do corpo, coluna vertebral e coração utilizando lâminas de agulha. Tome cuidado ao remover o coração para evitar ferir o tecido traqueal. Finalmente, cuidadosamente, separar o esôfago da traqueia, puxando o esôfago com a ajuda de lâminas de agulha. Manter o tecido em solução de PBS em gelo. </li></ol></li><li> tecidos lugar em 4 ml parafuso frascos CAP usando vidro ou de transferência de pipetas. Fix tecido pulmonar traqueal em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS durante 30 min. Após a fixação,lavar o tecido com PBS. Ao lavar, preparar uma solução de X-gal coloração (adicionar 5 mM de K 3 Fe (CN) 6, (100 ul de 0,5 H da) 5 mM, K 4 Fe (CN) 6 (100 ul de estoque) mM de MgCl 0,5 m 2 2, ( 20 ul 1 M Stock) 0,01% NaDOC (50 ul de 2% estoque), 0,02% de NP 4 O (100 mL 2% estoque), 1 mg / ml de X-gal (500 ul de 20 mg / ml) e 9,13 ml de água destilada para levar a um volume final de 10 ml). </li><li> Remover qualquer PBS restante e adicione 2 ml de solução de coloração X-gal para o frasco de vidro. Coloque os frascos no tabuleiro no shaker. tecidos mancha de 1 a 2 horas em solução de coloração com X-gal. Incubar o tecido em solução X-gal, durante 4 h para posterior processamento e incorporação. </li><li> Suspender a reacção por tecidos de lavagem em 3% dimetilsulfóxido-PBS. Enxágüe em PBS, 3 vezes durante 5 minutos cada lavagem e armazenar em 70% de etanol. </li><li> Encha placas de Petri com uma solução / PBS 1% de agarose. Permitir agarose para solidificar. Usando pipetas de transferência de vidro, coloque o tecido em co agaroseated placas cheias com solução de PBS. Fotografar as peças inteiras utilizando um microscópio de dissecação. Selecione o filtro apropriado para campo claro. </li><li> Para melhor distinguir locais de amostras do processo de coloração X-gal para inclusão em parafina e corte. Colocar as amostras em cassetes de tela fina. <ol><li> Para processar amostras para inclusão em parafina usar um processador automatizado e criar um ciclo curto da seguinte forma: seis mudanças de álcool: 5 min primeira mudança e 3 min por cada mudança restante. Três mudanças de xileno: 5 min primeira mudança e 3 min próximas duas alterações. Os passos anteriores são realizadas a 30 ° C. Finalmente, execute três mudanças de parafina a 62 ° C: 25 min, 8 min e 5 min. </li></ol></li><li> amostras de orientar para a incorporação com o tecido deitado no fundo da incorporação de barco. Adiciona-se cuidadosamente parafina para encher o barco incorporação. Refrescar imediatamente na placa fria de incorporar estação até que solidifica parafina. Remova o bloco de incorporação barco. Utilizando um micrótomo, gerar 6 uM sexões. seções montar em-slides pré-tratados e slides secas na corrediça conjunto mais quente a 42 ° C por 1 hora. </li><li> Asse desliza durante a noite em estufa a 56 ºC. Colocar as lâminas em racks. Desparafinar desliza com três mudanças de 100% de xileno, 10 min cada. Use coloração pratos cheios com 200 ml de xileno. </li><li> Rehidratar lâminas através de série graduada de EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 1 min por passo) para PBS antes contracoloração com Fast Red nuclear por 10 a 30 seg. Lavar as lâminas com água da torneira de três vezes durante 5 min de cada vez para remover o excesso de Nuclear Fast Red. </li><li> Desidratar slides em uma série EtOH graduada (50%, 70% e 100% EtOH) antes de lavagem em três mudas de xileno (20 mergulhos cada mudança) e tampa deslizando com meios de montagem com base xileno. </li></ol> 2. A lectina Coloração <ol><li> Dissecar tecido pulmonar E13.5 e E14.5 traqueal como descrito nas etapas 1.1 a 1.4. Usando pipetas de transferência de vidro tecido lugar em frascos com tampa de rosca. Fix tecido pulmonar traqueal com 2 ml desolução PFA 2% durante a noite a 4 ° C. Após a fixação, lavar amostras em PBS três vezes, durante 10 min cada lavagem. </li><li> Preparar tampão, geralmente num volume final de 10 ml de solução de bloqueio. Adicionar 0,1 g de BSA (1%) a 8 ml de PBS. Permitir BSA para dissolver. Adicionar 0,2 ml de soro de cabra (2%) de 0,03 ml de Triton X-100 (0,3%). Levar o volume final para 10 ml com PBS. amostras de blocos de 1 h em 0,5 ml de tampão de bloqueio à temperatura ambiente. </li><li> Remover o tampão de bloqueio usando uma pipeta de transferência e substituir com lectina solução composta por 50 mg / mL de lectina, soro de cabra a 10% e PBS. Utilizar 250 ul de solução de lectina por amostra. Incubar durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de cobrir o frasco de vidro contendo tecido com folha de alumínio. Após a incubação com uma solução de lectina, lavar amostras em PBS três vezes durante 10 min. </li><li> explantes lugar em agarose revestidas placas de petri contendo o suficiente PBS para cobrir amostras. Fotografar as peças inteiras utilizando um microscópio de dissecação de fluorescência. Selecione o appropriate filtro para detectar a fluorescência. Lectina de PNA é normalmente acoplada a GFP. </li></ol> 3. Monte Whole Imunofluorescência Coloração e microscopia confocal <ol><li> Isolar tecido pulmonar traqueal, a transferência para 4 ml frascos de vidro com tampa de rosca e corrigir durante a noite em 4% PFA. tecido E11.5 pode ser fixado em 2% PFA. Loja em metanol 100%. As amostras podem ser armazenadas até vários meses à temperatura de -20 ° C. </li><li> Remover o metanol que usa a pipeta de transferência e permeabilizar amostras usando Bleach de Dent (4 partes de metanol, 1 parte de DMSO e 1 parte 30% H 2 O 2) durante 2 horas. Hidrato de tecido numa série graduada de metanol diluído em PBS como se segue: 100% de metanol, 75% de metanol, 50% de metanol, 25% de metanol, 100% de PBS. Incubar 10 min a temperatura ambiente, durante cada passo de hidratação. </li><li> Bloco de tecido em reagente de bloqueio a 0,5% diluído em PBS (ver Materiais para detalhes) durante duas horas à temperatura ambiente com agitação. </li><li> Diluir anticorpo primário em bloquearsolução (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) e incubar as amostras durante a noite a 4 ° C. Lavar as amostras com PBS cinco vezes à temperatura ambiente. Execute cada lavagem durante 1 h. </li><li> Aplicar anticorpo secundário com uma diluição de 1: 500 em solução de bloqueio a 0,5%. Selecionar cuidadosamente anticorpos secundários para evitar a ligação entre os anticorpos secundários. Incubar durante a noite a 4 ° C em ambiente escuro. Lavar as amostras três vezes durante 20 min à temperatura ambiente. Desidratar amostras numa série graduada de metanol diluído em PBS como se segue: 25% de metanol, 50% de metanol de 75% de metanol, 100% de metanol, 10 min cada passo. NOTA: Certifique-se de que as amostras permanecem cobertas com papel alumínio e minimizar a exposição à luz. Os tecidos podem agora ser armazenados a 4 ° C, durante várias semanas até fotografado. </li><li> Amostras de transferência para custom made placas de palco, remover o metanol e clara com aproximadamente 200 ml de solução clara de Murray 19,20 (2 partes de benzoato de benzilo, 1 parte Álcool benzílico) imediatamente befimaging minério. Fotografar usando um microscópio confocal. Processar e analisar imagem usando software de imagem. </li></ol> Proliferação 4. celular <ol><li> Injectar ratinhos E11.5 grávida intra-peritoneal com uma solução de BrdU para uma concentração de 100 ug de BrdU / g de peso corporal. Sacrifício do sexo feminino como descrito na seção 1 do protocolo e isolar embriões em E12.5 ou E13.5. Usando lâminas de faca, cabeças especiais de consumo e menor parte do corpo abaixo cavidade torácica. </li><li> Coloque o tecido torácica em 4 ml parafuso frascos cap e fixar em 1 ml de PFA 4% durante a noite. Lavar as amostras duas vezes com PBS durante 5 min e desidratar as amostras através de uma série de etanol diluído em água destilada até 70% de etanol do seguinte modo: 30%, 50% e 70% de etanol, durante 5 minutos cada passo. <ol><li> Colocar as amostras em cassetes tela de tamanho médio. Processo de tecido para inclusão em parafina utilizando e processador automatizado. Configurar um ciclo da seguinte forma: seis mudanças de álcool para 8 min cada, três mudanças de xileno para 6 min cada, três cHanges de parafina, por 25 min, 9 min e 8 min. </li></ol></li><li> Incorporar em parafina orientar o tecido na posição desejada para gerar 6 uM transversal ou cortes longitudinais, como descrito na secção 1. Colocar secções em lâminas e permitir que o tecido de aderir a deslizar na corrediça conjunto mais quente a 42 ° C durante 1 h. </li><li> Asse lâminas, sobre os seus lados, durante a noite em estufa a 56 ° C. Colocar as lâminas em cabides de plástico. lâminas de-paraffinize por imersão em três mudas de 100% xileno, 10 min por mudança. Use 200 ml de xileno para submergir completamente os slides. Rehidratar lâminas através de série graduada de EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 5 minutos por passo com agitação) para PBS (5 min). </li><li> Executar a recuperação de antigénio utilizando-se 10 mM de tampão de citrato, pH 6. Para preparar 100 ml de tampão de citrato de mistura 18 ml de ácido cítrico 0,1 M mono-hidratado e 82 ml de citrato de sódio 0,1 M. <ol><li> Colocar as amostras em frascos coplin de plástico cheios de solução de recuperação antigênica e microondas para 6,5 ​​min a alta potência. Adicionar discultivada água para jar coplin para compensar-citrato evaporou-tampão e reaquecimento com potência de 40% para 6 min. </li><li> Preencha frasco coplin ao topo com água e aquecer novamente no poder de 40% para 6 min. tempos de microondas pode variar de acordo com microondas utilizado. </li><li> Permitir que as lâminas se arrefecer durante 20 min à temperatura ambiente antes de as lâminas de lavagem em água destilada durante 1 min, seguido de PBS durante 5 min. Após a lavagem com PBS, as lâminas do bloco, durante 2 horas numa solução contendo TBS (2,425 g de base Tris e 8,765 g de NaCl diluído em 1 L de água destilada) a 10% de soro de burro e 1% de BSA de bloqueio. </li></ol></li><li> Adicionar anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio (TBS contendo 10% de soro de burro e 1% de BSA). BrdU (marcador mitose), Nkx2.1 (epitélio das vias respiratórias), Sox9 (células que dão origem a cartilagem) e αSMA (células do músculo liso). Incubar as lâminas durante a noite, a 4 ° C. Use o método de sobreposição para conservar anticorpos. Aplicar 180 mL de anticorpo a uma junta e, em seguida, anexar slide como se a tampa deslizanteping. </li><li> Retire a junta por imersão slides em água destilada. Após a remoção do anel de vedação, lavar o anticorpo primário não ligado através da realização de seis lavagens de 5 min com TBS contendo 0,1% de Tween-20. <ol><li> Incubar as lâminas com anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio a uma diluição de 1: 200, durante 1 h à temperatura ambiente. Selecione anticorpos secundários com cuidado para evitar indesejada de ligação entre eles. Remover anticorpo secundário não ligado através da realização de três de cinco lavagens minutos, com TBS contendo 0,1% de Tween. </li><li> Lavar as lâminas em base de 0,1 M Tris duas vezes durante 5 minutos e, em seguida, 0,05 base de Tris duas vezes por 5 min. As lâminas podem ser deixados na base de 0,05 M Tris, enquanto coversliping usando meios de montagem com ou sem DAPI (1,5 ug / ml). lâminas Armazenar na pasta de slides a 4 ° C e proteger da luz, cobrindo pasta com folha de alumínio. </li></ol></li><li> Visualize coloração e fotografia utilizando um microscópio de fluorescência automatizado. Contagem de células marcadas e células totais por campo fotografadas em20X e 40X para determinar índices de proliferação de células de células totais. </li></ol>

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&quot;Os autores não têm nada para revelar.&quot;

Eventos subjacentes a morfogénese do tracto respiratório não são completamente compreendidos, em particular os processos necessários para a modelação das vias aéreas condutoras. Estudos anteriores têm utilizado técnicas ex vivo, em que explantes em desenvolvimento são cultivadas na interfase ar-líquido ou embebido em matrigel 21,22. Estes estudos têm mostrado como factores de crescimento influenciam o padrão da traqueia desenvolvimento e a formação de cartilagem traqueal. Uma limitaç...

Desenvolvimento das vias respiratórias é iniciada por dia embrionário 9 (E9) com a aparência de células positivas Nkx2.1 no intestino anterior ventral endodérmica 1,2. Separação tubo esofágico-traqueal irá resolver por E11.5 quando os tubos podem ser distinguidos como entidades distintas, cada um rodeado por tecido mesenquimal 3. Sinalização Wnt desempenha um papel chave na especificação do tracto respiratório como supressão de WNT2 e Wnt2b, expressa pelo mesênquima esplânenico e eliminação de β-catenina do epitélio respiratório endodérmica irá resultar em agenesia pulmonar 4,5. Os nossos estudos anteriores determinaram que a eliminação do WLS, um receptor de mediar a secreção de carga de todos os ligandos de Wnt, a partir dos resultados do tracto respiratório em endoderme hipoplasia pulmonar, defeitos no desenvolvimento vascular pulmonar e mis-padronização do mesênquima traqueal 6,7. Estes dados sustentam a importância da cro epitelial-mesenquimalSS falar na diferenciação celular e especificações, como também foi demonstrado em outros estudos 8,9. O estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento do pulmão depende genética, in vitro e técnicas ex vivo que nos permitiram compreender melhor os mecanismos de condução identidade respiratória 10-16. Culturas de explantes de pulmão inteiro na interfase líquido de ar têm sido amplamente utilizados para estudar os efeitos de fatores de crescimento nos estágios iniciais de pulmonar ramificação morfogênese 10,17,18. Enquanto este método é utilizado como leitura de alterações morfológicas, tais como ramificação morfogénese, e modulação da expressão do gene, que se limita ao estudo de fases iniciais do processo de desenvolvimento, como a cultura em si não suporta o desenvolvimento da vasculatura 17. Desenvolvimento da cartilagem traqueal requer tempos de incubação mais longos que podem ser não é compatível com esta técnica de cultura. para analyze o papel da sinalização de Wnt durante a formação do trato respiratório, que se adaptaram técnicas padrão para atender as necessidades de nossos estudos embrionárias. Nós modificamos volumes, tempos de coloração, ciclismo de processamento para inclusão em parafina e tempo para o esclarecimento de tecido traqueal-pulmão. O principal objetivo de otimizar as técnicas descritas no presente estudo foi analisar os primeiros estágios de desenvolvimento traqueal em ratos que ocorrem a partir de E11 a E14.5. Usando os ratos repórter linha Axin2LacZ nós sites de determinada com precisão de atividade / β-catenina Wnt no mesênquima traqueal em desenvolvimento. Nós também se adaptaram procedimento de coloração lectina para o tecido traqueal montagem todo. Assim, fomos capazes de visualizar condensações mesenquimais e prever locais onde chondrogenesis terão lugar. Coloração de toda montagem e seções de tecido embrionário obtidas a partir de ratos WlsShhCre, juntamente com técnicas avançadas de microscopia, permitiu-nos a desvendar o papel de ligantes Wnt produzidos pelo traepitélio traqueal no padrão traqueal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti Sox9 ab.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>1:400 , rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Sox9 ab.</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-20095</td>
			<td>1:50, rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5228</td>
			<td>1:2k, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX2.1 ab.</td>
			<td>Seven Hills</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1:100, guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NKX2.1 ab.</td>
			<td>Seven Hills</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1:400, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brdu ab.</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB1893</td>
			<td>1:200, sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brdu ab.</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-32323</td>
			<td>1:4k, mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 7381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td></td>
			<td>Alexa fluor Molecular probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaDOC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>89905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP4O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher brand super-frost plus</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (16%)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11K413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Component of TSA kit #2&#160;&#160;&#160; ( T20932)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrDu</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-loc cassettes Histoscreen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C-0250-GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy cassettes</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>BC0109</td>
			<td>Available in different colors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red&#160; Kernechtrot 0.1%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4641-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>399000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro knives</td>
			<td>FST</td>
			<td>10318-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 ceramic coated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5CO</td>
			<td>FST</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon i90</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Wide field microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NikonA1Rsi</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MS 16 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Automated fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaging processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying wnt signaling during patterning of conducting airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

atividade / β-catenina Wnt Whole montagem Lac-Z coloração foi detectado no tecido traqueal-pulmão de embriões isolados de repórter Axin2 Lac-Z ratos 11. Sites de coloração indicar atividade / β-catenina Wnt. Análise de secções de toda a coloração de montagem determinado que a actividade / β-catenina Wnt estava presente no mesênquima da traqueia e no mesênquima de regi?...

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

A utilização de ratinhos repórter acoplado ao conjunto de montagem e a secção de coloração, microscopia e ensaios in vivo facilita a análise dos mecanismos subjacentes à padronização normal do tracto respiratório. Aqui descrevemos a forma como estas técnicas contribuiu para a análise de sinalização Wnt durante o desenvolvimento traqueal.

Estudar Wnt Signaling Durante Padronização de conduzir Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K visualizações.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.  A utilização de ratinhos repórter acoplado ao conjunto de montagem e a secção de coloração, microscopia e ensaios in vivo facilita a análise dos mecanismos subjacentes à padronização normal do tracto respiratório. Aqui descrevemos a forma como estas técnicas contribuiu para a análise de sinalização Wnt durante o desenvolvimento traqueal. 

Vídeo: Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Método de Estudar Palatal Fusão usando estático Órgão Cultura

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões Na Vivo Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

Visualização do sulco Superior Ocular durante a embriogênese Danio rerio

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...