The authors do not have any acknowledgements.

Alle beschriebenen Verfahren muss in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch die lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt werden. 1. Herstellung von Dissecting Instrumente und Kultur Medien <ol><li> Vorwäsche alle Instrumente in Präparation mit 3% Wasserstoffperoxid und dann Autoklavieren bei 121 ° C für 20 Minuten verwendet werden. Filter BGJb Medien mit einer Antibiotika und Antimykotika-Lösung unter Verwendung eines 0,22 um Porengroße Filter mit Vakuumsauger in einer Haube. </li></ol> 2. Herstellung der Kultur Ausrüstung <ol><li> Schneiden Sie Polycarbonat-Membranfilter, die den Gaumenorgane in kleine Dreiecke unterstützen wird, Spray mit 70% Alkohol und lassen Sie sie trocknen. Bereiten Sie Mitte-Well Organ Culture Dish (60x15 mm), indem Sie einen sauberen und sterilisiert gleichseitigen dreieckigen Drahtgitter (20 mm) über den Organkulturplatte. Dann füllen Sie das auch mit 1 ml BGAK Medienkulturmedien. ANMERKUNG: Das Medium sollte ausreichen, um die Höhe des Gitters ohne Eintauchen der Gaumen erreichen. Platzieren des Membranfilters, glänzenden Seite nach unten, auf die Oberseite des Gitters (3-4 Membranen pro Raster) .Depending auf das Experiment, kann die Behandlung (Proteine, Antikörper oder Inhibitoren) für die Medien hinzugefügt werden </li></ol> 3. Mouse Embryo Gewinnung und Vorbereitung für die Kultur <ol><li> Zu Wildtyp-Maus-Embryonen erhalten, verwenden zeitlich 13,5 schwangere CD-1-Maus genetischen Hintergrund Belastung. Reinigen Sie das Sezierung Bereich mit 70% Ethanol. Hinweis: andere Mäusestämme verwendet werden. Wir bevorzugen CD-1-Mäusen wegen der größeren Wurfnummer. </li><li> Euthanize schwangeren Mäusen bei E13.5 dpc (Tage nach dem Koitus) mit 5% Isofluran durch Genickbruch folgte zum Tode mit zugelassenen Protokolle zu versichern. </li><li> Spray 70% Ethanol auf der ventralen Bauchoberfläche zu vermeiden, dass die Bauchhaarstock zu den Instrumenten. Öffnen Sie dann die Bauchhöhle ventralmit einem scharf stumpfen Betriebs Schere und Mikro-Pinzette die Gebärmutter zu lokalisieren. Mit den Zangen, heben Sie die gesamte Gebärmutter und trennen sie vom Körper durch Schneiden an der Gebärmutterkörper und an den Spitzen der Uterushörner mit Licht Betriebs Schere. </li><li> Legen Sie die Gebärmutter auf einem sauberen Papiertuch über Eis (Nach dem Protokoll Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren). Decken Sie die Gebärmutter mit einem anderen sauberen Papiertuch, um eine Kontamination zu verhindern. Sterilisieren der Instrumente mit 70% Ethanol Spray vor der weiteren Verwendung. Der Uterus und die Embryonen in das Labor auf Eis transportiert. </li><li> In einem offenen Laminarströmungshaube, sorgfältig machen eine kleine Öffnung im Dottersack mit spitz stumpf Betriebs Schere und Mikro-Pinzette. Stellen Sie die Öffnung breiter und dann drücken Sie sie vorsichtig, um den Embryo aus dem Dottersack exteriorisieren. </li><li> Transfer der Embryonen sofort auf eine Petri-Schale mit kalter Phosphat-gepufferter Saline 1X (PBS), pH 7,4. Um die richtige Bühne, ex versichern,Amin der Embryo unter einem Binokular für den Körper, Kopfgröße und Leben Morphologie. HINWEIS: Embryonen, die nicht im richtigen Entwicklungsstadium befinden, nicht für das Experiment verwendet. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> Abbildung 2 Gliedmaßen Morphologie. Die Vorder- und Hinterschenkel auf den Grad der Gurtband Einbuchtung zwischen den Ziffern geprüft. Bei E13.5 sind alle stelligen Verdichtungen prominent, mit der Gurt und distale Einkerbungen zwischen den Ziffern erscheinen sehr deutlich. Die Hinter Ziffern hinten von einem halben Tag 12 Obere Reihe:. Vorderbein, untere Reihe: Hintergliedmaße. 4. Am Gaumen Dissection <ol><li> Setzen Sie einen Embryo zu einem Zeitpunkt, in einer Petrischale mit PBS unter dem Binokular. Mit Hilfe von kleinen Präparierscheren und Pinzette trennen den Kopf vom Körper der Embryonen. </li><li> Sorgfältig halten Sie die Maus Schädels über Augenhöhe mit einer Pinzette (Vermeidungdie Oberkieferfortsatz) machen zwei Einschnitte auf beiden Seiten der Lippenlinie. Dann entfernen Sie den Unterkiefer und Zunge. Isolieren Sie die Oberkieferfortsatz Region, indem ein Schnitt in Augenhöhe und entfernen Sie das Gehirn, Augen, Nasenscheidewand und der angrenzenden Gewebe. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> Abbildung 3. Am Gaumen Gewebe von 13,5 Embryonen, wenn die Gaumen Regalen erhöht hatte gesammelt, aber nicht Kontakt hergestellt. Die Gaumen Regale wurden in Organkultur auf einem Filter an der Luftmedienschnittstelle 72 h im statischen Modell gelegt. (A) Niveau Dissektion auf E13.5 Embryos. (B) Blaue Sterne abzugrenzen Bereichen, um das Gewebe mit einer Pinzette bei der Präparation zu halten. (C) Blick seziert Gaumen Regalen auf einem Trapezfiltermembran platziert. (D) Seitenansicht der Kulturschale nach der Platzierung der seziert Gaumen und Zugabe von Kulturmedien. <ol start="3"><li> Legen Sie die Gaumen oralen Seite nach oben und entfernen Sie die Nasenscheidewand und das Gewebe um ihn herum, halten die primäre Gaumen befestigt zu orientieren sie von vorne nach hinten zu helfen. Mit einem Löffel Spachtel und sehr sorgfältig übertragen Sie die Gaumen Regalen (Nasenseite nach unten) auf die vorbereiteten Filter auf die Netze in den Kulturschalen. HINWEIS: Stellen Sie die Lautstärke von Medien, um eine ordnungsgemäße Luft-Media-Schnittstelle zu ermöglichen. </li><li> Unter dem Stereomikroskop, sezieren die primäre Gaumen und mit Hilfe einer Pinzette, um die Gaumen Regalen nahe beieinander zu platzieren. Die Gaumen Regale werden nicht schmelzen, wenn sie nicht in Kontakt gebracht. Schneiden Sie die dreieckigen Membranfilter, wo der vordere Teil des Gaumens befindet. Die Trapezform wird bei der Lokalisierung der vordere Teil des Gaumens zu unterstützen. </li><li> Kultur Gaumen Regale einzeln oder mit zwei oder drei in der gleichen Organkulturschale mit BGJb Kulturmedien. </li></ol> 5. Die Kultivierung Maus Palatal Regale <ol><li> Inkubieren Sie die tissues bei 37 ° C in einer befeuchteten Gasgemisch (5% CO 2 und 95% Luft) für 72 Stunden, und ändern Sie das Medium alle 24 Stunden. </li></ol> 6. Am Gaumen Verarbeitung für die histologische Analyse <ol><li> Befestigen Sie die Gaumen nach 72 Stunden in Kultur mit 4% Formaldehyd / phosphatgepufferter Kochsalzlösung O / N bei 4 ° &#160; Dann wurden vorsichtig mit einer Transferpipette waschen das Gewebe in der Kulturschale mit PBS. Wickeln Sie die Gaumen in einem Stück Laborwischtücher und in Einbettkassetten. HINWEIS: Wrapping den Gaumen in Laborwischtücher zu verhindern den Verlust während des Entwässerungsprozesses. </li><li> Dehydratisierung des Gewebes folgenden 70%, 80% und bis zu 100% Ethanol wäscht für 1 h, gefolgt von der regulären Paraffineinbettung Verfahren. Zum Einbetten, platzieren Sie den vorderen Teil des Gaumens mit Blick auf das Tablett. </li><li> Schneiden Sie Serien 6 um Abschnitte in der koronale Orientierung von vorne nach hinten. Eine komplette Abschnitt Gaumen 350-450 Abschnit ergebenons. Färben die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E). 10 Note jedes 20. Abschnitt Verwendung der zuvor beschriebenen Mittlere Fusion Score (MFS) Skala (Tabelle 1). 8 </li></ol>

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</ol>

The authors do not have any competing financial interests.

Das Protokoll in diesem Artikel stellt ein Verfahren zum Präparieren Gaumen Regalen von Embryonen im embryonalen Tag 13,5. Palatinalen Regalen aus Mausembryonen wurden in einem Serum-freien Kulturmedien in einer Atmosphäre von 95% O 2 5% CO 2 bei 37 ° C. Erfolgreiche palatinalen Dissektion ist kritisch abhängig von mehreren Faktoren in jedem Schritt während des Verfahrens aus dem embryonalen Zeit der Mäuse euthanasiert zu der Beendigung der Kultur. Einer der wichtigsten Faktoren für Gaumenfusion ist die Zeit, um die Organkultur zu starten; Embryonen müssen auf Embryonaltag 13,5 als die sekundären Gaumen Regalen horizontal sind, aber noch nicht begonnen haben, um (1) zu fixieren. Ein weiterer kritischer Punkt während des Verfahrens ist die Entäußerung von Embryonen aus dem Dottersack. Dieser Schritt erfordert große Sorgfalt, um Schäden an den Gesichtsstrukturen zu verhindern. Sobald sich der Embryo aus dem Sack entfernt ist, wird der Kopf entnommender Körper und die in einer Petrischale gegeben, mit einem Stereomikroskop mit LWL Beleuchtung von beiden Seiten betrachtet werden. Der Unterkiefer und die Zunge entfernt werden, indem die Gaumen. Das Gehirn und das Restgewebe sind auf Augenhöhe entfernt. An diesem Punkt ist es wichtig, die Epithelschicht in den Regalen zu betrachten. Ist es notwendig, das Gewebe vorsichtig manipulieren, um die Integrität der Zellen zu halten. Epithelzellen sind für die Einhaltung und die Bildung der MES verantwortlich. Jedes seziert Gaumen eingeschaltet oralen Seite nach unten, um jede Knorpel aus der Nasenscheidewand zu reinigen. Dieses Gewebe ist auf der vorderen Seite des Gaumens und erscheint weißer und kondensierte. Palatinalen Regalen frei von unerwünschten Gewebes werden in eine Kulturschale entfernt und auf die Oberseite der Filtermembran angebracht. Die Position der Regale wird wiederum unter dem Stereomikroskop geprüft Sezieren. Sie müssen zusammen geschoben werden, um die Einhaltung und weiter Gaumen Fusion zu ermöglichen.

Gesichtsspalten sind die vorherrschenden kraniofaziale Missbildungen. Auch bei Berücksichtigung aller möglichen kraniofazialen Defekten, dies sind die zweithäufigste Geburt Anomalien bei Neugeborenen 2. Gaumenspalten bei ungefähr 1 in jeden 700 Geburten in den Vereinigten Staaten (US) jedes Jahr auftreten, ist die Inzidenz von Gaumenspalte gleich 475 Kinder mit Gaumenspalten pro Monat oder 15 Kinder mit Spalten pro Tag 3 geboren. Etwa 1% der Kinder geboren auf der ganzen Welt jedes Jahr weisen irgendeine Form von kraniofazialen Dysmorphien. Klüften des Gaumens und der Lippen brauchen einen sehr teuren und komplizierten Verfahren mit lebenslangen Folgen für die Patienten, die diese Anomalie haben. Die geschätzten Kosten für jeden Patienten mit oralen Spalt beträgt ca. 100.000 $ 4. Die Behandlung eines Patienten mit Lippen- und Gaumenspalte erfordert ein Team von Ärzten einschließlich Schädelchirurgen, HNO-Ärzte, Genetiker, Anästhesisten,Logopäden, Ernährungswissenschaftler, Kieferorthopäden, Zahntechniker, Psychologen, Neurochirurgen und Augenärzten. In palatogenesis, stellt sich die sekundären Gaumen gepaart Auswüchse, die ursprünglich vertikal wachsen und unterziehen Gaumenregal Höhe über den Zungenrücken. Nach der Erhebung, wachsen die paarigen Gaumen Regalen in Richtung der Mittellinie (bei E14.5 -E15 bei Mäusen und Woche 9 bei Menschen). Der mediale Rand Epithel (MEE), die die Lagerspitze deckt haftet Bildung der Mittellinie epithelialen Naht. Dies wird durch epitheliale zu mesenchymale Transition und / oder Apoptose gefolgt, um mesenchymale Fluss zu ermöglichen. Haftung der gegenüberliegenden MEE ist ein wesentliches Ereignis, dessen Veränderung bewirkt, Gaumenspalte. Allerdings untersucht nur wenige Studien, die Anfangshaftung der Gaumen Regalen 5. Die harten Gaumen Formen durch Differenzierung von mesenchymalen Zellen in Osteoblasten. Die abnorme Entwicklung des Gaumens können Schlüssel zu erzeugent Gaumen mit oder ohne Beteiligung der Lippe. Gaumen Organkulturtechniken hatte weithin für viele Labors in den letzten 30 Jahren 6,7 verwendet. In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail ein Verfahren zur Gaumen Dissektion und statischer Organkultur. Der Vorteil eines bewegungsOrganKultur ist, dass es Gaumen Regalen zu verschmelzen. Diese Technik war erfolgreich in unserem Labor für viele Fusion und Signalisierung Experimenten 8,9 verwendet. Aber der Schutzumfang der Technik ist beträchtlich und kann verwendet werden, wann immer statische Organkultursystem erforderlich ist, einschließlich der Bewertung der Reaktionen auf exogene chemische Mittel sein, die Auswirkungen regulatorischer Wachstumsfaktoren in verschiedenen Bahnen und bestimmten Proteinen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Abbildung 1. Maus Palatogenesis. Entwicklungsstadien der Mäuse Gaumen. (BF) Scanning elecTRON Mikroskopische Aufnahmen (SEM) der Sekundär Gaumen an repräsentativen Entwicklungszeiten. Rote Pfeile: zeigen den Anfangsteil der Gaumen Adhäsion und Fusion. Gelbe Pfeile: Punkt, um den Raum zwischen den primären und sekundären Gaumen, die nach der Fusion verschwinden (nachgedruckt von Kaufman 11 mit Genehmigung von PLoS ONE).

<table><tbody><tr><td>BGJ&lt;sub&gt;b&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100X</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>100 x15 mm</td></tr><tr><td>Center-well organ culture dish</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>#353037</td><td>60 x15 mm</td></tr><tr><td>Wire triangular grid</td><td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate filter</td><td>GE&amp;amp; Water and Process Technologies</td><td>K04BP04700</td><td>Black 0.4 micron, 47 mm</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>ZEISS&amp;nbsp; Stemi SR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture hood</td><td>NUAIRE Laminar Flow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting forceps</td><td>Dumont Medical&amp;nbsp;</td><td></td><td>#5</td></tr><tr><td>Microdissecting scissors</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS14003-G</td><td>Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made</td></tr><tr><td>Microdissecting scissors</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS500086</td><td>Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades</td></tr><tr><td>Microdissecting scissors</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS14127-G</td><td>Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made</td></tr><tr><td>Surgical currete (spoon spatula)</td><td>Hu-friedy</td><td></td><td>CM 2/4</td></tr><tr><td>Protector laboratory hood</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Farma</td></tr><tr><td>Series11 water Jacket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010-023&amp;nbsp;</td><td>1X</td></tr><tr><td>Fiber optic Light source</td><td>Fiber-light&amp;nbsp; Dolan-Jenner</td><td>PL-750</td><td></td></tr><tr><td>Embedding cassette&amp;nbsp;</td><td>Statlab</td><td>EC301</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>VWR</td><td>470173-504</td><td></td></tr></tbody></table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

Lippen- und Gaumenspalte gehören zu den am häufigsten von allen Geburtsfehler. Die sekundären Gaumen Formen aus mesenchymalen Regale mit Epithel bedeckt, die die Mittellinie epithelialen Naht haftet (MES). Die Theorien besagen, dass MES-Zellen folgen eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT), Apoptose und Migration, so dass ein fusioniertes Gaumen 1. Vollständigen Zerfall der MES ist die letzte wesentliche Phase der Gaumenzusammenfluss mit umliegenden mesenchymalen Zellen. Wir stellen ein Verfahren zum Gaumen Organkultur. Die in vitro-Protokoll entwickelt, ermöglicht die Erforschung der biologischen und molekularen Prozesse bei der Fusion. Die Anwendungen dieser Technik sind zahlreich, darunter Auswertung der Antworten auf exogene chemische Mittel, die Auswirkungen der regulatorischen und Wachstumsfaktoren und spezifische Proteine. Palatinalen Organkultur hat eine Reihe von Vorteilen, einschließlich Manipulation in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung, die nicht mit in vivo-Studien ist möglich.

Die Technik kann auf verschiedene Arten von experiments.The folgende Studie angewendet werden sollte die teratogene Wirkung von Nikotin in vitro an palatinalen Fusion zu testen. Zwei Mäusestämme wurden für dieses Experiment verwendet wurde CD1 und C57.Palatal Gewebes mit 0,06 und 6 mM Konzentrationen von Nikotin Hemisulfat behandelt. Es wurde beobachtet, dass palatalen Fusions Muster und Zeitpunkt wurden in den zwei unterschiedlichen Stämmen unterschiedlich. In CD1-Mäusen, Gaumen Regalen aus der Kontrollgruppe setzte Fusion in der Zeit abhängige Weise. Jedoch in der behandelten Gruppe verzögert Nikotin Fusions insbesondere bei 6 mM Nikotinkonzentration (4A). Histologie Abschnitte CD1 Maus Gaumen zeigten vollkommene Verschmelzung nach 72 h in den Kontrollproben. Bei niedrigeren Dosen von Nikotin haften die Gaumen Regalen, aber die Epithelzellen nach 3 Tagen in Kultur zu bleiben. Gaumen Regalen bei hohen Dosen von Nikotin inkubiert nicht Kontaktierung nach 72 h Inkubation. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; In C57-Mäusen, Gaumen Regalen aus der Kontrollgruppe setzte Fusion in der Zeit abhängige Weise. Allerdings Gaumen Regalen der C57 Mäuse zeigten höhere Punktzahl bei 6 mM Konzentration, wenn die Proben wurden für 48 Stunden im Vergleich zu den Proben bei 0,6 mM Konzentration von Nikotin für den gleichen Zeitraum (4B) inkubiert. Histologie Abschnitte C57 Mäusen Gaumen zeigten, dass in den Behandlungsgruppen eine kontinuierliche epithelialen Naht beharrte auf der Mittellinie. Fusion wurde nur in der Kontrollgruppe bei 72 Stunden beobachtet. Wir beobachteten, dass Gaumen Fusion in beiden Arten von Mäusen wurde durch hohe Dosen von Nikotin beeinflusst. Allerdings waren Gaumen von C57 sinnvoller, Nikotin. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass der genetische Hintergrund der Mäuse beeinflusst Nikotin Antworten in Gaumengewebe. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig4.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 4. Zwei Stämme von Maus Gaumen in Gegenwart von Nikotin kultiviert für 24, 48 oder 72 Std. Die Mäusestämme reagierten auf die Nikotin in unterschiedlichem Ausmaß. Alle Gaumen der hohen Dosis von Nikotin (6 mM) ausgesetzt versäumt, zu verschmelzen und hatte geringe mittlere Verschmelzungsschwelle (MFS) .Hinweis, dass bei 24 Stunden, keine der Gaumen war geschlossen und der MFS reichte von 1 (Gaumen Regalen nicht berühren) bis 3 (Teilfusion) in allen Gruppen. Von 48 Stunden, sind viele der Steuer Gaumen hatte teilweise verschmolzen (Werte über 3) und um 72 h wurden die CD1 Gaumen komplett verschmolzen (Note 5), aber die C57 steuert nicht vollständig verschmolzen (3,67). (Unveröffentlichte Daten von Maria Serrano und Dr. Kathy Svoboda). <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ergebnis </td><td> Kriterien </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Nicht-Fusions ohne Adhäsion. </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Non-Fusion mit einer gewissen Scheinhaftung. </td></tr><tr><td> 3 </td><td>Haftung mit einigen Zerfall der MEE Schichten und klaren Teil mesenchymalen Fluss. </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Vollständige Verschmelzung mit einigen Spuren der MEE Zellen oder verbleibende Naht. </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Vollständige Fusion ohne Anzeichen von MEE-Zellen oder eine Naht sichtbar. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Durchschnittliche Fusion Score (MFS) Skala (Kang und Svoboda, 2002). Berechnen Sie die Werte für jeden Gaumen für den vorderen (§§ 1 bis 150), Mitte (§§ 150-300) und posterioren (§§ 300-450). 8

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Studium der Gaumen Entwicklung werden durch das Auftreten von Gaumenspalte, einem Geburtsfehler, die eine enorme gesundheitliche Belastung auferlegt und hinterlassen bleibende Entstellung motiviert. Wir zeigen hier eine Technik zur Kultur palatinalen Regalen, die verwendet werden können, um verschiedene Signalwege in palatinalen Entwicklung und Fusion studieren.

Methode der Untersuchung Palatal Fusion mit statischen Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K Aufrufe.  Texas A&M University Baylor College of Dentistry.  Studium der Gaumen Entwicklung werden durch das Auftreten von Gaumenspalte, einem Geburtsfehler, die eine enorme gesundheitliche Belastung auferlegt und hinterlassen bleibende Entstellung motiviert. Wir zeigen hier eine Technik zur Kultur palatinalen Regalen, die verwendet werden können, um verschiedene Signalwege in palatinalen Entwicklung und Fusion studieren. 

Serie: Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

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Forschung

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Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of them being fluorescence in situ hybridization (FISH).1,2 We performed a pilot study in which oral biofilm samples collected from fixed orthodontic appliances (palatal expanders) were stained by FISH, the objective being to assess the three-dimensional organization of natural biofilm and plaque accumulation.3,4 FISH creates an opportunity to stain cells in their native biofilm environment by the use of fluorescently labeled 16S rRNA-targeting probes.4-7,19 Compared to alternative techniques like immunofluorescent labeling, this is an inexpensive, precise and straightforward labeling technique to investigate different bacterial groups in mixed biofilm consortia.18,20 General probes were used that bind to Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; hereafter EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; hereafter LGCmix),9,10 and Bacteroidetes (Bac303).11 In addition, specific probes binding to Streptococcus mutans (MUT590)12,13 and Porphyromonas gingivalis (POGI)13,14 were used. The extreme hardness of the surface materials involved (stainless steel and acrylic resin) compelled us to find new ways of preparing the biofilm. As these surface materials could not be readily cut with a cryotome, various sampling methods were explored to obtain intact oral biofilm. The most workable of these approaches is presented in this communication. Small flakes of the biofilm-carrying acrylic resin were scraped off with a sterile scalpel, taking care not to damage the biofilm structure. Forceps were used to collect biofilm from the steel surfaces. Once collected, the samples were fixed and placed directly on polysine coated glass slides. FISH was performed directly on these slides with the probes mentioned above. Various FISH protocols were combined and modified to create a new protocol that was easy to handle.5,10,14,15 Subsequently the samples were analyzed by confocal laser scanning microscopy. Well-known configurations3,4,16,17 could be visualized, including mushroom-style formations and clusters of coccoid bacteria pervaded by channels. In addition, the bacterial composition of these typical biofilm structures were analyzed and 2D and 3D images created.

We present a protocol for structural and compositional analysis of natural oral biofilm from orthodontic appliances with in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Oral biofilm samples were collected from palatal expanders, scraping acrylic-resin flakes off their surface and referring them for molecular processing.

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Medizin

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple stimuli and complex chemical molecules contained in foods. In human, individual fungiform papillae contain from zero to as many as 20 taste buds. There is no established protocol for culturing human taste cells, although the ability to maintain taste papillae cells in culture for multiple cell cycles would be of considerable utility for characterizing the molecular, regenerative, and functional properties of these unique sensory cells. Earlier studies of taste cells have been done using freshly isolated cells in primary culture, explant cultures from rodents, or semi-intact taste buds in tissue slices1,2,3,4. Although each of these preparations has advantages, the development of long-term cultures would have provided significant benefits, particularly for studies of taste cell proliferation and differentiation. Several groups, including ours, have been interested in the development and establishment of taste cell culture models. Most attempts to culture taste cells have reported limited viability, with cells typically not lasting beyond 3-5 d5,6,7,8. We recently reported on a successful method for the extended culture of rodent taste cells9. We here report for the first time the establishment of an in vitro culture system for isolated human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability. Cells displayed many molecular and physiological features characteristic of mature taste cells. Gustducin and phospholipase C &beta;2, (PLC-&beta;2) mRNA were detected in many cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and confirmed by sequencing. Immunocytochemistry analysis demonstrated the presence of gustducin and PLC-&beta;2 expression in cultured taste cells. Cultured human fungiform cells also exhibited increases in intracellular calcium in response to appropriate concentrations of several taste stimuli indicating that taste receptors and at least some of the signalling pathways were present. These results sufficient indicate that taste cells from adult humans can be generated and maintained for at least eight passages. Many of the cells retain physiological and biochemical characteristics of acutely isolated cells from the adult taste epithelium to support their use as a model taste system. This system will enable further studies of the processes involved in proliferation, differentiation and function of mammalian taste receptor cells in an in vitro preparation.
Human fungiform taste papillae used for establishing human fungiform cell culture were donated for research following proper informed consent under research protocols that were reviewed and approved by the IRB committee. The protocol (#0934) was approved by Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Written protocol below is based on published parameters reported by Ozdener et al. 201110.

We aimed to develop a reproducible protocol for isolating and maintaining long-term cultures of human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability.

Isolierung und Kultivierung humaner Zellen pilzförmige Papillen Geschmack

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Neurowissenschaften

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Biologie

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and fusion above the tongue. Defects in this process lead to cleft palate, a common birth defect. Recent studies have shown that palatal shelf elevation involves a remodeling process that transforms the orientation of the shelf from a vertical to a horizontal one. The role of the palatal shelf mesenchymal cells in this dynamic remodeling has been difficult to study. Time-lapse-imaging-based quantitative analysis has been recently used to show that primary mouse embryonic palatal mesenchymal (MEPM) cells can self-organize into a collective movement. Quantitative analyses could identify differences in mutant MEPM cells from a mouse model with palate elevation defects. This paper describes methods to isolate and culture MEPM cells from E13.5 embryos-specifically for time-lapse imaging-and to determine various cellular attributes of collective movement, including measures for stream formation, shape alignment, and persistence of direction. It posits that MEPM cells can serve as a proxy model for studying the role of palatal shelf mesenchyme during the dynamic process of elevation. These quantitative methods will allow investigators in the craniofacial field to assess and compare collective movement attributes in control and mutant cells, which will augment the understanding of mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation. Furthermore, MEPM cells provide a rare mesenchymal cell model for investigation of collective cell movement in general.

We present a protocol for isolation and culture of primary mouse embryonic palatal mesenchymal cells for time-lapse imaging of two-dimensional (2D) growth and wound-repair assays. We also provide the methodology for analysis of the time-lapse imaging data to determine cell-stream formation and directional motility.

Isolierung und Zeitraffer-Bildgebung von primären embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus zur Analyse kollektiver Bewegungsattribute

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The continuously growing mouse incisor provides an excellent model to study tissue-specific stem cells. The epithelial tissue-specific stem cells of the incisor are located at the proximal end of the tooth in a niche called the cervical loop. They provide a continuous influx of cells to counterbalance the constant abrasion of the self-sharpening tip of the tooth. Presented here is a detailed protocol for the isolation and culture of the proximal end of the mouse incisor that houses stem cells and their niche. This is a modified Trowell-type organ culture protocol that enables in vitro culture of tissue pieces (explants), as well as the thick tissue slices at the liquid/air interface on a filter supported by a metal grid. The organ culture protocol described here enables tissue manipulations not feasible in vivo, and when combined with the use of a fluorescent reporter(s), it provides a platform for the identification and tracking of discrete cell populations in live tissues over time, including stem cells. Various regulatory molecules and pharmacological compounds can be tested in this system for their effect on stem cells and their niches. This ultimately provides a valuable tool to study stem cell regulation and maintenance.

The Trowell-type organ culture method has been used to unravel complex signaling networks that govern tooth development and, more recently, for studying regulation involved in stem cells of the continuously growing mouse incisor. Fluorescent-reporter animal models and live-imaging methods facilitate in-depth analyses of dental stem cells and their specific niche microenvironment.

Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

Färbung, Visualisierung und Analyse von Fungiform-, Circumvallate- und Gaumengeschmacksknospen

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

Kultur und Bildgebung von humanen nasalen Epithelorganoiden

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...