Diese Arbeit wurde von der Ovarian Cancer Research Fund unterstützt [gewähren LT/UIC/01.2011], die UIC Center for Clinical and Translational Science, der UIC Cancer Center, und die National Institutes of Health gewähren C06RR15482. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch AAALAC im Rahmen genehmigter Tierpflege Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss auf UIC-Set erfolgen. Tiere für dieses Projekt sind in Barriere Zimmer in den biologischen Ressourcen Laboratory (BRL) an der University of Illinois at Chicago untergebracht. Die BRL verfügt über eine voll tierärztliche Personal, dass die Tiere überwacht mindestens zweimal täglich und berät bei der Tierpflege.

1. Eierstockkrebs Dissektion und Gewebe isoliert <ol><li> Bereiten Sie eine 0,5% (w / v) Lösung von Natriumalginat, aus einer modifizierten Version des Protokolls vorzubereiten zuvor beschrieben 5, mit sterilem PBS und Hitze bis 37 ° C. Mix durch Umdrehen oder rockig, aber nicht vortexen. Zeichnen Sie das Alginat in eine 1 ml Spritze mit einer 25 G Nadel und halten bei 37 ° C. </li><li> Bereiten 10mM sterile CaCl 2-Lösung für die Vernetzung der Alginat auf Gewebe Verkapselung und warm bis 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie 1ml Kulturmedium (αMEM + 5 Einheiten Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin) pro Well in einer 24-Well-Platte für jedes Experiment. Include verschiedenen Wirkstoffen, Peptiden, oder Viren in das Kulturmedium. Für die Transfektion vor Organ-Verkapselung, inkubieren Gewebe mit Lipofectamine 2000 und Plasmid-DNA für 4 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Präparieren Sie die Organe des Tieres, entfernen Sie alle Fett-oder Restgewebe, ziehen Sie die Bursa Membran umgibt den Eierstöcken, und schneiden Sie den Eierstock oder Eileiter in vier Teile durch Halbierung der Orgel. Die Tiere wurden durch CO 2-Erstickung durch Genickbruch folgte eingeschläfert. Für den Eileiter, sanft abrollen das Gewebe durch Auseinanderziehen der Verbindung Membranen und zur Verlängerung der Enden der Röhre in entgegengesetzter Richtung mit einer Pinzette vor dem Schneiden. </li><li> Legen Sie eine einzelne Alginat Tröpfchen (~ 1-3 ul) auf eine sterilisierte Mesh-Faser. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette bewegen ein Stück Orgel in die Alginat-Tröpfchen und in der Mitte des Tropfens mit einer Pinzette oder einer sterilen Nadel. </li><li> Kehren Sie die Tröpfchen mit dem Orgelstück (organoide) durch Ergreifen des Mesh-Faser mit einer sterilen Pinzette und drehen sie auf den Kopf, damit die Schwerkraft auf das Alginat in einen hängenden Tropfen Kraft. </li><li> Tippen Sie auf der Zange am Rande einer 10cm Petrischale mit 10 mM CaCl 2-Lösung, so dass die Tropfen fällt in Lösung. </li><li> Inkubieren für 2 Minuten, mit einer sterilen Löffel, die Poren zu zusätzlichen 10 mM CaCl 2, und Transfer in das Kulturmedium Version entfernen. Bis zu vier Alginatgele können in einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Platte mit dem Kulturmedium übertragen werden. Kultur für einen definierten Zeitraum. </li></ol> 2. Der Abbau von Alginat und Ansammlung von Zellen <ol><li> Für die Solubilisierung der Alginatgel, inkubieren Sie die Kulturen in Alginat-Lyase (3,4 mg / ml) in Leibovitz L-15 bei 37 ° C gelöst für 30 Minuten oder bis Gel vollständig gelöst ist. </li><li> Entfernen Sie das Gewebe aus der Alginat-Lyase. </li><li> Für Sammlung der OSE, inkubieren die organoiden mit 500 Einheiten Kollagenase in Leibovitz-15 L Medium für 1 Stunde 8. Vortex in 2 Sekunden Impulse (2 Sekunden vortexen und 2 Sekunden Pause) mit einer mittleren Leistung für 1 Minute, um 1 Sekunde Pulse (1 Sekunde Wirbel und 1 Sekunde Pause) für 1 Minute. Lassen Orgelstücke fallen nach unten Mikrozentrifugenröhrchen und Pipette Überstand in frische sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Centrifuge 3 Minuten bei 3000 rpm für Pellet Eierstock Oberflächenepithel. </li><li> Zum Sammeln der Eileiter Epithel, die Leitung der Länge und Platz auf Gewebekulturen aus Kunststoff in DMEM mit 5 Einheiten Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin und 4% (v / v) FBS. Im Laufe von 3-5 Tagen, werden die Zellen &quot;Crawling&quot; aus dem Eileiter Stroma und wachsen auf Gewebekulturen plastic9. </li></ol> 3. Fixation von Alginat verkapselten Organkulturen für Paraffinschnitte <ol><li> Sammeln Sie die Alginat verkapselten Kügelchen aus dem Kulturmedium an ausgewählten Zeitpunkt. </li><li> Recrosslink das Alginat, das Gel durch Verzicht auf die Kultur in sterile 10 mM CaCl 2-Lösung für zwei Minuten zu versteifen. </li><li> Fix das Alginat verkapselten Orgel in 2% Paraformaldehyd mit 50 mM Saccharose, 10 mM CaCl 2 und 50 mM Natriumcacodylat um sicherzustellen, dass das Gel fest bleibt und vollständig kapselt Gewebe während der Fixierung. </li><li> Nach Gewebe Verarbeitung, betten die gesamte Alginat verkapselten Organkultur Stück in Paraffin und Abschnitt mit einem Mikrotom bis 5 um Abschnitte zu erzeugen. </li><li> Das Alginat wird aufgelöst und entfernt die Folie, wenn die Durchführung der Immunhistochemie durch basieren Antigen-Retrieval Wärme. Das Alginat wird bleiben und Flecken für Eosin unter stehenden Hämatoxylin und Eosin Färbung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für eine dreidimensionale Organkultur des Eierstocks und Eileiters ist in Abbildung 1 dargestellt. Eierstöcke können in verschiedene Stücke geschnitten werden, und OSE wuchern und migrieren an die Oberfläche, die aus dem Schnitt mit dem Skalpell verletzt wurde repariert. Während dieses Prozesses ist die richtige Ausrichtung der OSE in Bezug auf das darunter liegende Stroma gepflegt, mit der OSE Kapselung der Eierstock. Wie in Abbildung 2 gezeigt, kapseln die OSE von Ovarien in zwei Hälften geschnitten Eierstock mehr vollständig zu Eierstöcke in Viertel oder Achtel schneiden im Vergleich. Die Wundheilung der ovariellenFläche kann im Rahmen des gesamten Ovars untersucht werden und kann Licht auf, wie Eisprung und Oberfläche Reparatur induziert Eierstock-Transformation zu vergießen. Der Endpunkt des Experiments hängt von den Informationen, die erforderlich ist. Tissue-Architektur, zelluläre Morphologie und spezifische zelluläre Wachstumsraten sind leicht überwacht mit Paraffinschnitten. Zum Beispiel ist eine einzelne Schicht von Eierstock Oberflächenepithel nach Kultivierung in serumfreiem αMEM für 7 Tage (Abbildung 3A) beobachtet, während Zusatz von 5 mg / ml Insulin für 7 Tage induziert Hyperproliferation der ovariellen Oberflächenepithel und die Bildung von mehreren Schichten Zellen (Abbildung 3B). Durch die Zugabe von Bromdesoxyuridin zu den Kulturen in einer Endkonzentration von 10 uM 24 Stunden vor der Fixierung kann die Proliferation von Zellen gemessen (siehe Einschub 3A und 3B) werden. Für Kulturen in serum-freien αMEM erhalten, durchlaufen etwa 3-5% der OSE Proliferation während der 24-Stunden-Kennzeichnung Zeitraum (kleines Bild 3A), während ein größerer Prozentsatz der Granulosazellen vermehren. Die Zugabe von Insulin zu den Kulturmedien steigt der Anteil der proliferierenden OSE auf ca. 30% der gesamten OSE (kleines Bild 3B). Immunfluoreszenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) visualisiert werden kann durch die Alginatgel mit Standard-Mikroskopie folgende cDNA-Transfektion (Abbildung 3C). Während Alginat Organkultur bietet für Wachstum und Analyse der ovariellen Oberflächenepithel und Primärfollikel, darauf hinzuweisen, dass die reifen, sekundäre Follikel in dieser Kultur (Abbildung 3D) überleben scheitern. Kultur der einzelnen Follikel zur Reife in einem Alginat Hydrogelmatrix wurde an anderer Stelle 10 beschrieben. Änderungen im Protein-oder RNA kann aus dem gesamten Organ oder von bestimmten Zelltypen mit enzymatischen Abbau (Abb. 4) analysiert werden. Die Behandlung von kultivierten Eierstock Organoide mit Collagenase verlässt das darunter liegende Stroma intakt (Abb. 4C) und ermöglicht für die Anreicherung von OSE in der Zelle erhaltene Pellet nach der Behandlung, obwohl einige Stromazellen auch isoliert sind (Abbildung 4D). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig1.jpg" /> Abbildung 1. Maus Eierstock dreidimensionale Kultursystem zur OSE nach der Verwundung zu propagieren. A) Unter dem Mikroskop wurden die Bursa und die umliegenden Fettpolster entfernt. B) Intact Ovar (O) mit Eileiter Rohr (T) und Fettpolster (F). C) Ovar mit Bursa und Fettpolster entfernt (links) und abgewickelt Eileiter (rechts). D) Eierstock-oder Eileiter Organoide wurden in einem Alginat Tropfen gelegt. E) Alginat umhüllt Organoide wurden in eine CaCl 2-Lösung Vernetzung der Alginat zu einem Gel gesunken. F) Alginat Eierstock organoide gekapselt. G) Alginat Eileiter organoide gekapselt. H) Alginat verkapselten Organoide in Kulturmedium inkubiert. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig2.jpg" /> Abbildung 2. Fläche von Eierstock-Oberfläche von Cytokeratin 8 gemessen regeneriert. Verkapselung von Eierstock-Organoide von der OSE, nachdem sie in Achtel, Viertel und Hälften, kultiviert in BSA Medium, gemessen und durch immunhistochemische Analyse mit Cytokeratin 8 (CK8) Antikörper geschnitten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig3.jpg" /> Abbildung 3. Alginat Kultur ermöglicht Durchgang von Wachstumsfaktoren und Transfektion von cDNA in die OSE, aber nicht unterstützt schnelles Wachstum und Reifung der Follikel. A) Ovarian organoide für 7 Tage in Basalmedium für CK8 Ausdruck, welche die OSE Marken analysiert kultiviert. Inset, Serials Abschnitt für BrdU-Einbau gefärbt. B) Die Zugabe von Insulin zu den Kulturmedien induziert Hyperplasie der OSE. Inset, Serials Abschnitt für BrdU-Einbau gefärbt. C) Ovarian organoide mit cDNA für GFP exprimieren, transfiziert. D) Alginat Kultur-System unterstützt Wachstum der Primordialfollikel (rote Pfeilspitze), aber noch nicht ausgereift Sekundärfollikel (schwarzer Pfeil). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig4.jpg" /> Abbildung 4. OSE kann für die Analyse folgende Kultur isoliert werden. A) Organoide in Medium für bis zu 2 Wochen kultiviert. B) Encapsulated organoide ist mit Alginat-Lyase zu verlassen organoide intakt behandelt. Eierstock ist mit CK8 zu markieren OSE gefärbt. C) Organoide mit Kollagenase zu trennen OSE aus den zugrunde liegenden Stroma behandelt. Verbleibende Gewebestück wurde mit CK8 gebeizt, um die Entfernung der Eierstöcke Oberfläche hervorzuheben. D) gewonnenen Zellen nach der Behandlung sind für OSE angereichert für CK8 (rot) gefärbt. Die Zellen werden mit DAPI gegengefärbt, um Kerne zu markieren.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+the+hypothesis+that+mammalian+ovulation+is+comparable+to+an+inflammatory+reaction.">Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction.</a> Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).</li></ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Die Entwicklung eines dreidimensionalen Organkultursystem Nutzung Alginat-Hydrogele stellt eine vielseitige Methode für die Analyse von vielen verschiedenen Gewebetypen aus einer Vielzahl von Organismen. Der Einsatz von 3D-Kulturen können die Felder des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin erweitert werden, da sie ein Gerüst, auf dem Zellen 11 wachsen kann zur Verfügung stellt. Derzeit ist unser Labor unterzogen erste Studien mit menschlichen Eierstock-und Eileiter Gewebe, aber Kultur der menschlichen und nicht-menschlichen Primaten Follikel wurde 12,13 beschrieben. Der Einsatz von Alginat-Hydrogele zur Kultur Organoide bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Arten von Hydrogelen, wie die Einbeziehung Kollagen, Fibrin oder Hyaluronsäure. Alginat-Gele bei Raumtemperatur und neutralem pH-Wert und bietet für kleine Störung des Gewebes, wie das Gel kapselt die organoiden 14. Alginat nicht mit zellulären Proteinen reagieren und bietet eine chemisch inerte Unterstützung für tissue growth 5. Das Gel kann enzymatisch abgebaut mit Alginat-Lyase, die nicht verschlechtert das verkapselte Gewebe werden, so dass für den Abruf von kultivierten Zellen 15. Ein Nachteil der Verwendung von Alginat-Hydrogele zur dreidimensionalen Gewebekultur ist, dass die ionische Vernetzung bieten mechanische Unterstützung für das Hydrogel Stabilität verliert im Laufe der Zeit notwendig begrenzte Zeiträume Kultur und Re-Vernetzung der Alginat vor der Fixierung 5. Kritische Aspekte dieses Protokolls sind Aufrechterhaltung der Sterilität der gesamten Kultur-Prozess, sowie sorgfältige Präparation des Eierstock-und Eileiter Gewebe zu Störungen der Gewebemorphologie verhindern. Der Eierstock und Eileiter sind besonders für diese Methode geeignet, da Eierstock Oberflächenepithel auf traditionellen Zellkultur Kunststoff kultivierten schnell durchläuft Epithelzellen zu mesenchymale Transition, morphologischen Veränderungen und Zelltod, es sei denn verewigt, zum Beispiel durch Expression von SV40 T / t-Antigen oder hTERT 16, 17. Schlechte Wachstum von normalen OSE auf Kunststoff verhindert Analyse von potenziell prä-maligne Veränderungen. Die Organkultur System unterstützt auch das Wachstum der Eierstöcke oder Eileiter Oberflächenepithel Epithel in Kontakt mit dem zugrunde liegenden Stroma-Zellen, die eine Rolle in der normalen und malignen Physiologie des cells18 spielen können. Kultur dieser Gewebetypen in Alginat-Hydrogele bietet mechanische Unterstützung für die dreidimensionale Architektur des Gewebes zu erhalten, während das Gel selbst nicht mit den Zellen 5 interagieren. Mit dieser Methode zur Kultivierung von Eierstock-Oberflächenepithel oder Eileiter Epithel erlaubt die Analyse der molekularen und morphologischen Veränderungen, die sich aus isolierten Manipulationen der Kultur. Das Alginat-Hydrogel-System erlaubt eine freie Passage der transfizierten cDNA, siRNA und shRNA sowie Hormone und Wachstumsfaktoren 19. Während die transiente Transfektion ist nicht spezifisch für die OSE, da dieser Zelltyp ist auf der äußeren Oberfläche des organoiden höhere Transfektionseffizienz ist in der OSE erreicht im Vergleich zu anderen Zelltypen in das Innere des Eierstocks, wie Granulosazellen. Der Einbau von Bromdesoxyuridin während der Anzucht Etiketten teilenden Zellen durch die Überwachung der Änderungen in das zelluläre Wachstum in Reaktion auf experimentelle Bedingungen. Molekulare Veränderungen an der RNA-oder Protein-Ebene können dann entschlossen, Mechanismen, die zu neoplastischen Veränderungen aufzuklären. Während die genaue Ätiologie des Ovarialkarzinoms ist unbekannt, haben eine erhöhte Anzahl von Leben Ovulationen wurde gezeigt, dass mit einem erhöhten Risiko für Eierstockkrebs Cancer 20 korrelieren. In vivo Analyse der Hypothesen verknüpfen Eisprung Eierstockkrebs stellt viele Herausforderungen bei der Bestimmung der Beiträge der Gonadotropine, Proliferation und Entzündungen zur Krebsentstehung 21-23. Alginat-Hydrogel-Kultur der Eierstöcke und Eileiter ermöglicht Ihnen das isolierte, im direkten Vergleich jeder dieser Komponenten im Eierstock Oberflächenepithel und Eileiter Epithel und führen zu neuen Informationen über die Herkunft von Eierstockkrebs und ihr Fortschreiten von normalen Zellen zu Tumoren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Gibco </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> αMEM Medium </td><td> Gibco </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumalginat </td><td> Novamatrix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Natriumcacodylat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C0250 </td><td></td></tr><tr><td> Polypropylen Mesh-Faser </td><td> McMaster Carr </td><td></td><td> 45 &quot;breite Rolle; 0,0041&quot; Öffnung </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Alginat-Lyase </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A1603 </td><td></td></tr><tr><td> A1603 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9697 </td><td> Von Clostridium histolyticum </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> MP Biomedicals </td><td> 103700 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Gibco </td><td> Gibco </td><td></td></tr><tr><td> ITS-Lösung </td><td> Roche </td><td> 11074547001 </td><td> Insulin / Transferrin / Natriumselenit </td></tr><tr><td> Cytokeratin 8-Antikörper </td><td> Developmental Studies Hybridoma der Bank </td><td> TROMA-1 </td><td> Verwenden Sie bei 1:200 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Vector Labs </td><td> H1200 </td><td></td></tr><tr><td> Bromodeoxyuridine </td><td> Sigma </td><td> B50002-1G </td><td> Endkonzentration 10 uM </td></tr></tbody></table>

alginate hydrogels for three-dimensional organ culture of ovaries and oviducts

Eierstockkrebs ist die fünfthäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen bei Frauen und hat eine 63% Sterberate in den USA 1. Der Zelltyp Ursprungsbezeichnungen für Eierstockkrebs ist nach wie vor in Frage und könnte entweder die Eierstöcke Oberflächenepithel (OSE) oder die distale Epithel der Eileiter Fimbrien 2,3 sein. Die Kultivierung der normalen Zellen als primäre Kultur in vitro wird den Wissenschaftlern ermöglichen, spezifische Änderungen, die an Eierstockkrebs in den verschiedenen Epithel führen, könnte damit endgültig der Bestimmung der Zelltyp des Ursprungs-Modell. Dies ermöglicht die Entwicklung von genaueren Biomarker, Tiermodelle mit Gewebe-spezifische Gen-Veränderungen und eine bessere Präventionsstrategien gezielt für diese Krankheit. Die Aufrechterhaltung normaler Zellen in Alginat-Hydrogele fördert kurzfristig in vitro-Kultur von Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext und ermöglicht Einführung von Plasmid-DNA, siRNA, und kleine Moleküle. Durch Kultivierung Organe in Stücke, die von der strategischen schneidet mit einem Skalpell, verschiedene Kulturen aus einem einzigen Organ erzeugt werden kann, eine Erhöhung der Anzahl von Experimenten von einem einzigen Tier stammen. Diese Kürzungen Modell Aspekte des Eisprungs, die zu Proliferation der OSE, die mit Eierstockkrebs Bildung verbunden ist. Zelltypen wie der OSE, die nicht wachsen auch auf Kunststoffoberflächen können kultiviert mit dieser Methode werden und erleichtern Untersuchung normale zelluläre Prozesse oder die frühesten Ereignisse in der Entstehung von Krebs 4. Alginat-Hydrogele können verwendet werden, um das Wachstum vieler Arten von Geweben 5-Unterstützung sein. Alginat ist ein lineares Polysaccharid aus sich wiederholenden Einheiten von β-D-Mannuronsäure und α-L-Guluronsäure, die mit Calcium-Ionen vernetzt werden können, was zu einer sanften Gelier-Aktion, die nicht beschädigt Gewebe 6,7 zusammensetzt. Wie andere dreidimensionale Zellkultur Matrices wie Matrigel, bietet Alginat mechanische Unterstützung für Gewebe, jedoch sind Proteine ​​nicht reaktiv mit dem Alginat-Matrix und somit Alginat dient als synthetische extrazelluläre Matrix, die nicht einleitet Zellsignalisierung 5. Das Alginat Hydrogel schwebt in Standard-Zellkulturmedium und unterstützt die Architektur des Gewebes Wachstum in vitro. Eine Methode ist für die Vorbereitung, Trennung und Einlagerung von Eierstock-und Eileiter Orgelstücke in Alginat-Hydrogele, die in Kultur gehalten werden bis zu zwei Wochen vorgestellt. Die enzymatische Freisetzung von Zellen für die Analyse von Proteinen und RNA-Proben aus dem Organ Kultur wird ebenfalls beschrieben. Schließlich ist das Wachstum der primären Zelltypen ohne genetische Immortalisierung von Mäusen möglich und erlaubt Ermittler knockout und transgenen Mäusen verwenden.

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Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Kultur von normalen Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext stellt eine alternative Methode zur frühen Ereignisse für die zelluläre Transformation und Tumorentstehung erforderlich studieren. Diese Methode wird verwendet, um normale Eierstock-und Eileiter Zellen wachsen zu frühen Ereignisse bei Eierstockkrebs Bildung zu studieren.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.8K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. Kultur von normalen Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext stellt eine alternative Methode zur frühen Ereignisse für die zelluläre Transformation und Tumorentstehung erforderlich studieren. Diese Methode wird verwendet, um normale Eierstock-und Eileiter Zellen wachsen zu frühen Ereignisse bei Eierstockkrebs Bildung zu studieren.

Serie: Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Planar-und Drei-Dimensional Printing von Leitfähige Druckfarben

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Forschung

Biotechnik

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give flexibility to the spine. It composes of three compartments: the innermost nucleus pulposus (NP) encompassing by the annulus fibrosus (AF), and two cartilaginous endplates connecting the NP and AF to the vertebral body on both sides. Discogenic pain possibly caused by degenerative intervertebral disc disease (DDD) and disc herniations has been identified as a major problem in our modern society. To study possible mechanisms of IVD degeneration, in vitro organ culture systems with live disc cells are highly appealing. The in vitro culture of intact bovine coccygeal IVDs has advanced to a relevant model system, which allows the study of mechano-biological aspects in a well-controlled physiological and mechanical environment. Bovine tail IVDs can be obtained relatively easy in higher numbers and are very similar to the human lumbar IVDs with respect to cell density, cell population and dimensions. However, previous bovine caudal IVD harvesting techniques retaining cartilaginous endplates and bony endplates failed after 1-2 days of culture since the nutrition pathways were obviously blocked by clotted blood. IVDs are the biggest avascular organs, thus, the nutrients to the cells in the NP are solely dependent on diffusion via the capillary buds from the adjacent vertebral body. Presence of bone debris and clotted blood on the endplate surfaces can hinder nutrient diffusion into the center of the disc and compromise cell viability. Our group established a relatively quick protocol to "crack"-out the IVDs from the tail with a low risk for contamination. We are able to permeabilize the freshly-cut bony endplate surfaces by using a surgical jet lavage system, which removes the blood clots and cutting debris and very efficiently reopens the nutrition diffusion pathway to the center of the IVD. The presence of growth plates on both sides of the vertebral bone has to be avoided and to be removed prior to culture. In this video, we outline the crucial steps during preparation and demonstrate the key to a successful organ culture maintaining high cell viability for 14 days under free swelling culture. The culture time could be extended when appropriate mechanical environment can be maintained by using mechanical loading bioreactor. The technique demonstrated here can be extended to other animal species such as porcine, ovine and leporine caudal and lumbar IVD isolation.

This protocol illustrates a harvesting technique for coccygeal bovine intervertebral discs for organ culture for in vitro organ culture.

Vorbereitung von Intact Bovine Rute Bandscheiben für Orgel Kultur

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting  vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give  ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper composition, targeted modulus, and well-defined architectural features. Biomaterials that recapitulate the intrinsic architecture of in vivo tissue are vital for studying diseases as well as to facilitate the regeneration of lost and malformed soft tissue. A novel biofabrication technique was developed which combines state of the art imaging, three-dimensional (3D) printing, and selective enzymatic activity to create a new generation of biomaterials for research and clinical application. The developed material, Bovine Serum Albumin rubber, is reaction injected into a mold that upholds specific geometrical features. This sacrificial material allows the adequate transfer of architectural features to a natural scaffold material. The prototype consists of a 3D collagen scaffold with 4 and 3 mm channels that represent a branched architecture. This paper emphasizes the use of this biofabrication technique for the generation of natural constructs. This protocol utilizes a computer-aided software (CAD) to manufacture a solid mold which will be reaction injected with BSA rubber followed by the enzymatic digestion of the rubber, leaving its architectural features within the scaffold material.

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

Dreidimensionale Biomimetic Technologie: Neuartige Biorubber Erzeugt definierte Mikro- und Makro-Skala Architekturen in Collagen Hydrogele

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Fragmentierung von Bulk-Hydrogelen und Verarbeitung zu granularen Hydrogelen für biomedizinische Anwendungen

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...