Die Autoren danken Finanzierung durch die Defense Threat Reduction Agency (DTRA) unter Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) Vertrag Nr N6601-13-C-2027. Die Veröffentlichung dieses Materials stellt keine Genehmigung durch die Regierung der Ergebnisse und Schlussfolgerungen hier.

1. Hydrogels Bioink Formulierungen und Vorbereitung <ol><li> Um Gewebe-spezifische biochemische Profile zur Verfügung zu stellen, werden die Lösungen gewebespezifische ECM verdauen , wie zuvor für Leber beschrieben. 20 Hinweis: In der Regel wird diese ECM-Digest 40% des endgültigen Hydrogels bioink Volumen umfassen wird, die verwendet wird. Mehrere Hundert Milliliter ECM digest Lösung kann bei -80 ° C für zukünftige Verwendung hergestellt, aliquotiert und eingefroren werden. </li><li> Stand der Formulierung Hydrogel lösen einen Photoinitiator, 2-Hydroxy-4 &#39;- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenon, in Wasser bei 0,1% w / v. Anmerkung: Volumes in 50-100 ml Bereich kann vor der Zeit hergestellt werden, und von Licht bei 4 ° C mehrere Monate gelagert abgeschirmt. </li><li> Um Hydrogel bioinks bilden, lösen sich zunächst die Basismaterialkomponenten aus der Hyaluronsäure (HA) Hydrogel-Kits im Wasser-Photoinitiator-Lösung. <ol><li> Man löst den thiolierten HA und thiolierten Gelatine separat in Wasser-photoinitiator Lösung (Schritt 1.2) auf 2% w / v-Lösungen. </li><li> Auflösen Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA), der Vernetzer in der Hydrogel-Kits, in Wasser-Photoinitiator-Lösung (Schritt 1.2) eine 8% w / v-Lösung zu machen. </li><li> Auflösen Polyethylenglycol (PEG) 8-Arm Alkin (10 kDa MW) in wasserPhotoInitiator-Lösung (Schritt 1.2) eine 8% w / v-Lösung zu machen. </li></ol></li><li> In der Regel bilden Hydrogele das folgende Schema verwenden, obwohl zusätzliche Anpassungen möglich ist. <ol><li> Kombinieren Sie 4 Teile 2% thiolierten HA, 4 Teile 2% thiolierten Gelatine, 1 Teil Vernetzer 1, 1 Teil Vernetzer 2 mit 8 Teilen Gewebe ECM-Lösung und 2 Teilen Hepatozyten Kulturmedien (HCM) (oder 10 Teile Wasser als allgemeine Nicht-Gewebe -spezifische Hydrogel). Hinweis: Weitere unmodifizierten HA oder Gelatine können hinzugefügt werden, die bioink extrudieren mehr reibungslos zu machen. Dies wird nachfolgend beschrieben. </li></ol></li><li> Vortex, um die resultierende Mischung auf hohe (Geschwindigkeit 10 von 10) für 10 Sekunden vor mischen. &lt;/ Li&gt; <li> Die Verwendung von Hydrogel bioink <ol><li> Für die Extrusion oder Bioprinting Tests, übertragen der Mischung in eine Spritze oder eine Druckerkassette und lassen es bei 37 ° C spontan für 30 min (Stufe 1 Vernetzung) zu vernetzen. </li><li> Für rheologische Messungen, übertragen Sie die Mischung in eine 35 mm Petrischale und lassen Sie es 30 Minuten zu vernetzen. Anmerkung: Die Mischung sofort durch Thiol-Acrylat-Bindungsbildung zu vernetzen beginnt, und beginnt in der Viskosität zu erhöhen. Die Mischung sollte auf eine Spritze, Druckkassette, oder Zielstelle innerhalb von 10 min übertragen Verstopfen einer Pipette oder einer Spritze während der Übertragung zu vermeiden. </li><li> Wenn sekundäre Vernetzung (Stufe 2) gewünscht wird, bestrahlen , um die Stufe 1-vernetzte Gele mit UV - Licht (365 nm, 18 W / cm 2) mit einem Thiol-Alkin - Polymerisationsreaktion zu initiieren. Hinweis: Dauer der Bestrahlung auf der Oberfläche des Materials abhängig ist. Im Allgemeinen wird ein Quadratzentimeter Material erfordert nur 1-2 sec UV-Exposition bei dieser UV-Leistung. </li></ol></li></ol> 2. Druckerkompatibilitätstests <ol><li> Vor der Integrationstests mit Bioprinting Geräte, Testextrusionseigenschaften auf dem Labortisch mit einfachen Extrusionstests mit Standardspritzen und kleine Gauge-Nadel Spitzen (20-30 gauge). <ol><li> Schieben Sie die bioink durch eine Standardspritze zu erreichen glatt extrudierten Filamente aus Hydrogel mit wenigen oder keinen Stößen. Extrudieren von Linien oder einfache Muster genügt Erfolg zu bestimmen. </li></ol></li><li> Für bioprinter Integration, laden bioink Vorbereitungen, indem sie in Druckerpatronen Pipettieren und lassen 30 min für die bioink spontane Stufe 1 Vernetzung innerhalb der Kassette zu unterziehen. Hinweis: Volumen der bioink von der speziellen Anwendung abhängig und sollte durch den Benutzer bestimmt werden. Druckerpatronen ähneln oder sein Spritzen können, die mit dem bioprinter Gerät kompatibel sind. </li><li> Bewerten Extrusion Kompatibilitätfür Bioprinting durch ein einfaches Muster Drucken des bioink verwenden. Zum Beispiel, drucken Sie ein 7 x 7 mm Muster aus parallelen Linien besteht. Anwendungsdruck (beispielsweise 20 kPa pneumatischer Druck) während der Druckkopf bewegt sich in der XY - Ebene mit einer Geschwindigkeit von etwa 300 mm / min. Hinweis: Die Druckkopfdüsendurchmessern von verschiedenen Größen verwendet werden können, aber konische Düsen mit 400-500 um Durchmesser Öffnungen sind optimal für den Druck Sphäroide in der 250-350 um-Bereich. <ol><li> Wenn die extrudierten Materialien klumpig oder unregelmäßig sind, siehe 2.4 Schritt, oder die Menge an PEGDA reduzieren, um die Stufe 1 vernetzte Material zu erweichen. Richtig vorbereitet bioink Formulierungen extrudieren glatt, in gewünschten Mustern oder Architekturen präzise Abscheidung ermöglicht. Hinweis: Die Bioprinting beschriebenen Verfahren Verwendung eines benutzerdefinierten 3-D Bioprinting Gerät im Haus speziell für Gewebe konstruieren Druck 32 Als solche spezifischen Druckparameter dramatisch variieren je nach Gerätetyp und erfordern testin.g durch den Benutzer. </li></ol></li><li> Zur Verbesserung der Extrusionseigenschaften ergänzen unmodifizierte HA und Gelatine zu den bioinks (1,5 mg / ml und 30 mg / ml, jeweils). </li></ol> 3. Validierung von Bioprinting mit primärem Leber Konstrukten <ol><li> Bereiten Sie 3-D Primärzelle Leber Sphäroiden Tropfen hängen Methoden wie der Zellkomponente 33 Hinweis: Bioprinting kann ohne Sphäroiden durchgeführt werden, sondern mit einzelnen als auch in den Hydrogel bioinks suspendierten Zellen. Sphäroide werden hier verwendeten Zell-Zell-Wechselwirkungen zu beschleunigen und Funktionalität zu konstruieren. Die Anzahl von Sphäroiden oder Zellen eingesetzt wird, hängt von der spezifischen Anwendung und sollte durch den Benutzer bestimmt werden. Diese Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, unter Verwendung von Sterilgut. <ol><li> Bereiten Sie HCM durch die aufgetauten Inhalte der HCM Ergänzung Komponenten-Kit auf den Hepatozyten-Basalmedium Zugabe (HBM) und Sterilfiltration. <ol><li> Auftauen Ergänzung Komponenten until Flüssigkeit. </li><li> Fügen Sie die Ergänzung Komponenten (Ascorbinsäure, 0,5 ml; Rinderserumalbumin [fettsäurefrei], 10 ml, Gentamicin-Sulfat / Amphotericin B, 0,5 ml; Hydrocortison 21-Hemisuccinat, 0,5 ml; Insulin, 0,5 ml; menschliche Faktor rekombinante epidermale Wachstums 0,5 ml; Transferieren, 0,5 ml) in den 500 ml HBM. </li><li> Sterilfilter durch einen 0,45 &amp; mgr; m oder 0,22 &amp; mgr; m Filter eine Flaschenaufsatz-Filter-Einheit oder ein Spritzenspitze Filter. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Zelldichte von primären humanen Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Sternzellen, indem Sie auf einem Hämocytometer gezählt, nachdem jeder Zelltyp &quot;Anweisungen nach Herstelleraufgetaut wurde. </li><li> Kombinieren primären humanen Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Sternzellen in einem 80:10:10 Verhältnis von Zellzahl in HCM Medien, die auf 37 ° C in einem konischen Rohr erwärmt worden ist. Hinweis: Das Volumen der Medien verwendet werden, hängt von der Gesamtzellzahl der spezifisch auf die Anwendung und sollte von th bestimmt werdene Benutzer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 Minuten bei 520 · g bei 20 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren, hinter dem Zellpellet zu verlassen. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in HCM Medium eine Zellsuspension mit 1.000 Zellen pro 40 ul Medium zu ergeben. Gesamtvolumen ist abhängig von der Anzahl von Sphäroiden hergestellt wird. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf 96-Well-Format hängenden Tropfen Platten. In insgesamt rund 1000 Zellen in jede Vertiefung in HCM und halten bei 37 ° C, in 5% CO 2 für 3 Tage , während der mehrzelligen Sphäroiden bilden. </li><li> Sammeln Leber Sphäroiden aus dem hängenden Tropfen Platte mit einer Pipette verwenden. Transfer zu einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen. </li></ol></li><li> Bioprint Leber Sphäroiden in leberspezifischen Hydrogel bioink <ol><li> Bereiten Sie eine Formulierung von Leber ECM-haltigen Hydrogel bioink wie in Schritt 1 beschrieben, unter Verwendung von 8% PEGDA und 8% 8-Arm PEG Alkin als Vernetzer. Verwenden Sie diese Kombination für seine Fähigkeit, in resulting in einem Hydrogel Nähe in Scherelastizitätsmodul zu nativen Lebergewebe. </li><li> Lassen Sie die Sphäroiden auf den Boden des konischen Rohrs absetzen, in dem sie in Schritt 3.1.7 gelegt wurden. Dies variiert je nach Sphäroid Größe und Dichte, sondern erfolgt in der Regel innerhalb von 1-2 min. Entfernen Sie alle Medien durch vorsichtiges Absaugen oder mit einer Pipette. </li><li> Übertragen, um das gewünschte Volumen an frisch hergestellten Hydrogels bioink Lösung des konischen Röhrchen, enthaltend die Sphäroide. Im allgemeinen wird ein geeignetes Volumen von 10% bis 25% größer als das Volumen des 3-D-Konstrukt gedruckt werden. Pipette vorsichtig nach oben und unten die Sphäroiden in dem Hydrogel bioink Lösung zu suspendieren. Transfer zu einem bioprinter Patrone eine Pipette oder serologische Pipette. </li><li> Im Inneren der Patrone bioprinter ermöglichen die Lösung der ersten Vernetzungsstufe (thiol-Acrylat-Reaktion) für 30 min zu unterziehen. Hinweis: Je nach Größe Sphäroid kann die Patrone müssen langsam gedreht werden oder die Inhalte müssen mit gemischt werdenein sterilen Spatel die Sphäroiden im gesamten bioink während der Phase 1 Vernetzung verteilt zu halten. Dies ist weniger eine Notwendigkeit für bioinks mit suspendierten Zellen hergestellt anstelle von Sphäroiden. Hinweis: Nach der Stufe 1 Vernetzung haben die Benutzer ein Betriebsfenster von mehreren Stunden. Es wird jedoch empfohlen, schnell den Bioprinting Prozess auszuführen Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. </li><li> Nach der Stufe 1 Vernetzung verwenden, um eine Bioprinting Vorrichtung gewünschten Hydrogel Strukturen zu schaffen, die primären Leber Sphäroiden (oder andere Zellen) enthält. Anmerkung: Diese Technologie stellt ein System für eine breite Vielfalt von Strukturen biofabricating. Parameter wie Gesamtmenge, die Anzahl von Zellen oder Sphäroide, die gedruckte Strukturgeometrie und Substrat, auf dem gedruckt werden Konstrukte sind von den Zielen des Benutzers abhängig. </li><li> Nach der Abscheidung in die gewünschte Konfiguration, UV-Licht für 2-4 sec verabreichen, um die sekundären Vernetzungsmechanismus, der Stabilisierung des co einzuleitennstructs und zunehmende Steifigkeit auf das gewünschte Niveau. Anmerkung: Die Konzentration von PEG-Alkin, und damit die Gesamt endgültige Vernetzungsdichte steuert in erster Linie die endgültige Konstrukt Steifigkeit. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4 und 3.2.5, um vielschichtige Konstrukte zu erstellen. </li></ol></li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere Komponenten , die kritisch sind, die bei der 3-D - Gewebekonstrukte zu biofabricate versucht, für eine eventuelle Verwendung beim Menschen oder für in - vitro - Screening - Anwendungen. Unter Verwendung der geeigneten zellulären Komponenten bestimmt das Ende Potential Funktionalität, während die biofabrication Gerät selbst zum Erreichen des Endes Konstrukt die allgemeine Methode bestimmt. Die dritte Komponente, die Biomaterial, ist ebenso wichtig, da es eine Doppelrolle dient. Insbesondere muß das Biomaterial Komponente sowohl mit dem biofabrication Hardware kompatibel sein (dh bioprinters) als auch die potentiell zerbrechlichen biologischen Zellbestandteile unterstützen. beide Anforderungen optimieren kann schwierig sein, da bioprintable Materialien mehrere wichtige Parameter erfüllen müssen: 1) besitzen die entsprechenden chemischen, mechanischen und zeitlichen Eigenschaften effizient und unbelastet Druck zu erleichtern; 2) Unterstützung der Lebensfähigkeit der Zellen während der Vorbereitungsphase und bioprinting Verfahren; 3) und bieten eine einladende Umgebung, die am besten die Lebensfähigkeit der Zellen und schließlich Gewebekonstrukt Funktion nach dem Bioprinting verbessert. Wir beschäftigen das modulare Hydrogel bioink System in der hier beschriebenen Methodik beschrieben, um diese Anforderungen zu erfüllen. Erstens, durch Wachstum Einbeziehung Faktoren, Kollagenen, GAGs und Elastine vom ECM eines bestimmten Gewebetyps abgeleitet sind, können wir ein biochemisches Profil erreichen, die von der Zielgewebetyp erinnert. Zweitens, durch den Einsatz 2 ähnliche, jedoch unabhängige Vernetzungsreaktionen können wir eine weiche extrudierbares Material zu erreichen, die mit kompatiblen ist am Extrusionsbasis, die weiter mit dem zweiten Vernetzungsschritt verändert werden kann eine bestimmte Materialelastizitätsmodul zu erreichen, die ein Ziel übereinstimmt Gewebe der Wahl. 34 Die kritische Eigenschaft dieses Systems, die es sinnvoll macht, ist die Fähigkeit, mehrere chemische Reaktionen zu unterstützen, die genutzt werden können, die polyme zu manipulierenArisierung der Kinetik und mechanischen Eigenschaften des bioink Systems. Durch Verwendung von zwei unabhängigen Reaktionstypen, Thiol-acrylat und Thiol-Alkin erreichen wir die Fähigkeit, eine Stufe 1 thiol-Acrylat-Reaktion, die in einem weichen Material führt auszuführen, die durch eine Spritze oder Bioprinting Vorrichtung extrudiert werden kann, und eine Stufe 2 thiol -Alkin Reaktion, die nur nach UV-Bestrahlung in Gegenwart eines Photoinitiator initiiert wird, der den Elastizitätsmodul des endgültigen Konstrukts bioprinted bestimmt. Diese mehrere Schritte führen zu einem bioprintable Material. Als solches, um eine stabile bioink zu erreichen, die Extrusion und anschließende Elastizitätsmodul Anpassung unterstützt, wird diese separaten Reaktionstypen Aufrechterhaltung wichtig. Das primäre Auslosung das System für biofabrication zu verwenden ist seine einfache individuell gestaltet werden, die entweder durch die Manipulation des Ende des Elastizitätsmoduls durch den sekundären Vernetzer oder durch Einbeziehung verschiedener Gewebe stamm ECM-Materialien durchgeführt wird<html> oder Wachstumsfaktor Cocktails. Das ECM in Gewebe enthält eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und andere Cytokine, die häufig in Gesamtverteilung zwischen Gewebetypen variieren. Wir glauben, dass diese Faktoren für die Aufrechterhaltung der Funktion bestimmter Zelltypen, wie primäre humane Hepatozyten integral sind. Die Umsetzung dieses Konzepts wurde zuvor demonstriert die Lebensfähigkeit und Funktion von primären humanen Hepatozyten in heparinisierten Hyaluronsäure Sandwich Kulturen zu erhöhen. 20 Heparinketten in dem Hydrogel mit Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren sowie andere ECM - Komponenten aus der Leber ECM Durch die Kombination konnten wir diese leberspezifische biochemische Profil primären humanen Hepatozyten zu präsentieren, für einen längeren Zeitraum Lebensfähigkeit und Funktion in vitro beibehalten wird . Dieser Ansatz kann leicht auf andere Gewebetypen erweitert werden, so dass Forscher Rekapitulation dieser gewebespezifischen Faktoren durch Dezellularisieren und Solubilisieren anderen Geweben zu erreichen. Zelt &quot;&gt; Benutzer , dass , während die Basiskomponenten dieses bioink System 10,12,17 zuvor in Bioprinting umgesetzt wurden, sollten sich bewusst sein , aber in weniger nuanciert, gewebespezifische Ansätze sowie eine Vielzahl von anderen regenerativen Medizin - Anwendungen, 35- 45 biofabrication nicht für alle Gewebearten versucht wurde. als solches kann es einige weitere Entwicklung und Fehlersuche erforderlich sein , um solche zusätzlichen Gewebekonstrukte zu erzeugen. jedoch ist ein modulares System, wie es hier beschrieben ist sehr gut anpassungsfähig sein kann. Andere mögliche Einschränkungen umfassen natürliche Affinitäten, dass einige Zellarten zu bestimmten Biomaterialien haben können. Im allgemeinen haben wir, dass die Hyaluronsäure, Gelatine gefunden, und PEG-basierten Basiskomponenten dieses Hydrogels Systemunterstützung tragfähige Kulturen von einer Vielzahl von Zelltypen, aber es können einige Arten von Zellen sein, die in Umgebungen entworfen unterschiedlicher Zusammensetzungen eine bessere Leistung, wie beispielsweise Kollagen, das eine inhärente faserige hat natur oder Elastin, das von Natur aus elastisch ist. Als solche Rücksichtnahme auf das optimale Material für ein Gewebe gegebenen Typs und Endanwendung wichtig ist, und das Hydrogel bioink hier beschriebene System möglicherweise nicht für alle Anwendungen ausreichend. Zusätzlich ist es wichtig, die Umgebungsbedingungen zu berücksichtigen, unter denen Bioprinting durchgeführt wird. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurde, haben wir aus der Nähe von Umgebungstemperatur (Raumtemperatur) Bedingungen bioinks ohne Zellmedien verwenden, was zu einer schlechten Rentabilität führen, wenn die Zubereitung und Druckzeit zu wurde herausgezogen, um schnellere Protokolle unter 37 ° C unter Verwendung von bioinks mit einer Medienkomponente, die dramatisch die Lebensfähigkeit der Zellen erhöht. Bis vor kurzem einige Materialien oder Materialsysteme wurden speziell Systeme zur Schnittstelle mit Bioprinting entwickelt. Als Ergebnis sind die meisten Materialien stark vereinfacht, entweder ihre biologischen Eigenschaften nutzt Zellen zu unterstützen, oder, deren Kompatibilität mit biofabricationHardware. Nur wenige Materialien sind optimal in beiden Bereichen. Das System in dieser Methodik beschrieben entkoppelt diese Eigenschaften, wodurch eine Anpassung der biologischen Charakterisierung, während die mechanischen Eigenschaften, die für Extrusions Bioprinting erleichtern. Eine zusätzliche Unterscheidung dieses Hydrogels bioink Systems ist, dass es beide biochemischen und physikalischen Parameter der Zielgewebe imitieren kann es für biofabricating verwendet wird. Dies unterstützt eine beeindruckende Maß an Flexibilität, so dass Rekapitulation der biochemischen Faktoren von nahezu jedem Gewebe, sowie das Elastizitätsmodul von jedem Weichgewebe entspricht. Die Aufmerksamkeit auf diese beiden Aspekte eines Gewebes wurden selten in Tandem erforscht. Der modulare Aufbau dieser Technologie bietet eine Flexibilität bei einer Vielzahl von Anwendungen implementiert werden. Die Fähigkeit, verschiedene Gewebetypen zu imitieren bietet die Möglichkeit, biofabricate nicht nur Leber-Konstrukte als Beispiel in dieser Arbeit verwendet, aber constructs repräsentieren viele der anderen Geweben im Körper. Vielleicht offensichtlichste breite Anwendung unter Verwendung dieser Parameter ist die Fähigkeit, auf ein bestimmtes Gewebe, beide Aspekte entsprechen den End Funktion der Konstrukte für reale Anwendungen wie Implantation oder Drogen- und Toxikologie Screening zu optimieren. Während Erzeugung von Mensch-Größe Gewebe für die Implantation bei Patienten das Ende Ziel für viele Forscher ist, aufgrund regulatorischer Hürden, Zellbeschaffung und Beschränkungen für die Fähigkeit, funktionelle Gefäße in Gewebezüchtungen Organe herzustellen, wird dieses hohe Ziel Weiterentwicklung und Zeit erfordern realisiert werden. Jedoch Technologien wie die Methodik hier beschriebenen beginnen derzeit zur Erzeugung von &quot;Organoide&quot; für die in vitro - Plattformen implementiert werden. Unser Team, sowie andere, gegenwärtig unter Verwendung von organoiden biofabrication Modellsysteme zu schaffen, in der Toxikologie-Studien durchgeführt werden. Darüber hinaus können solche Organoiden zu verwendet werden,Studie Pathologien und Fortschreiten der Krankheit, wie Krebs, 46 und prüfen potenzielle therapeutische Behandlungen. Schließlich unterstützt dieses System auch eine weitere wichtige Anwendung. Durch die Manipulation unabhängig diese Parameter können die Forscher grundlegende wissenschaftliche Experimente durchführen, die relative Bedeutung von biochemischen gegen mechanische Faktoren zu bestimmen.

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung stehen, die die Notwendigkeit für alternative Quellen von funktionellen Organe und Gewebe durch den Versuch, die Herstellung oder biofabricate Adressen, ihnen. Bioprinting als eines der vielversprechendsten dieser Technologien entstanden. Bioprinting kann als eine Form der Herstellung von biologischen Teilen robotic additive gedacht werden, die verwendet werden zur Erstellung oder Muster tragfähige organartige oder gewebeähnlichen Strukturen in drei Dimensionen. 1 In den meisten Fällen verwendet Bioprinting eine 3-dimensionale (3 -D) Druckgerät , das von einem Computer gerichtet ist , Zellen und Biomaterialien in genaue Positionen zu deponieren, damit rekapituliert anatomisch imitiert physiologischen Architekturen. 2 Diese Geräte besitzen einen &quot;bioink&quot; drucken, die die Form von Zellaggregaten erfolgen kann, in Hydrogele eingekapselten Zellen oder viskose Flüssigkeiten oder Zell ausgesät Microcarriern sowie zellfreie Polymere, die mechanische Struktur oder als zellfreie pla liefernceholders. 3,4 Nach dem Bioprinting Verfahren kann die resultierende Struktur in funktionelle Gewebe oder Organstrukturen gereift werden, und für die beabsichtigte Endanwendung verwendet. 5,6 Bis heute eine vollständige voll funktionsfähige menschliche Größe Orgel wurde nicht gedruckt, aber es bleibt die primäre langfristige Ziel von Bioprinting Forschung und Entwicklung. 2 jedoch kleine &quot;organoide&quot; Gewebekonstrukte sind derzeit in einer Reihe von Anwendungen implementiert werden, einschließlich der Pathologie Modellierung, Entwicklung von Arzneimitteln und Toxikologie - Screening. Eine der wichtigsten Hürden, die Forscher bei der Anwendung Bioprinting Technologie begegnet ist, dass nur sehr wenige Materialien für den ausdrücklichen Zweck der Bioprinting entwickelt. Um effektiv in Bioprinting erfolgreich zu sein, muss ein Biomaterial 4 grundlegende Anforderungen erfüllen. Das Biomaterial muss 1) die entsprechenden mechanischen Eigenschaften zu haben Abscheidung zu ermöglichen (es durch eine Düse als Gel Extrusion oder ein inkjet als Tröpfchen), 2) die Fähigkeit, seine Form als Bestandteil eines 3-D-Struktur nach der Abscheidung zu halten, 3) die Fähigkeit zur Benutzersteuerung der 2 vor Eigenschaften, und 4) eine Zelle freundlich und unterstützenden Umgebung überhaupt Phasen des Bioprinting Verfahren. 7 Historisch Bioprinting Arbeit versucht hat , oft bestehenden traditionellen Biomaterialien in Bioprinting Geräte ohne Rücksicht auf ihre Kompatibilität zu verwenden, anstatt ein Biomaterial von der Gestaltung der notwendigen Eigenschaften für Bioprinting und anschließende Post-Druckanwendungen zu haben. Eine Vielzahl von bioinks wurden vor kurzem eine bessere Schnittstelle mit der Abscheidung und Fertigung Hardware entwickelt. Standard-Hydrogel-Systeme stellen erhebliche Probleme, da sie in der Regel entweder als Vorläufer Fluidlösungen mit unzureichenden mechanischen Eigenschaften bestehen, oder polymerisiert Hydrogele, die auf den Extrusionsprozess Düsen oder werden verstopfen aufgebrochen, wenn gedruckt werden. Unser Team, sowie others wurden verschiedene Hydrogel - Formulierungen untersucht , diese Bioprinting Probleme, einschließlich Zell - Sphäroiden Druck in Hydrogel - Substrate, 5,8 - Zelle und Hydrogel Filamentextrusion von Mikrokapillarröhrchen, 9-11 extrudierbaren Hyaluronsäure (HA) -gold Nanopartikel Hydrogele mit dynamischen Vernetzungseigenschaften zu adressieren 12 zeitliche Steuerung des Hydrogels Steifigkeits photopolymerisierbaren Verwendung methacrylierte HA und Gelatine, 13 Fibrinogen-Thrombin-basierten Vernetzung 14,15 Ionenaustausch Alginat-Kollagengele, 16 und kürzlich schnelle polymerisierenden ultraviolettem Licht (UV) initiierten Vernetzung 17 Diese Beispiele demonstrieren die Durchführbarkeit der Erzeugung von Materialien, die effektiv bioprinted durch kann. Doch neben der Integration mit Hardware, um erfolgreich zu generieren tragfähige und funktionelle 3-D-Gewebekonstrukte müssen Biomaterialien enthalten biochemische und mechanische Signale, dass die Hilfe bei der Aufrechterhaltung der zellulärenLebensfähigkeit und Funktion. Diese zusätzlichen Faktoren, biochemische und mechanische Profile können einen wesentlichen Einfluss auf die erfolgreiche Funktion von bioprinted Gewebekonstrukte. Beide Zellen und die native extrazelluläre Matrix (ECM) sind verantwortlich für eine Vielzahl von Signalmolekülen, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren und anderen Cytokinen auf andere Zellen zu präsentieren. Die Kombination dieser Signale variiert von Gewebe zu Gewebe, kann aber bei der Regulierung der Zell - und Gewebeverhalten extrem potent und einflussreich. 18 gewebsspezifische ECM Komponenten aus verschiedenen Organen und Umsetzung als Hydrogel oder als Teil eines Hydrogels erforscht worden Einsatz mit Erfolg. 19-21 Dieser Ansatz, der von Dezellularisieren einer gegebenen Gewebe besteht, Pulverisieren, und es löst, können gewebespezifische biochemische Signale von jedem Gewebe zu erzeugen , und kann in 3-D - Hydrogel - Konstrukte eingebaut werden. 22 verwendet werden , Zusätzlich,es wird allgemein dokumentiert , dass Gewebe in dem Körper eine Vielzahl von Steifigkeiten besetzen. 23 als solche, die Fähigkeit , die mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien, wie beispielsweise Elastizitätsmodul E &#39;oder Scherelastizitätsmodul G&#39;, abzustimmen ist ein nützliches Werkzeug in Tissue Engineering . Wie oben beschrieben, ermöglicht die Kontrolle über bioink mechanischen Eigenschaften für die Extrusion basierte biofabrication ein weiches Gel, das durch sekundäre Vernetzung zu einem späteren Zeitpunkt dann weiter manipuliert werden kann, an dem Elastizitätsmodul Niveaus erreicht werden kann, dass die von dem Zielorgan Typ entsprechen. Zum Beispiel könnte Biomaterialien angepasst werden wie eine native Leber eine Steifigkeit von 5-10 kPa entsprechen, 23 oder eine Steifigkeit von 10 bis 15 kPa wie native Herzgewebe entsprechen, 24,25 in der Theorie Erhöhung der Fähigkeit dieser Organoiden funktionieren in eine ähnliche Art und Weise in ihre Heimat Gewebe Pendants. Der Einfluss von Umwelt Steifigkeit auf Zell-Phänotyp wurde explored in den letzten Jahren, insbesondere im Hinblick auf Stammzellen. Engler et al. Zeigten , dass die Substrat - Elastizitätsantriebs mesenchymalen Stammzellen Aided (MSC) in Richtung Abstammungslinien mit Gewebeelastizität der des Substrats übereinstimmt. 25 dieses Konzept weiter zur Differenzierung in Muskel untersucht worden ist, die Herzfunktion, Leber Phänotyp, hämatopoetische Stammzellproliferation und Wartung der Stammzell therapeutisches Potential. 24,26-29 ein Hydrogel zu unterschiedlichen Elastizitätsmoduln abzustimmen In der Lage ist ein wichtiges Merkmal eines Biomaterials , das Gewebekonstrukte werden verwendet wird biofabricate. 30 Hier beschreiben wir ein Protokoll, das einen vielseitigen Ansatz in unserem Labor für eine Hydrogel-System zu formulieren, die Extrusions bioprinted werden kann und angepasst auf 1) enthalten, die biochemische Profil eines bestimmten Typs Gewebe und 2) ahmen den Elastizitätsmodul dieser Gewebeart . Durch diese Anforderungen adressieren, wollen wir provide ein Material, das die physikalisch - chemischen und biologischen Eigenschaften von in vivo Gewebe rekapitulieren kann. 31. Das modulare Hydrogel beschrieben Verbundsystem nimmt hier den Vorteil eines Mehrvernetzungs Ansatz extrudierbaren bioinks zu ergeben, und ermöglicht eine Nachvernetzung zu stabilisieren und erhöht die Steifigkeit der Endprodukte eine Reihe von Gewebetypen zu entsprechen. Biochemische Anpassung wird durch die Verwendung gewebespezifischer ECM-Komponenten erfüllt. Als Demonstration, beschäftigen wir eine leberspezifische Vielfalt dieses Hydrogelsystem funktionelle Leber organoiden Konstrukte Bioprint. Das Protokoll beschrieben verwendet eine benutzerdefinierte 3-D Bioprinting Gerät. Im Allgemeinen kann dieses Protokoll zu den meisten Extrusionsbasierte Drucker, bestimmte Druckparameter variiert durch den Benutzer für jeden Gerätetyp und erfordern Tests drastisch angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Hyaluronic acid</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4&amp;prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td></tr><tr><td>PEG 8-Arm Alkyne, 10&amp;nbsp;kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>Primary human hepatocytes</td><td>Triangle Research Labs</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>Primary human liver stellate cells</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Primary human Kupffer cells</td><td>Life Technologies</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Basal Media (HBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Media Supplement Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5&amp;nbsp;ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10&amp;nbsp;ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5&amp;nbsp;ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5&amp;nbsp;ml; insulin, 0.5&amp;nbsp;ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5&amp;nbsp;ml; transferring, 0.5&amp;nbsp;ml)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Other manufacturers are ok.</td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>Other manufacturers are ok.</td></tr><tr><td>Fresh porcine cadaver tissue</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freezer mill</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td></tr><tr><td>Hanging drop cell culture plate</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001</td><td>InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td></tr></tbody></table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Wenn die oben beschriebenen Verfahren korrekt befolgt werden, Hydrogele ein biochemisches Profil spezifisch auf die Zielgewebetyp enthalten sollte, damit 20 für einen hohen Grad an Kontrolle über Bioprinting und letzten Elastizitätsmodul, 34 und lebensfähigen funktionellen Zellen in Gewebekonstrukten unterstützen. Hydrogele Customization Um am besten imitieren nativen Leber, das Hydrogel bioink durch Leber ECM - Lösungen und einem Wachstumsfaktor Array, 20 ECM - Lösungen enthalten eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Zytokine (gezeigt in pg / ml, 1A) ergänzt wurde. Dazu gehören brain-derived neurotrophic factor (BDNF), bFGF, bone morphogenetic protein 5 (BMP-5), FGF-4, insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP-2), TGF- b1, BMP-7, EGF , FGF-7, Wachstumshormon (GH), Heparin-bindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor (HB-EGF), HGF und neurotrophin 3 (NT-3). Zusätzlich ECM Lösungen enthalten zusätzliche Strukturkomponenten, die durch kolorimetrische Tests analysiert. 20 Für Leber ECM Lösungen Gesamtkollagengehalt der Leber ECM Lösungen betrug 91,33 ± 0,58 mg / ml, die Elastin - Gehalt betrug 189,33 ± 48,40 mg / ml, und die Glycosaminoglycan (GAG) Gehalt betrug 86,00 ± 53,45 mg / ml (1B). Hydrogele bioink mechanischen Eigenschaften eine Scherspannung Vibrationstest charakterisiert werden kann unter Verwendung von (0,6-10 Pa, Schwingungsfrequenz von 1 Hz) auf dem Rheometer. 10,12,13,34 Dadurch , dass spontane Stufe 1 Thiol-Acrylat - Chemie bei neutralem pH - Wert zu kommen, eine weiche Hydrogel mit einem G &#39;von 113,66 ± 22,59 Pa gebildet. Nach Beginn der Stufe 2 Thiol-Alkin - Vernetzung durch UV - Photopolymerisation, G &#39;steigt auf etwa 10 kPa (10.637 ± 113,83 Pa, Figure 1C), Lebergewebeelastizität nachahmt. Zusätzliche Manipulation der Konzentrationen, Molekulargewichte und Geometrien von Vernetzer können eine breite Palette von &quot;Werte der Stufe 2 G erreichen. 34 Die Qualität der bioprinted Hydrogel Chemische Strategie und Durchführung der Stufe 1 und Stufe 2 Vernetzung der Hydrogel bioinks in Figur 2 beschrieben ist. Im Allgemeinen Vernetzern wie Extralink, die auf acrylierte PEG Polymeren basieren, reagieren spontan mit Thiolgruppen auf der HA und Gelatineketten bei neutralem pH-Wert (Stufe 1) in Gegenwart von Zellen eines weichen extrudierbaren Hydrogel zu bilden. Dieses weiche Hydrogel kann als bioink bioprinted werden, wonach UV-Licht verwendet wird Photopolymerisation von nicht umgesetztem Thiolen und den sekundären Vernetzer auf Alkin-modifizierte Polymere auf Basis PEG zu initiieren. Die besonderen Molekulargewichte und Geometrien der Vernetzer gehenvern das Ende Steifigkeit des bioprinted Konstrukt. A 7 x 7 mm Muster wurde für Testzwecke (3A) umgesetzt. Erste Versuche zeigten , dass die anfängliche Formulierungen waren extrudierbaren, aber erschien unregelmäßig und verklumpten während und nach der Extrusion (3B). Zur Verbesserung der Extrusionseigenschaften, unmodifizierte HA und Gelatine wurde auf die bioinks ergänzt (1,5 mg / ml und 30 mg / ml). Die verbesserte glatte gedruckte Struktur ist in 3C gezeigt. Viability und Grundfunktion der bioprinted primären humanen Leber Konstrukte Verwendung der 3-D bioprinter das bioaktive leberspezifischen Hydrogel bioink wurde verwendet, um primäre menschliche Leber Sphäroide einzukapseln und abzuscheiden, zuvor hergestellt durch tropfen Kulturen hängt, auf Plastikdeckgläschen. gedruckt auf Kunststoff-Deckgläser für eine robuste Handhabung und die Übertragung auf eine Vielzahl von Zellkultur-Umgebungen erlaubt. Nach Bioprinting, hallogh die Lebensfähigkeit der Zellen in der Leber Konstrukte wurde nach , LIVE / DEAD Lebensfähigkeit / Zytotoxizität - Färbung und der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 4A) beobachtet. Unter optimalen Umgebungsbedingungen sollten die Lebensfähigkeit über 85% betragen. Primäre humane Hepatozyten werden in der Regel empfindlich gegenüber mechanischen und chemischen Belastungen betrachtet, die eine gewisse Optimierung von Umgebungsvariablen erforderlich. Folgende Bioprinting und Überprüfung der Lebensfähigkeit, zusätzliche Leber Konstrukte, die in Kultur genommen werden, können durch die Analyse Medien Aliquots an Tag 3, Tag 7, Tag 14 10, und Tag für die Analyse von sezerniertem Harnstoff und Albumin entfernt Funktionalität geprüft werden. Die Harnstoff kolorimetrische Tests zeigen eine relativ gleichbleibendes Niveau von Harnstoff Sekret der Leber Konstrukte über die 14-Tage - Zeit natürlich noch zwischen 15 und 20 ng / ml (4B). Erkannt Harnstoffspiegel waren nicht signifikant verschieden voneinander bei verschiedenen ZeitPunkte. The Human Albumin ELISA - Assay zeigt , dass die Albumin - Herstellung aus den Konstrukten auch relativ konstant über die Zeit bleibt, stabil bleibt zwischen 125 und 140 ng / ml (Figur 4C). Zusätzlich wird, wenn für Marker indikativ für Lebergewebe, positive Expression von intrazellulären Albumin, CYP3A4 (Cytochrom-P450-Isoformen beteiligt am Stoffwechsel), E-Cadherin (eine epithelialen Zell-Zell-Adhäsion Protein) gefärbt und Dipeptidylpeptidase-4 (ein Protein exprimiert hoch in der Leber) beobachtet (4D-F). Zusammengenommen deuten diese Lebensfähigkeit und funktionellen Daten, dass die gewebespezifische Hydrogel bioink hilft bei der Lebensfähigkeit Aufrechterhaltung und Funktion von bioprinted primäre zellbasierten Leber Konstrukte. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig1.jpg" /> Abbildung 1. Hydrogels Bauteilcharakterisierung und Steifigkeit Beurteilung. A) Wachstumsfaktor undZytokin - Analyse von Proteomik - Arrays für die ECM - Lösungen , die aus Leber. B) Kolorimetrische Assays Quantifizierung von Kollagen, Glycosaminoglycan und Elastin - Gehalt in der Leber ECM - Lösungen. C) Nachweis der Fähigkeit bioink Steifigkeit zu steuern. Nach der Stufe 1 Vernetzung ist das Gel relativ weich und können problemlos extrudiert werden. Nach der Stufe 2 Vernetzung durch UV-Licht, ein Elastizitätsmodul erhöht sich um mehr als eine Größenordnung, Lebergewebe Elastizitätsmodul nachahmt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig2.jpg" /> Abbildung 2. mehrere PEG-Basis Vernetzer für die Extrusion Bioprinting und Kontrolle über Gewebe konstruieren Einsatz mechanischen Eigenschaften. STRATEGIE der Formulierung von druckbaren bioinks bestehend aus Acrylat-Basis Vernetzer (Vernetzer 1), Alkin Vernetzer auf Basis von (Vernetzer 2) thioliert HA, thiolierten Gelatine, ECM Gewebematerialien, und unmodifizierte HA und Gelatine. Die bioink Formulierung wird hergestellt und spontan vernetzt durch Thiol-Acrylat-Bindung, was zu einem weichen, extrudierbaren Material. Bioprinting durchgeführt wird. Schließlich sind die bioprinted Schichten verschmolzen sind, stabilisiert, und brachte in die Leber Elastizitätsmodul. Dieser Vorgang kann wiederholt werden , mehrschichtige Strukturen zu erzeugen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bioprinting Prüfung von bioinks. A) A 7 x 7 mm Wickelmuster wurde für bioink Extrusionstest verwendeting im bioprinter. B) Die erste Formulierung eines PEGDA und 8-Arm PEG führte Alkin bioink in unregelmäßigen Abscheidung. C) roh HA und Gelatine verbessert Extrusion Hinzufügen, in der glatten Extrusion des bioink führt. Maßstabsleiste -. 1 mm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53606/53606fig4.jpg" /> Abbildung 4. Der Nachweis der Lebensfähigkeit und Funktion der Leber Sphäroiden bioprinted in der leberspezifischen Hydrogel bioink. A) Die Umsetzung der Leber bioink für Bioprinting, führte zu hohen Lebensfähigkeit Konstrukte. Green - Calcein AM-gefärbten lebenden Zellen; Rot - Ethidiumhomodimer-gefärbten toten Zellen B) Harnstoff und C) Albumin abgesondert von Leber - Konstrukte über 14 d.ays in Kultur, quantifiziert durch kolorimetrische und ELISA-Assays sind. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Immunfärbung von Markern mit Lebergewebe verbunden sind : D) CYP3A4, E) Intrazelluläre Albumin und F) DPP4 und E-Cadherin. Grün oder Rot - angezeigt Fleck; Blue -. DAPI <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53606/53606fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K Aufrufe.  Wake Forest Univeristy Health Sciences.  Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann. 

Serie: Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Biotechnik

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Weiterentwicklung des 3D-Bioprintings mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Medium

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic scaffolds. However, engineering a suitable gel suspension medium that balances precise bioink deposition with cell viability and function presents multiple challenges, particularly in achieving the desired viscoelastic properties. Here, a novel &#954;-carrageenan gel supporting bath is fabricated through an easy-to-operate mechanical grinding process, producing homogeneous sub-microscale particles. These sub-microgels exhibit typical Bingham flow behavior with small yield stress and rapid shear-thinning properties, which facilitate the smooth deposition of bioinks. Moreover, the reversible gel-sol transition and self-healing capabilities of the &#954;-carrageenan microgel network ensure the structural integrity of printed constructs, enabling the creation of complex, multi-layered tissue structures with defined architectural features. Post-printing, the &#954;-carrageenan sub-microgels can be easily removed by a simple phosphate-buffered saline wash. Further bioprinting with cell-laden bioinks demonstrates that cells within the biomimetic constructs have a high viability of 92% and quickly extend pseudopodia, as well as maintain robust proliferation, indicating the potential of this bioprinting strategy for tissue and organ fabrication. In summary, this novel &#954;-carrageenan sub-microgel medium emerges as a promising avenue for embedded bioprinting of exceptional quality, bearing profound implications for the in vitro development of engineered tissues and organs.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung von homogenen κ-Carrageen-Sub-Mikrogel-Bädern für hochauflösendes 3D-Bioprinting

This study introduces a novel &#954;-carrageenan sub-microgel suspension bath, displaying remarkable reversible jamming-unjamming transition properties. These attributes contribute to the construction of biomimetic tissues and organs in embedded 3D bioprinting. The successful printing of heart/esophageal-like tissues with high resolution and cell growth demonstrates high-quality bioprinting and tissue engineering applications.

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic ...

Ingenieurwesen

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Zusammenfassung

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Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks