The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Rückdruck unterstützt Roboter - Dispensorsystem (1A) als Oberflächenätzung (1B) und Extrusionsbasis bioprinter (1C) 10. 1. Änderung eines Polystyrol-Oberfläche <ol><li> Verwenden Sie 1 mm Polystyrolplatten, da Polystyrol-Gewebekulturplatten neigen dazu, nach oben in der Mitte zu beugen, ruinieren die Höhe Konsistenz beider Ätzen und Drucken. Hinweis: Da die Polystyrolplatten nicht für Zelladhäsion modifiziert sind, eine Plasmabehandlung durchgeführt wird. </li><li> Sauerstoffplasmabehandlung. <ol><li> Wählen Sie zunächst einen Druck von 2 bar auf den Regulator des Sauerstoffflasche auf dem Plasma-Maschine angeschlossen. Dann schalten Sie den Plasma-Maschine auf und geben Sie die folgenden Bedingungen in das Bedienfeld der Maschine: 150 W, 30 SSCM Sauerstoff, 10 min (für Strom, Gasströmung und Zeit beziehungsweise). </li><li> Legen Sie das Polystyrol substrate in die Plasmakammer, die Tür verschließen und den Startknopf auf dem Bedienfeld drücken. Einweichen des Sauerstoffplasma behandelt Polystyrolsubstrat in fötalem Rinderserum und inkubieren bei 37 ° C für 2 h vor dreimal 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen (PBS). </li></ol></li></ol> 2. Programmierung Print Patterns <ol><li> Verwenden Sie das Programm zunächst Etch die Oberfläche mit einem Stylus oder Skalpell. <ol><li> Wenn Sie einen Stift verwenden, legen Sie einen Durchmesser von 1,5 mm Textil-Nadel (von innen mit großer Sorgfalt) in die Düse einer Abgabespritze (entweder 5 oder 10 ml), bis er eingeklemmt und gesichert wird. Bei Verwendung eines Skalpells, wählen Sie eine Runde behandelt Skalpell so dass er in den Klemmmechanismus des Druckarmes befestigt werden kann. HINWEIS: Der Stift gekrümmte Muster besser als die Skalpellklinge ätzt. </li><li> Wenn zuerst eine bioprinted Anordnung zu schaffen versucht, skizzieren das gewünschte Muster auf Millimeterpapier mit nummerierten Achsen der XY-Koordinaten zu erzeugen. Dann input die Koordinaten des geätzten / bioprinted Muster in das Tabellenkalkulationsprogramm (Abbildung 2). HINWEIS: Die &quot;gewünschte Muster&quot; kann in vielen verschiedenen Formen sein, wie beispielsweise linear, S-förmig oder kreisförmig. Die Wahl hängt von dem experimentellen Modell erforderlich ist, wie beispielsweise parallele lineare Linien für die Differenzierung von MSCs zu Cardiomyozyten wie hier demonstriert. Die Streudiagramm-Funktion ermöglicht die Visualisierung der vorgeschlagenen Handlung Muster. </li><li> Öffnen Sie die Druck / Ausgabe-Software. Wählen Sie &quot;Programm&gt; Programm hinzufügen&quot;, gefolgt von &quot;Bearbeiten&gt; Punkt hinzufügen&quot;, um das Programm einzurichten. Exportieren Sie die x- und y-Koordinatenwerte aus der Tabelle in den erhaltenen Druck / Spende Software die Verwendung von &quot;Copy and Paste&quot; Funktion. </li><li> Kalibrieren Sie die &quot;z&quot; Höhe des Roboters vor jedem Lauf, um den Stift / print Düse auf die Oberfläche zu platzieren. <ol><li> In der Druck- / Spende Software, wählen Sie die &quot;Robot&quot; Option, klicken Sie auf &quot;Ändern Mode &amp;# 34; und aktivieren Sie die &quot;Lernmodus&quot; -Option. Einmal ausgewählt, ermöglicht die Software die Funktion &quot;Tippen&quot; des Roboters. </li><li> Joggen, initialisieren zuerst den Roboter in seine Standardposition, indem Sie die folgenden Befehle in der Menüleiste ausgewählt wird; &quot;Robot&gt; Meca initialisieren&quot;, und wählen Sie &quot;Robot&gt; Jog&quot;. Eingabe der numerischen Werte (in mm) in den &quot;X und Y Slots&quot; erforderlich, um den Stift genau auf den Ursprung des Musters zu platzieren. </li><li> Als nächstes Eingang in der &quot;Z-Slot&quot; ein Zahlenwert (in mm) mit der Oberfläche mit dem Stift oder Druckdüse in Kontakt zu bringen, aber nicht biegen oder die Oberfläche einrücken. Dieser Punkt wird als &quot;Z&quot; Startwert bezeichnet. HINWEIS: Die Tiefe jeder Rille kann leicht die Z-Höhe des Systems unter Verwendung variiert werden. Nuten 40, 80 und 170 &amp; mgr; m gezeigt , in die Oberfläche von 1 mm dicke Polystyrolplatten (4 und Tabelle 1) zu schneiden. </li></ol></li><li> Wählen Sie die prucken Anweisung für jede der Koordinatenpunkte, das heißt &quot;Start of Line Dispense&quot; den ersten Punkt und Druck Einleitung zu definieren &quot;Linie , die&quot; die Zwischenpunkte zu bestimmen und &quot;End of Line Dispense&quot; an den Roboter zu signalisieren , das zu beenden Druckauflage. </li><li> Kommunizieren Sie das Programm an den Roboter durch die Folgebefehle in der oberen Menüleiste auswählen: &quot;Robot&gt; Senden C &amp; T Data&quot;. </li><li> Starten Sie die Radierung / Druckauflage durch den Roboter in die Betriebsart &quot;Run&quot; zu ändern. Tun Sie dies, indem Sie &quot;Robot&gt; Ändern Modus&gt; Run-Modus&quot; in der oberen Menüleiste. </li><li> Starten Sie den Druckvorgang mit der grünen &quot;Start-Taste&quot; auf dem Roboter Spender Konsole drücken. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung und Druck von zellhaltigen Gelatine Bioink <ol><li> Löse 2% Gelatine in Minimum Essential Medium Alpha Medium (&amp; agr; MEM) (mit 10% FBS ergänzt und 2% Antibiotikum / antimycotic) bei 60 ° C für 2 Stunden die bioink Lösungen herzustellen. </li><li> Vorkultur der Red Fluorescent Protein exprimieren mesenchymalen Stammzellen (RFP-MSCs) bis 70% Konfluenz in 10 cm Gewebekulturschalen mit &amp; agr; MEM / 10% FBS. Lösen der anhaftenden Zellen in Suspension durch Entfernen des Mediums und Beschichtung mit 1x Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 × g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Zellpellet in 0,5 ml 1x PBS und die Zelldichte zählen eine Zählkammer. </li><li> Nachdem man die bioink auf Raumtemperatur abkühlen, sanft in einem ausreichenden Volumen , um die Aussetzung der RFP-MSCs in den bioink mischen , um eine Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen ml -1 zu erreichen. </li><li> Gießen Sie die Zelle Lager bioink in eine Druckspritze mit der Düse verschlossen. Kühlen Sie das geladene Spritze auf 4 ° C, um eine druckbare Viskosität zu erreichen. </li><li> Legen Sie die geladene Spritze auf dem automatisiertenRoboter-Abgabesystem und befestigen Sie die Luftdruckleitungen. Entfernen Sie die Spritze Luer Dichtung und befestigen Sie die Druckdüsen. </li><li> Auspressen cellularized bioinks in dünne Linien unter Verwendung von 0,05 MPa Rückdruck, bei 5 mm / sec Schreibgeschwindigkeit von 10 ml Spritze über eine 27 G-Nadel / Düse (konisch über zylindrische empfohlen) auf eine Polystyrolfolienoberfläche nach dem vorprogrammierten Ablagerung Muster in Schritt 2.1 beschrieben, um die cellularized bioink auf die vorgeätzten Rillen zu platzieren. </li><li> Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur, mit 10 ml Wachstumsmedium (mit 10% FBS ergänzt und Antibiotika) und Inkubieren der Zellen für 24 h (die Zellen zu erlauben, auf die geätzten Merkmale zu erfassen und reagieren) vor der Anzeige unter Verwendung eines invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung. </li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interest.

Der entscheidende Schritt dieses Verfahrens ist die tatsächliche Bioprinting Lieferung der Stammzellen, da der Prozess zu den Merkmalen Zellsedimentation erlauben müssen, drucken, ohne bioink Verbreitung / Blutungen, liefern Zellen, ohne den Tod Schubspannung Zelle und nicht die Differenzierung gegenüber unerwünschten Linie auslösen. Wenn die erwartete Zellenausrichtung ausbleibt, dann sollte die bioink Viskosität für ihre Eignung für den Druck beurteilt werden. Es ist wichtig, dass die bioink die Zellen ermöglicht, auf die strukturierte Polymeroberfläche zu sedimentieren. Die Konzentration des Polymers bioink verringert oder seine Temperatur (bis maximal 37 ° C) erhöht werden, die Viskosität zu verringern und Zellzentrifugation fördern. Jedoch können diese Kürzungen die bioink verursachen / Entlüftungsdrucknachbearbeitung zu verbreiten. Hier empfehlen wir die Verwendung von 2% Gelatine (w / v) in 1x PBS gelöst. Wenn die Zellkonzentration nach dem Drucken reduziert erscheint, dann ist die Scherbeanspruchung durch Druck induzierte haben die kompromittierteLebensfähigkeit der gedruckten Zellen 7. Überprüfen Sie die Zellen in der bioink vor und nach dem Drucken einer Lebensfähigkeitstest , wie beispielsweise die Aktivierung von Resazurin Fluoreszenz 7 verwendet wird . Außerdem, wenn bioprinted Stammzellen die Oberfläche berühren, aber nicht ausgerichtet, so ist es möglich, die Scherspannung während des Druckens ihre Multipotenz verringerten sich um eine unerwünschte Differenzierungsweg auszulösen. Post Druck stemness kann durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Analyse unter Verwendung von Stammzellmarker wie CD 29 10,19,20 beurteilt werden. Wenn es, dass die Scherspannung gefunden wird eilige Auswirkungen auf die Zellen hat, dann kann die bioink Druckviskosität durch Hinzufügen oder Ersetzen des bioink Polymer mit einem Scher reduziert werden, um eine Verdünnung, wie Alginat, Pluronic F127, Hyaluronsäure, Gellangummi, Gelatine - Methacrylat oder Polyethylenoxid 19, 21-25. Schließlich werden andere Aspekte, die optimiert werden können, umfassen die Druckgegendruck, bioink Zelldichte,und Düsendurchmesser. Der Gegendruck erfordert die Optimierung der Viskosität des bioink und verändert werden können, eine diskrete ununterbrochene Spur zu erhalten. Eine hohe Zellkonzentration kann die bioink Viskosität erhöhen und den Druckkopf verstopfen. Allerdings ist diese Extrusionsverfahren zum Bedrucken von relativ höheren Zelldichten als andere Methoden Bioprinting 26,27 ermöglichen. Die Auswahl des Druckdüsenmesser sollte, da Düsen mit kleinem Durchmesser in Betracht gezogen werden können, um eine feinere trace erzeugen jedoch zum Verstopfen neigen. Tapered Düsen wurden funktionieren besser gefunden , da die gleiche Strömungsrate als eine zylindrische Düse erreicht werden kann , aber bei einer geringeren Scherbeanspruchung somit die Lebensfähigkeit der Zellen verbessert , 28. Der Gegendruck unterstützte Abscheidungsverfahren, auch als Extrusions Bioprinting, hat eine geringere Auflösung als die anderen Zelldruck Ansätze wie Tintenstrahl- und Laser-unterstützte Methode aufgrund der minimalen programmierbaren Schrittlänge und die Ausbreitung des emerging bioink. Jedoch wird die Gegendruckextrusionsausrüstung am leichtesten für die Aufnahme eines Ätzens stylus modifiziert. Andere Verfahren zur Herstellung von Nuten , wie beispielsweise Mikrostrukturierungsphotolithographie durch PDMS Form unter Verwendung von signifikant mehr Schritte als der Roboter Ätzen und das Verfahren ist weniger vielseitig an bestehenden Mustern Modifizieren oder Herstellung neuer 12,15,29-31. Dieses Verfahren bietet ein Werkzeug zur in vitro Untersuchung von Zell - Interaktionen , wo die Position, Ausrichtung und Anordnung von einem oder mehreren Zelltypen wichtig sind. Mehrere Zelltypen , einschließlich von mesenchymalen Stammzellen, Fibroblasten und glatten Muskelzellen , sind bekannt auf Oberflächennuten 1,10,14,18 auszurichten. Die geätzten Mustern, hier dargestellt wird, kann sehr schnell und mit Leichtigkeit geändert und neu gedruckt werden. Dies ist von Interesse, da Oberflächenstrukturierung mit Nuten in dem Studium der Zelladhäsion, Morphologie, Migration und Differenzierung von Stammzellen verwendet. Des Weiteren it wurde auch auf Nerven- und Muskel - Skelett - Gewebe - Engineering 18, 32,33 angewendet. Da die Nuten eine Rolle in der Zelldifferenzierung oder Phänotyp Regelung für mehrere Zelltypen spielen tun, kann dieses Verfahren zu schaffen Nuten verwendet werden, die Differenzierung zu unterstützen, und die Zellen in diskreten Zeilen abzuscheiden, so dass Bildschirmen durchgeführt werden kann. Gegenwärtig prüfen wir diese Methode anisotropen Zellenanordnung von Zellen zur Herstellung von Kardiomyozyten Zellschichten zu fördern, wie die zelluläre Orientierung wichtig für die Funktion des Herzgewebes ist 12-14,34. Der Ansatz demonstriert hier beschäftigt eine lösliche bioink, die schließlich zerstreuen. Wenn jedoch eine dauerhaftere Hydrogel Abdeckung erforderlich ist, die Aufnahme von mikrobiellen Transglutaminase kann vernetzen und Protein - Hydrogele, wie Gelatine basiert sind , ohne nachteilige Auswirkungen auf die 9 - Zellen zu stabilisieren, 35. Bioinks können auch methacrylierten Polymere verwenden , für UV crosslinkin initiiertg Zelllager Hydrogele in cytocompatible Weise 36. Doch in unserer Erfahrung, dass die Transglutaminase Vernetzung für eine verbesserte Interaktion gefunden wurde Fläche zwischen dem Hydrogel und Polymer übertragen (weniger leicht delaminiert) und einer mehr cytocompatible Umgebung im Vergleich zu Poly (Ethylenglycol) diacrylat (PEGDA) Hydrogel - 37.

Die gezielte Strukturierung von Zell Platzierung ermöglicht die Bildung von Kulturen , die 1 in vivo zellulären Organisation zu imitieren. Tatsächlich Erforschung der Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen können durch die Organisation ihrer räumlichen Anordnung 2,3- unterstützt. Die meisten Strukturierungssysteme beruhen auf Oberflächenmodifikation Verfahren zur Förderung oder Zelladhäsion mit anschließender passiver Zellaufbringeinrichtung zu verhindern. Bioprinting bietet räumliche und zeitliche Kontrolle über Zellverteilungen 1. Zusätzlich zu diesen Funktionen, Bioprinting wurde zur Erzeugung von geometrisch komplexen Gerüsten 4 als eine technisch einfache, schnelle und kostengünstige Methode beschrieben. Es nutzt Design - Software - Computer und ermöglicht die Einführung von Zellen in dem Herstellungsverfahren 4. Bioprinting Systeme kategorisiert auf der Grundlage ihrer Arbeitsprinzipien als laserbasierte, Inkjet-basierten oder Extrusionsbasis 4. Extrusion Bioprinting wurde als der vielversprechendste beschrieben , da sie die Herstellung von Konstrukten organisiert klinisch relevanter Größen innerhalb eines realistischen Zeitrahmen 4-6 ermöglicht. Es wird entweder durch mechanische oder Gegendruck unterstützt Extrusion einer Zelle Lager Hydrogel bioink durchgeführt. In dem hier vorgestellten Verfahren wurde Gegendruck eingesetzt. Wie erwähnt, werden die Zellen in einem cytocompatible bioink geliefert. Eine solche bioink sollte die Lieferung von Zellen ohne Erzeugung schädlicher Scherspannung unterstützen, und sein einer ausreichenden Viskosität , die Integrität der gedruckten Bahn zu halten, ohne zu kollabieren oder Spreiz (bezeichnet als &quot;Ausbluten&quot;) , 7-10. Die Wechselwirkung von Zellen mit ihrer Haftfläche ist bekannt, Zellverhalten zu beeinflussen. Die Topographie Oberfläche kann steuern die Zellform, Orientierung 11 und auch den Phänotyp. Insbesondere haben die Herstellung von Nuten und Kanälen gezeigt, zu induziereneine gestreckte, längliche Morphologie auf mehreren Zelltypen. Die Annahme dieser Morphologie wurde mit dem Phänotyp von multi- und pluripotenten Zellen zu beeinflussen gefunden. Wenn zum Beispiel auf Rillen ausgerichtet sind , zeigen mesenchymalen Stammzellen (MSC) den Nachweis der Differenzierung zu Kardiomyozyten 12,13 und glatten Gefäßmuskelzellen übernehmen die Kontraktions Phänotyp über den synthetischen 10,14-17. Die Zellkanäle oder Nuten ausrichten können über eine Anzahl von Verfahren auf einer Polymeroberfläche erzeugt werden, beispielsweise tiefes reaktives Ionenätzen, Elektronenstrahllithographie, Laserdirektdruck, Femtosekundenlaser, Photolithographie und Trockenätzen im Plasma 18. Diese Ansätze sind oft zeitaufwendig, erfordern eine komplexe Vorrichtung und kann in der Form des Musters erzeugt werden, zu begrenzen. Darüber hinaus synchronisiert sie nicht Musterung mit Bioprinting und nicht für den sofortigen Zellularisierung ermöglichen. Die koordinativ kontrollierte Bewegung eines automatisiertenAbgabesystem kann für die Abscheidung von Lösungen komplexer Muster folgen. Hier zeigen wir, wie die mikroskaligen gesteuerte Bewegung genutzt werden können Kanäle für die Zell Orientierung zu schaffen. Ein geschärfte Stift oder Skalpell wird an den Druckkopf anstelle der Extrusions Spritze befestigt und das Gerät kann dann die Polymeroberfläche unter der Anleitung der Software zur grafischen Darstellung ätzen. Das Verfahren bietet Vielseitigkeit in Musterentwurf und ist anwendbar auf polymere Materialien, die üblicherweise in Bioengineering verwendet, wie Polystyrol, PTFE, und Polycaprolacton. Als weiteren Schritt zum Ätzen können die Zellen auf die zerkratzte Nuten bioprinted direkt. Die Gelatine bioink hier verwendete konnte sowohl die Spur halten und die abgeschiedenen Zellen ermöglichen, die geätzten Strukturen zu erfassen. Mesenchymalen Stammzellen auf die geätzten Nuten bioprinted wurden an ihnen entlang in verschiedene Linien zu verlängern demonstriert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="448">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">Robotic Dispensing System</td>
			<td style="width:131px;">Janome</td>
			<td style="width:104px;">2300N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Plasma Machine</td>
			<td style="width:131px;">Femto Science</td>
			<td style="width:104px;">Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">USB Microscope</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Optical Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Olympus</td>
			<td style="width:104px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Software</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:131px;">Excel</td>
			<td style="width:104px;">Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">Printing Co-ordinate Software</td>
			<td style="width:131px;">Janome</td>
			<td style="width:104px;">JR C-Points</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">Imaging Software</td>
			<td style="width:131px;">National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td style="width:104px;">ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Stylus (Blade)</td>
			<td style="width:131px;">OLFA</td>
			<td style="width:104px;">AK-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">5ml printing syringe</td>
			<td style="width:131px;">San-ei Tech</td>
			<td style="width:104px;">SH10LL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">30G printing needle</td>
			<td style="width:131px;">San-ei Tech</td>
			<td style="width:104px;">SH30-0.25-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">1mm polystyrene sheets</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;">Purchased locally</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:104px;">10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:151px;">Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">41061-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Antibiotc antimycotic</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:151px;">Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs)</td>
			<td style="width:131px;">Cyagen Biosciences Incorporation</td>
			<td style="width:104px;">RASMX-01201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated robotic dispensing technique for surface guidance and bioprinting of cells

Dieses Manuskript beschreibt die Einführung von Zell Führung Merkmale durch die direkte Lieferung von Zellen auf diese Funktionen in einem Hydrogel bioink unter Verwendung eines automatisierten Roboter-Abgabesystem verfolgt wird. Die besondere bioink ausgewählt wurde, wie es Zellen erlaubt, in Richtung zu sedimentieren und die Merkmale erfassen. Das Abgabesystem bioprints lebenden Zellen in Hydrogel bioinks einen Gegendruck unterstützt Druckkopf verwendet wird. Doch durch den Druckkopf mit einem geschärften Stift oder Skalpell ersetzt wurde, kann das Abgabesystem auch topographische Hinweise durch Anätzen zu erstellen verwendet werden. Der Taststift Bewegung kann in Schritten von 10 &amp; mgr; m in der X, Y und Z-Richtung programmiert werden. Die gemusterte Nuten konnten mesenchymalen Stammzellen zu orientieren, beeinflussen sie eine längliche Morphologie in Ausrichtung mit den Nuten &#39;Richtung zu übernehmen. Die Strukturierung könnte entworfen werden unter Verwendung von Software zur grafischen Darstellung in geraden Linien, konzentrischen Kreisen und Sinuswellen. In einem nachfolgenden Verfahren, FibroBlasten und mesenchymalen Stammzellen wurden in einer 2% igen Gelatine bioink suspendiert, in einem Gegendruck angetrieben Extrusionsdruckkopf Bioprinting. Die Zellenlager bioink wurde dann gedruckt die gleichen programmierten Koordinaten für das Ätzen verwendet. Die bioprinted Zellen waren in der Lage zu den geätzten Merkmalen zu erfassen und darauf zu reagieren, wie durch ihre gedehnten Orientierung entlang der Richtung der geätzten Rillen gezeigt.

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen , dass der Gegendruck unterstützt Roboterabgabesystem kann sowohl Oberfläche als Extrusionsbasis bioprinter verwendet werden Ätzen für die Durchführung und bioink Druck (Abbildung 1 A). Es kann für die Erzeugung von geätzten Rillen in Polymeroberflächen verwendet werden, und anschließend zu den Merkmalen (1 B und C) eine Zelle Lager bioink direkt zu drucken. Sowohl das Ätzen und Drucken werden durch die programmierten Koordinaten (Abbildung 2) Eingabe in die Druck / Ausgabesoftware bestimmt , die das Drucken von linear ermöglicht, gebogen und radial Muster wie für die Anwendung erforderlich ist (Abbildung 3 AC). Die Z-Achsen - Einstellungen können für die Steuerung der geätzten Rillentiefe (Figur 4 und Tabelle 1). Nach dem Austauschder Taststift mit einem Hydrogel - Druckkopf, der Programmierung , die das Ätzen koordiniert könnte die Roboter - Dispensorsystem liefern die Zellenlager bioink direkt auf die geätzten Rillen nach dem gleichen Design (Figur 3 D und E) zu ermöglichen , wiederverwendet werden. Wie in Figur 5 A und B beobachtet werden, ausgesät die Stammzellen durch in der bioink schließlich Sediment an der Oberfläche Bioprinting und abzufühlen und entlang der Richtung des Ätzens innerhalb diskreten Leitungen verlängern. Die Zellen in Kulturmedium ausgesät , ohne in Richtung der Merkmale ausgerichtet Bioprinting jedoch bedeckt sie die gesamte Oberfläche (Figur 5 C), was beweist , dass die bioink die Zellen an der gedruckten Bahn beschränkt. Ohne geätzten Strukturen, in Kulturmedien ausgesäten Zellen zeigen keine Orientierung oder Ausrichtung (Abbildung 5 D). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig1.jpg" /> Figure . 1: Die automatisierten Roboter - Abgabesystem (A) Die Apparatur wurde mit der Aufnahme von einem geschärften Stift angepasst von zentraler Bedeutung für den Druckkopf (in einer Spritze befestigt) , die konzentrische Ringe auf einen Polystyrol - Schieber (B) ätzt. Der Druckkopf könnte dann umgewandelt werden , um Zelllager Gelatine bioink zu extrudieren, mit Rückstau Extrusion unterstützt, und Ablagerung auf der zuvor geätzten Muster (C). Diese Zahl wurde von Bhuthalingam et al modifiziert. 2015 10. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig2.jpg" /> Abbildung 2: Grafische Darstellung xy - Koordinaten in einem Tabellenkalkulations - Software Der Bildschirm greifen hier gezeigten zeigt , dass die aufgetragen xy eine Sinuswellenmuster - Koordinaten , wie durch die Kurvendarstellung gezeigt.. Diese Koordinaten eingegeben wurden in die Software zur grafischen Darstellung der Kopie / PasteFunktion. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Ätzmuster Vielseitigkeit Die Koordinaten in das Plotten Software programmiert konnten linear zu ätzen (A), sinusförmigen (B) und konzentrische Kreise (C). Die Rillen in Polystyrol geätzt direkt auf mit dem Hydrogel bioink während dem nachfolgenden Schritt (D) und (E) gedruckt werden. Diese Zahl wurde geändert von Bhuthalingam et al. 2015 10. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig4.jpg" /> Abb . 4: Etched Nuttiefe Die Tiefe der geätzten Nut kann von der z-Achsen - Steuerung des Abgabesystems geregelt werden. Bilder (A) bis (C) zeigen die Draufsicht und(D) bis (E) zeigen den Querschnitt. Der Roboter wurde programmiert , um die Oberfläche bis zu einer Tiefe von 40 ((A) und (D)) zu ätzen, 90 ((B) und (E)) und 180 &amp; mgr; m ((C) und (F)). Die Nähe der programmierten Tiefe und tatsächlichen Ätztiefe in Tabelle 1 dargestellt. Diese Zahl hat sich von Bhuthalingam et al modifiziert. 2015 10. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig5.jpg" /> Abbildung 5: Bioink geliefert Mesenchymale Stammzellen Die RFP-MSCs in den bioink auf den geätzten Mustern bedruckt könnten die Merkmale erfassen , wie durch ihre verlängerte Morphologie und Ausrichtung mit den Nuten (A) und (B) gezeigt , im Vergleich zu auf die ausgesäten Zellen. Merkmale ohne bioink (dh in Kulturmedium) (C &lt;/ strong&gt;) und auf einer nicht-strukturierten Oberfläche (D). Diese Zahl wurde geändert von Bhuthalingam et al. 2015 10. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Programmierte Tiefe (um) </td><td> Geätzte Rillentiefe (um) </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 35 ± 7 </td></tr><tr><td> 90 </td><td> 81 ± 6 </td></tr><tr><td> 180 </td><td> 175 ± 3 </td></tr></tbody></table> Tabelle . 1: Vergleich der programmierten und tatsächliche Ätztiefe auf Polystyrol Diese Zahl wurde von Bhuthalingam modifiziert et al 2015 10..

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Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

automated-robotic-dispensing-technique-for-surface-guidance

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.3K Aufrufe.  Nanyang Technological University. This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Serie: Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Forschung

Biotechnik

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is conducted by eliciting an illusion through use of a mirror as if the hemiplegic arm is moving in real-time while moving the healthy arm. It can facilitate brain neuroplasticity through activation of the sensorimotor cortex. However, conventional mirror therapy has a critical limitation in that the hemiplegic arm is not actually moving. Thus, we developed a real-time 2-axis mirror robot system as a simple add-on module for conventional mirror therapy using a closed feedback mechanism, which enables real-time movement of the hemiplegic arm. We used 3 Attitude and Heading Reference System sensors, 2 brushless DC motors for elbow and wrist joints, and exoskeletal frames. In a feasibility study on 6 healthy subjects, robotic mirror therapy was safe and feasible. We further selected tasks useful for activities of daily living training through feedback from rehabilitation doctors. A chronic stroke patient showed improvement in the Fugl-Meyer assessment scale and elbow flexor spasticity after a 2-week application of the mirror robot system. Robotic mirror therapy may enhance proprioceptive input to the sensory cortex, which is considered to be important in neuroplasticity and functional recovery of hemiplegic arms. The mirror robot system presented herein can be easily developed and utilized effectively to advance occupational therapy.

We developed a real-time mirror robot system for functional recovery of hemiplegic arms using automatic control technology, conducted a clinical study on healthy subjects, and determined tasks through feedback from rehabilitation doctors. This simple mirror robot can be applied effectively to occupational therapy in stroke patients with a hemiplegic arm.

Roboter-Spiegel-Therapiesystem für die funktionelle Erholung von Hemiplegischen Arme

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipulation von einzelnen neuronalen Stammzellen und Neuronen in Gehirnscheiben mit Robotik-Mikroinjektion

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.