Die Autoren danken Dr. JJ van der Klink für die Unterstützung bei der Auswahl und Montage der Ausrüstung, sowie Dr. F. Kateb und Dr. G. Bertho für nützliche Diskussionen. AC wurde von der Swiss National Science Foundation (Grant PPOOP2_157547) unterstützt. Wir erkennen Finanzierung von Paris Sorbonne Cité (NMR @ Com, DIM Analytics, Ville de Paris, der Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708) und der Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Unser Team ist Teil Equipex Programme Paris-en-Resonanz und CACSICE.

HINWEIS: Alle Analysedaten wurde kommerzielle Software durchgeführt werden. 1. Bereiten Sie die polarisierende Lösung <ol><li> Bereiten 2 ml einer 1,12 M 13 C-markierten Natriumpyruvat (Na + [CH 3 -CO- 13 COO] -, Substrat) Lösung, dotiert mit 33 mM TEMPOL Radikal (4-Hydroxy-2,2,6,6- tetramethylpiperidin-1-oxyl, Polarisationsmittel) 4 in 2: 1 D 2 O / d 6 ethanol für 13 C-Beobachtungen. ACHTUNG: Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung muss aufgrund der Entflammbarkeit von d 6 ethanol genommen werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Radikalkonzentration im Hinblick auf die erzielten Polarisation optimal ist. <ol><li> Ändern Sie leicht die radikale Konzentration der Lösung im Punkt 1.1 (beispielsweise bis 30 mm oder 35 mm). </li><li> Bestimmen iterativ die Solid-State-Erweiterung (siehe Schritt 3) und finden die radikale Konzentration, die zur maximalen Verbesserung führt. </li></ol></li></ol> 2. PolarizatIon <ol><li> Senken Sie die DNP Kryostat-Temperatur durch das Abkühlungsverfahren. Klicken Sie auf die &quot;Abklingzeit&quot; -Taste auf dem Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li><li> Sammeln von flüssigem Helium in der DNP Kryostaten durch den Füllvorgang. Klicken Sie auf die &quot;Füllung&quot;, um auf den Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li><li> Platzieren 300 ul des optimierten Polarisations Lösung aus Schritt 1.1 in den Probenbehälter mit dem DNP Polarisator vorgesehen. Frieren Sie den Probenbehälter mit der Probe im Inneren indem Sie es vorsichtig in einem Bad aus flüssigem Stickstoff getaucht. </li><li> Beseitigen des flüssigen Stickstoffs, die durch Extraktion der Probenbehälter aus dem Bad aus flüssigem Stickstoff und Drehen der Oberseite nach unten nach dem Gefrieren Prozedur (Schritt 2.3) in dem Probenbehälter vorhanden sein können. Hinweis: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, eine gründliche Lösung der Probe zu erhalten (siehe Schritt 5). </li><li> Legen Sie die Probe in den Kryostaten. Hinweis: Dieses Step, bestehend aus den folgenden Unterschritt muß schnell durchgeführt werden (dh in weniger als 10-20 sec), um die Probe vor dem Schmelzen zu verhindern. <ol><li> Setzen Sie den Probenbehälter in den Probenhalter. Setzen Sie den Probenhalter in der Haupt Kryostaten Einsatz. Legen Sie die Mikrowellen-Wellenleiter in den Probenhalter. </li></ol></li><li> Senken Sie die Kryostat-Temperatur durch Starten des 1 K Kühlverfahren. Klicken Sie auf &quot;1K Kühl&quot; -Taste auf dem Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li><li> Schalten Sie die Mikrowellenquelle auf und die Probe bestrahlen. Klicken Sie auf &#39;MW-ON &quot;-Taste auf dem Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li></ol> 3. Festkörper-NMR-Messungen <ol><li> Ziehen Sie das Koaxialkabel des NMR-Konsole Detektionskanal des Spektrometers Spule durch den Stecker gegen den Uhrzeigersinn rotierenden um 90 ° und ziehen es. Stecken das Koaxialkabel des Detektionskanal zu dem Koaxialverbinder des KryostatenNMR-Spule. Setzen Sie den Stecker des NMR-Konsolenkabel in die Buchse des Kryostaten NMR-Spule, die Aufmerksamkeit auf die Ausrichtung Stift zahlen; Drücken Sie, und um 90 ° drehen den Stecker im Uhrzeigersinn. </li><li> Messen Sie die NMR thermische Signal in der Festkörper am Standort Kryostaten eine einfache Puls-acquire Sequenz mit unkalibrierten niedrig Flip-Winkelimpulse wiederholt in einem Intervall von T = 5 min verwenden. Nach der Messung der Einrichtung, in der Befehlszeile der Software &#39;zg&#39; schreiben, und drücken Sie die Tastaturtaste &quot;Enter&quot;. Wenden Sie sich an NMR-Spektrometer Bedienungsanleitung für weitere Einzelheiten über Spektrometer Betrieb und Messaufbau. </li><li> Messen Sie die DNP-verstärkten NMR-Signal. Wiederholen Sie die Schritte von Schritt 3.2 nach dem DNP-Prozess initiiert, wie in Abschnitt 2 beschrieben. </li><li> Trennen Sie das NMR-Konsole Detektionskanal Koaxialkabel aus dem Kryostaten NMR-Spule durch den Stecker gegen den Uhrzeigersinn rotierenden um 90 ° und ziehen es. Stecken Sie das Koaxialkabel des detection Kanal zu dem Koaxialverbinder des Spektrometers Spule. Setzen Sie den Stecker des NMR-Konsolenkabel in die Buchse des Spektrometers Spule, die Aufmerksamkeit auf die Ausrichtung Stift zahlen; Drücken Sie, und um 90 ° drehen den Stecker im Uhrzeigersinn. </li></ol> 4. Optimieren Sie die Homogenität des Hauptmagneten Field ( &quot;Unterlegbleche &#39;) <ol><li> Platzieren in dem Spektrometer ein Röhrchen mit 500 ul Mischung in früheren Experimenten erzeugt (das heißt, nach Schritt 6.2). </li><li> Führen NMR-Spektrometer Shim durch die aktuelle Variation in den Trimm-Gradientenspulen für die maximale suchen &#39;sperren&#39; Signal von Deuterium. Wählen Sie den entsprechenden Trimmspule durch die entsprechende Taste auf der NMR-Konsole schieben. <ol><li> Drehen Sie den Knopf auf der NMR-Konsole, um die Drehrichtung zu bestimmen, die das Sperrsignal erhöht. Weiter drehen, bis das Signal ein Maximum erreicht. Wählen Sie ein anderes Trimmspule und wiederholen Sie die Maximierung unbis ein lokales Maximum für alle Trimmspulen gefunden wird. Wenden Sie sich an NMR-Spektrometer Bedienungsanleitung für weitere Details. Am Ende, entfernen Sie die Probe zur Verriegelung verwendet. </li></ol></li></ol> 5. Die Auflösung <ol><li> Legen 5 ml D 2 O in der Auflösung Einsatz Kessel. Unter Druck setzen und den D 2 O mittels der Widerstandsdraht erwärmt, bis T ≈ 180-200 ° C erreicht wird. Klicken Sie auf das &quot;Vorbereiten Heater&quot; -Taste auf dem Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li><li> Nach Beendigung der Probenpolarisationsverfahren (beispielsweise nach 3 T DNP), unter Druck der Kryostat etwas über Raumdruck. Klicken Sie auf die &quot;SS-Operations-Taste auf der Kryostat Softwareschnittstelle (2D). Entfernen Sie den Mikrowellenleiter aus der Auflösung Einsatz. </li><li> Gleiten die Auflösung Einsatz (3B) nach unten in den Probenhalter (3A-c). Die Auflösung Einsatz hat den Boden des Probenhalters zu erreichen und fest eine dichte Verbindung mit dem Probenbehälter zu machen, um gedrückt werden müssen D 2 O undicht im Kryostaten zu vermeiden. </li><li> Drücken Sie die Hardware-Trigger (3C-h) die Auflösung Sequenz zu beginnen, eine vorbestimmte Zeitabfolge von pneumatischen Ventilen Operationen. </li></ol> 6. Injection <ol><li> Vor Auflösung Ort ein 5 mm NMR-Röhrchen, das 500 &amp; mgr; l Probe (zB D 2 O für <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> Messung in Schritt 7 oder LDH-Lösung aus Schritt 8 zur enzymatischen Aktivitätsmessungen in Schritt 9), in dem Isozentrum des T 11,74 NMR-Spektrometer (siehe Schritt 4). </li><li> Kurz nach der Auflösung (Schritt 5), Mischung 500 ul hyperpolarisierten Lösung mit der in dem NMR-Spektrometer in Schritt 6.1 gesetzt Probe. <ol><li> Manuelle Injektion: sammeln, um die hyperpolarisiertenLösung am Ende einer 2,5 m langen Rohrweiche in einem Becherglas nahe dem NMR-Spektrometer Magnet platziert. Manuell 500 ul hyperpolarisierte Lösung in das Probenröhrchen durch eine maßgeschneiderte Kapillarsystem NMR injizieren. </li><li> Automatische Injektion: vor dem Auflösungsprozess, schließen Sie das Übertragungsrohr auf eine automatisierte maßgeschneiderte Einspritzvorrichtung, die die hyperpolarisierte Lösung aus dem Heliumgas für die Übertragung verwendet trennt. Das Gerät liefert automatisch 500 &amp; mgr; l von hyperpolarisiertem Lösung in das Probenröhrchen. </li></ol></li></ol> 7. Flüssige-NMR-Messung <ol><li> Nach der Auflösung, messen die NMR hyperpolarisierten Signal aus der Probe in das Spektrometer durch eine Reihe von 10 ° Kippwinkel Puls-acquire Sequenzen von 1,5 sec im Abstand des Fortschreitens der Magnetisierung des Substrats (A) und das Produkt (B) zu folgen. Nach der Messung der Einrichtung, in der Befehlszeile der Software &#39;zg&#39; schreiben und drücken Sie die &amp; #39; Enter &#39;Tastaturtaste. Wenden Sie sich an NMR-Spektrometer Bedienungsanleitung für weitere Einzelheiten über Spektrometer Betrieb und Messaufbau. </li><li> Sobald die Magnetisierung vollständig entspannt (dh nach T = 10 T 1), thermisches Signal durch eine Reihe von 90 ° Kippwinkel Pulssequenzen erwerben die NMR messen Abstand von t = 3 T 1 ≈ 3 min. Nach der Messung der Einrichtung, in der Befehlszeile der Software &#39;zg&#39; schreiben, und drücken Sie die Tastaturtaste &quot;Enter&quot;. Wenden Sie sich an NMR-Spektrometer Bedienungsanleitung für weitere Einzelheiten über Spektrometer Betrieb und Messaufbau. </li></ol> 8. Herstellung von Enzym-haltigen Proben (spezifisch für die Pyruvat-to-Lactat-Transformation) <ol><li> Bereiten Sie die Reaktionspuffer mit folgender Rezeptur: 50 mM reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid (NADH), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1 mM Dithiothreitol (DTT) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH =7.0. </li><li> Bereiten Sie eine Kaninchenmuskel LDH-Lösung 1 U / ml frisch zubereitet in Reaktionspuffer mit 20 ug / ml Rinderserumalbumin, BSA. </li><li> Mischen Sie 478 ul Reaktionspuffer (Schritt 8.1), 20 &amp; mgr; l D 2 O zu ermöglichen Spektrometer Feldstabilisierung ( &quot;Sperr &#39;) und 2 ul LDH-Lösung (Schritt 7.2). </li><li> Legen Sie die 500 ul Lösungsvolumen hergestellt in Schritt 8.3 in ein 5 mm NMR-Röhrchen und setzen Sie den Schlauch in die 500-MHz-NMR-Spektrometer. </li></ol> 9. Vollständige enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messverfahren <ol><li> Bereiten Sie die polarisierende Probe (Schritt 1) ​​und polarisieren sie (Schritt 2). </li><li> Führen Sie auf dem Spektrometer Shim (Schritt 4) und bereiten die enzymatische Probe (Schritt 8). </li><li> Führen die Auflösung (Schritt 5) und der Injektion (Schritt 6). </li><li> Messen einer Reihe von Signalen von der hyperpolarisierten Probe mit 10 ° Kippwinkel Impulse Nahmen Abstand von 1,5 s (Schritt 7). Dieser Schritt ermöglicht das hyperpolarisierte MessSignalabfall und das Signal Anhäufung von Stoffwechselprodukten. </li></ol> 10. Fitting <ol><li> Für jedes Spektrum in Schritt erworben 9.4, identifizieren die Spitzen entsprechend Substrat (A) und Produkt (B) bzw. und integrieren sie (Bestimmung der Fläche der Peaks). Die Spitzen Integrale geben die Kurssignale Magnetisierungszeit (M (A, B) (t), siehe Gleichung 2). </li><li> Unter Verwendung der Lösung der Gleichung (2) bestimmen den Wert F = (R + A k eff ) Aus einem einfachen exponentiellen Anpassung der in Schritt 10.1 integriert Substrat Signals. </li><li> Mit dem Wert F = (R A + k eff ) Bestimmt in Schritt 10.2, k eff und R B aus einer Anpassung des Produktsignals M B (t) mit der Funktion bestimmen, durch die Integration der Gleichung (2) erhalten. Wenden Sie sich an repräsentativen Ergebnisse Abschnitt (Enzymatic Aktivität und Stoffwechselmessungen) für Details auf die Reaktion Modellierung, Anpassung und HF-Korrektur. </li></ol>

<ol>
	<li>Overhauser, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+of+Nuclei+in+Metals.">Polarization of Nuclei in Metals.</a> Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).</li><li>Abragam, A., Goldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+dynamic+nuclear+polarisation.">Principles of dynamic nuclear polarisation.</a> Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395 (1978).</li><li>Wolber, J., Ellner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+highly+polarized+nuclear+spins+in+solution+using+dynamic+nuclear+polarization.">Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization.</a> Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).</li><li>Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+35%+liquid-state+13C+polarization+obtained+via+dissolution+dynamic+nuclear+polarization+at+7+T+and+1+K+using+ubiquitous+nitroxyl+radicals.">Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals.</a> PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).</li><li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+&gt;+10,000+times+in+liquid-state+NMR.">Increase in signal-to-noise ratio of &gt; 10,000 times in liquid-state NMR.</a> PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li><li>Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy.">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).</li><li>Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarized+[2-13C]-Fructose:+A+Hemiketal+DNP+Substrate+for+In+Vivo+Metabolic+Imaging.">Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging.</a> JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).</li><li>Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Rate+Determination+by+Dynamic+Nuclear+Polarization+Enhanced+NMR+of+a+Diels&#8722;Alder+Reaction.">Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels&#8722;Alder Reaction.</a> An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).</li><li>Harrison, C., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+kinetic+models+for+analysis+of+pyruvate-to-lactate+exchange+by+hyperpolarized+13C+NMR.">Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR.</a> NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).</li><li>Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+visualization+of+betaine+aldehyde+synthesis+and+oxidation+using+hyperpolarized+magnetic+resonance+spectroscopy.">In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy.</a> Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).</li><li>Lerche, M. H., Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+dynamic+nuclear+polarization-NMR+on+blood+plasma+for+assays+of+drug+metabolism.">Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism.</a> NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).</li><li>Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Imaging+of+Patients+with+Prostate+Cancer+Using+Hyperpolarized+[1-13C]Pyruvate.">Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate.</a> Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108 (2013).</li><li>Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cancer+Metabolism+by+Imaging+Hyperpolarized+Nuclei:+Prospects+for+Translation+to+Clinical+Research.">Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research.</a> Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).</li><li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarized+Magnetic+Resonance+as+a+Sensitive+Detector+of+Metabolic+Function.">Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function.</a> Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li><li>Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+T-1+limit:+Singlet+nuclear+spin+states+in+low+magnetic+fields.">Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields.</a> PRL. 92 (15), 153003 (2004).</li><li>Carravetta, M., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+long-lived+nuclear+spin+states+in+solution+nuclear+magnetic+resonance.+I.+Singlet+states+in+low+magnetic+field.">Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field.</a> J. Chem. Phys. 122 (21), 214505 (2005).</li><li>Vasos, P. R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+states+to+sustain+hyperpolarized+magnetization.">Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization.</a> PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).</li><li>Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+long-lived+13C2+state+lifetimes+at+natural+abundance.">Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance.</a> JMR. 239, 81-86 (2014).</li><li>Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-lived+nuclear+singlet+state+of+N-15-nitrous+oxide+in+solution.">The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution.</a> JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).</li><li>Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nuclear+Singlet+Lifetime+of+More+than+One+Hour+in+Room-Temperature+Solution.">A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution.</a> Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).</li><li>Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+Persistent+Singlet+State+of+N(2)O+in+Blood+and+Other+Solvents-Potential+as+a+Magnetic+Tracer.">Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer.</a> MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).</li><li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells.">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li><li>Comment, A., van den Brandt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+a+DNP+prepolarizer+coupled+to+a+rodent+MRI+scanner.">Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner.</a> Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).</li><li>Balzan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei. 5966, 1-140 (2013).</li><li>Bornet, A., Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boosting+Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+by+Cross+Polarization.">Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization.</a> JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).</li><li>Bowen, S., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sample+injection+for+hyperpolarized+NMR+spectroscopy.">Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy.</a> PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).</li><li>Cavadini, S., Vasos, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+states+open+the+way+to+longer+time-scales+in+the+measurement+of+diffusion+by+NMR+spectroscopy.">Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy.</a> Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).</li><li>Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+States+in+Multiple-Spin+Systems.">Long-lived States in Multiple-Spin Systems.</a> Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).</li><li>Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+hyperpolarisation+preserved+in+long-lived+states.">Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states.</a> Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).</li><li>Sarkar, R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+NMR+of+15N-Choline+Metabolites+Enhanced+by+Dynamic+Nuclear+Polarization.">Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization.</a> JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben

Die kritischen Punkte der Auflösung DNP-NMR-Experiment sind: (i) das Niveau der Polarisation für das Substrat erreicht, das die niedrigste Produktkonzentration, die für Experimente sowie die Anzahl der Signalnahmen bestimmt, die durchgeführt werden können, und (ii) die Lebensdauern der Magnetisierung auf die Dauer der Übertragung zwischen der Polarisation und der Detektionsorte und auf die Geschwindigkeit der Substrat Transformation verglichen. Das Einspritzsystem der DNP-Setup Auflösung hierin ermöglicht in weniger als 4.3 sec für Probentransfer beschrieben. Obwohl die Übertragung nicht so schnell wie in der Methode von S. Bowen und C. Hilty, 26 Polarisationsverluste für die Pyruvat vorgeschlagen wurde, waren in dem niedrigen Bereich aufgrund der moderaten Längsrelaxationszeit beschränkt. [1- 13 C] Pyruvat, mit seiner langen Carbonkern T 1, ermöglicht bei Konzentrationen von nur 10 -3 U / ml des Flusses durch LDH messen. Das<html> hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis erhalten Auflösung unter Verwendung von DNP legt nahe, dass eine auf noch niedrigere empfindlich sein könnte [1- 13 C] Pyruvat-Konzentrationen und unteren enzymatische Konversionsraten. Die erzielte Polarisationsgrad ergibt mehr als 200 Versuche mit einem signifikanten Signal-Rausch-Verhältnis in der Flüssigkeit-NMR-Spektrometer erworben sein, um einen geringen Kippwinkel α = 10 ° verwendet wird. Dies lässt Raum für Optimierung sowohl hinsichtlich der Wiederholungen und Kippwinkel. Für den Aufbau der Polarisation in der Festkörper einige Moleküle polarisieren auch mit einigen Polarisationsmittel (TEMPO, OXO63) 4 und andere nicht, aus Gründen, die noch nicht vollständig verstanden sind. Experimentelle Versuche sind der einzige Weg, um zu bestimmen, ob der Polarisationsschritt erfolgreich ist. Um die Polarisationsebene zu verbessern, kann man den Einsatz verschiedener Radikalspezies 4 und die Anwendung verschiedener Techniken unter Berufung auf &quot;Kreuzpolarisation&quot; erkunden. 25 ontent &quot;&gt; Eine weitere Optimierung des radikalen und Substratkonzentrationen sowie der Lösungsmittelzusammensetzung in dem DNP Probe versucht werden Polarisation zu verbessern. Die Technik ist beschränkt auf Moleküle, in denen ein Kern oder eine Gruppe von Kernen der Lage Polarisation zu erhalten nach der Auflösung sein kann identifiziert. Polarisation aufrechterhalten entweder als ein Ungleichgewicht zwischen Mono-Atom-Eigenzustände in hohen Magnetfeldern oder in der Form von LLS delokalisiert auf zwei oder mehrere gekoppelte Kerne werden kann. Für die erste Option, hat die Sonde Kern von anderen Kernen mit hoher fern zu sein gyromagnetischen Verhältnisse, wie Protonen. Wenn eine solche Position nicht gefunden wird natürlich, Anreicherung in NMR-aktiven Kernen an isolierten Stellen im Molekül oder den Austausch von Protonen in der Nähe der aktiven Kerne durch Deuteronen, die magnetische Dipol Stärke zu senken, sind notwendig, . um LLS, eine theoretische Analyse der magnetischen Kopplungen innerhalb von Gruppen von Kernen erhalten aus 27,28 um getragen werden optimale Mittel zu finden, um support Polarisation. Diese Strategie hat sich bewährt in kleine Moleküle wie 29 Aminosäuren und können in Stoffwechselzyklen von Interesse beteiligt an andere Moleküle verwendet werden. Um besser zu bewahren Magnetisierung während des Experiments, verspricht die Kombination von Auflösung DNP mit Anregung von LLS die Messung Zeitspanne für andere enzymatische Reaktionen zu verlängern. 20 Die DNP-NMR-Experiment hier beschrieben wird für die Messung der Pyruvat-Metabolismus in Krebszellen angepasst. 6 die Echtzeit-Messung der enzymatischen Aktivität von DNP erhöhte NMR Auflösung kann in der durch DNP-MRT, bereits verwendet gegenwärtigen Bemühungen in der Krebsdiagnose helfen Klinik. 12 Die molekulare Spezifität von DNP-NMR verbesserte macht eine Methode der Wahl, um es für zwischen molekularen Zielen und den Produkten ihrer Transformationen unterscheiden. Zukünftige Verbesserungen werden auf die Beurteilung der anderen molekularen Tracern konzentrieren für Stoffwechsel 30-Transformationen </sup&gt; anfällig für die MRT-Diagnostik relevant zu sein, als auch auf längere Beobachtungszeitfenster zu erhalten.

Dynamische Kernpolarisation (DNP), 1,2 eine Technik entwickelt, um die Kernspinpolarisation zu erhöhen, das heißt, das Ungleichgewicht zwischen &quot;oben&quot; und &quot;unten&quot; Spinpopulationen (P = [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), wurde zum ersten Mal in den 1950er Jahren eingeführt. Kernspins wie 13 C bis zu P = 10 -1 unter günstigen Bedingungen polarisiert werden, typischerweise bei einer Temperatur in der Größenordnung von 1 K und in einem Magnetfeld von 3,357 T. 3,4 ein Durchbruch für biologische Anwendungen kamen in der frühen 2000er Jahren mit der Entwicklung von Lösungs DNP, die bei der Auflösung von gefrorenen polarisierten Proben in überhitztem Wasser besteht, während die hohe Kernpolarisation Ebene bei niedriger Temperatur erhalten Halte. 5 die Flüssigkeit-NMR-Signal um einen Faktor 10 3 -10 4 verstärkt wird im Vergleich zu verbreitetRT NMR Bedingungen thermisch polarisiert. Dissolution DNP ist daher ein Weg, um nicht-invasiv messen biochemischen Reaktionsgeschwindigkeiten in situ in Echtzeit, so dass die Überwachung Dynamik durch NMR mit einer zeitlichen Auflösung von 1 s oder weniger. 6 - 10 wurde es möglich, auch sehr geringe Konzentrationen von Analyten in erkennen 11. Unter den nicht-invasive Bildgebungsverfahren Molekül ist hyperpolarisierten NMR die einzige Technik, die ein Substrat und seine Stoffwechselprodukte in Echtzeit gleichzeitige Messung ermöglicht. Dissolution DNP mit Enthusiasmus in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen empfangen wurde im Bereich von in vitro NMR zu klinischen MRI 12 und den vielversprechendsten Anwendungen der in situ verbunden sind Überwachung des Stoffwechsels. 13,14 Die Hauptbegrenzung der Auflösung DNP ist, dass nach einer Zeit auf die Reihenfolge der fünffachen Längs Relaxationszeitkonstante T 1, das polare verbesserterung verloren. Kernspins Lager ausstellenden relativ lange T 1 ist es daher notwendig, Moleküle zu verwenden. Um die Zeitspanne des Polarisationsverstärkung erstrecken, langsam entspannende Kernspinzuständen, bekannt als langlebige Zustände (LLS), verwendet werden. 15 - 17 LLS sind unempfindlich gegenüber der intra-Paar Dipol-Dipol-Wechselwirkung, so dass ihre charakteristische Relaxationszeit, T LLS kann als T 1 viel länger sein. 18 eine Magnetisierungs Lebensdauer von zehn Minuten bis zu 1 Stunde daher erhalten werden konnte, 19,20 und LLS wurden sowohl für magnetische Resonanzspektroskopie (MRS) vorgeschlagenen und MRT. 21 Die wichtigsten Punkte, die für das Studium enzymatische Reaktionsgeschwindigkeiten von hyperpolarisierten NMR sind sorgfältig optimiert werden müssen: (i) maximieren die Solid-State-Polarisation und (ii) die Polarisationsverlust während der Übertragung des hyperpolarisierten Lösung aus der minimierenPolarisator zur NMR-Spektrometer. Dieser Artikel beschreibt die Anpassung eines maßgeschneiderten Auflösung DNP Gerät und Einspritzsystem enzymatischen Reaktionen zu untersuchen. Die Eigenschaften und die Leistung der Einrichtung wird mit der bekannten und weit verbreiteten hyperpolarisiertem Substrat [1- 13 C] Pyruvat nachgewiesen werden. Die Hauptgründe für diese Entscheidung sind erstens seine natürlich lange 13 C longitudinale Relaxationszeit (T 1&gt; 50 sec bei hohen Magnetfeldern und Temperaturen über 293 K), die Überwachung Reaktionen während mehrerer Minuten erlaubt, und zweitens, ihre zentrale Rolle in Krebsstoffwechsel. 13,14 mit Auflösung DNP-NMR und eine kundenspezifisch entwickelte Einspritzsystem, um die Oxidation von Pyruvat durch Laktat-Dehydrogenase (LDH) katalysiert wird, kann in Gegenwart eines anfänglichen Pool von unmarkierten Laktat 9,22 oder ohne unmarkierte Laktat überwacht werden hinzugefügt , wie hier gezeigt. Es hat sich gezeigt, dass die [1- 13 C] Laktat Signal in vi gemessenvo (einschließlich in Zellen) nach der Injektion von hyperpolarisiertem [1- 13 C] Pyruvat ist vor allem auf eine schnelle Etikettenaustausch zwischen Pyruvat und Lactat anstatt Laktatproduktion. 6 Wir präsentieren hier die Echtzeit-Produktion von [1- 13 C] Laktat von hyperpolarisierten [1- 13 C] Pyruvat in einem NMR-Röhrchen eingespritzt LDH, jedoch zunächst ohne Laktat. Systembeschreibung Es gibt zwei Hauptteile in einem Löse DNP setup (Abbildung 1): Die DNP Polarisator und dem NMR-Spektrometer. Das Hauptelement des DNP Polarisator ist ein Kryostat die Probe um 1 K in einem Pump Heliumbad zu kühlen. Der Kryostat ist in einem 3,35 T supraleitenden Magneten eingesetzt und hat eine Geometrie, die die Polarisations Probe im Isozentrum des Magneten (1) zu haben, sicherstellt. Im Innern des Kryostaten wird die Probe (a) durch eine NMR-Spule (b), umgeben die Polarisation b zu messenuildup, enthalten in einer übermodierten Mikrowellenkavität (c). Die gesamte Probe wird bei niedriger Temperatur in einem Pump Heliumbad (d) und Bestrahlung mit Mikrowellen durch den Wellenleiter gehalten wird. Das gesamte System wird durch maßgeschneiderte Software (2D) verwaltet. Die Hardware und die Tieftemperatur-Ausrüstung benötigt DNP und die anschließende Auflösung durchzuführen, sind nach wie vor eine technologische Herausforderung. Eine neue DNP Kryostaten 23,24 wurde entwickelt und getestet, um seine Tieftemperatur Leistungen zu bestimmen und dann für eine schnelle Abkühlung, Helium Haltezeit und insgesamt noch geringen Heliumverbrauch im Betrieb optimiert. Der Kryostat besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil des Kryostaten ist die Isolierung Dewar (2A), die in etwa in Oberteil getrennt werden kann (a) der Schwanz oder Probenraum (b), und die äußere Vakuumkammer (OVC) im Hochvakuum und Gehäuse gehalten dem Strahlungsschirme (c). Der zweite Teil des Kryostaten ist der Haupt insert (2B), in die Isolierung Dewar platziert, wo alle Wasserregelung gesteuert werden. Das flüssige Helium aus der externen Speicher Dewar durch die Leitung übertragen sind (a), in der ersten Stufe in den Separator (B) kondensiert ist, verwendet eine Zwischenkammer sowohl den oberen Teil des Kryostaten kalt zu halten und die Helium verdampft zu entfernen bei der Übergabe. Der Separator Druck wird um den oberen Teil des Kryostaten gewickelt abgesenkt durch Pumpen durch eine Kapillare (c); der Fluss des kalten Helium in dieser Kapillare werden die Leitbleche (d) und der Strahlungsschirme in der Isolations Dewar (OVC) abkühlen. Die Probe wird angeordnet und polarisiert in den Probenraum. Der Probenraum ist mit dem Separator durch eine andere Kapillare (e) verbunden ist, um den Schwanz des Haupt Kryostaten Einsatz gewickelt. Diese Kapillare kann durch ein Nadelventil manuell von außen betätigt geöffnet oder geschlossen werden. die niedrige Temperatur während der DNP pr verwendet zu erreichenocess muss flüssiges Helium in den Kryostaten Probenraum gesammelt werden und der Druck auf den mbar Bereich abgesenkt. Die Operationen für Kryostaten Betrieb notwendig sind über einen ziemlich komplexen Pumpensystems mit drei Sätzen von Pumpen durchgeführt, überwacht und in verschiedenen Punkten mit elektronischen und elektromechanischen Instrumente (2C) betrieben. Der Kryostat OVC muss durch den ersten Pumpsystem zu Hochvakuum gepumpt werden. Dieses System besteht aus einer Turbomolekularpumpe bestehend aus einer Kreiselpumpe (a) gesichert. Das flüssige Helium wird von der Speicher Dewar (b) durch die Transferleitung Kryostaten Einlass zu dem Kryostaten Separator überführt. Der Separator hat einen Zugang zum zweiten Pumpenaggregat angeschlossen. Dieses Set besteht aus einer Pumpe 35 m 3 / h Membran besteht (c). Diese Linie ermöglicht das Entfernen der Heliumgas während der Übertragung aus dem Dewar und bei Trennkühlung gekocht. Das flüssige Helium im Abscheider kann dann an den Probenraum durch die Kappe übertragen werdenIllary Rohre oben beschrieben. Zur Übertragung von flüssigem Helium aus dem Abscheider in den Raum Probe und anschließend auf niedrigere Probenraum Druck auf mbar Bereich, ein System dritte Pump bestehend aus einem 250 m 3 / h Rootspumpe durch eine 65 m 3 / h Kreiselpumpe (d) gesichert ist mit dem Kryostaten durch eine manuelle Drosselventil (e). Alle Vakuumsystemoperationen gesteuert und geregelt durch eine elektropneumatische Sonderanfertigung (f). Dieses Gerät steuert Vakuumleitungsverbindungen zwischen dem Kryostaten Separator (g) und Probenraum (h) Verkaufsstellen, die zweite / dritte Pumpsysteme (c, d), eine komprimierte Heliumflasche (i) und der Außenseite. Die Kommunikation zwischen (f) und der Außenseite durchläuft ein Einwegventil (j). Der elektro-pneumatische Einrichtung (f) sowie alle Systemparameter und die Auflösung Hardware sind durch eine maßgeschneiderte elektronische Gerät angeschlossen USB mit einem handelsüblichen PC gesteuert und betrieben. Schließlich alle das System, durch das elektronischeGerät wird durch maßgeschneiderte Standalone-Software (2D) verwaltet gegebenenfalls Operationen über eine Schnittstelle ins Leben gerufen werden Software-Tasten. Um die Probe zu verwalten und zu messen NMR-Signal Aufbau im Festkörper eine Reihe von Einsätzen verwendet werden (3A). Um den Kryostaten für Polarisation vorzubereiten, legen Sie die Hauptprobeneinsatz (a), in den Kryostaten. Der Hauptprobeneinsatz im Inneren eines übermodierten vergoldet Mikrowellenhohlraum gegeben, der mit einem NMR-Spule (b) zur Verfügung gestellt. Vor dem Einfrieren der Substratlösung, die in einem geeigneten Probenbehälter bei Temperatur von flüssigem Stickstoff polarisiert (Polarisations Lösung) zu werden, und es am Ende Unterseite des Glasfaserprobenhalter (c) platzieren. Schieben Sie den Probenhalter in die Hauptprobeneinsatz zu den Magneten Isozentrum erreichen. Legen Sie die vergoldet Wellenleiter (d) in den Probenhalter. Der Wellenleiter kann der Mikrowelle von einer externen Mikrowellenquelle erzeugt mit minimalen Verlusten t zu reiseno die Probe. Maßgeschneiderte Software für Kryostaten Management kümmert sich automatisch um, nach dem Klicken auf die entsprechende Schnittstelle Taste, verschiedene Operationen wie Abklingzeit (der Kryostat Temperatur Temperatur von flüssigem Helium nahe gesenkt wird), Füllung (der Kryostat mit flüssigem Helium auf einen vorbestimmten Pegel gefüllt ist ) ein zusätzlicher Schritt zu T 1 ≈ K (das flüssige Heliumbad gepumpt der Kühlung zu erreichen ist die niedrigste Temperatur möglich), Unterdrucksetzen (der Kryostat etwas über Raumdruck bei unter Druck P = 10-30 mbar Kryostaten Öffnung ohne Risiken zu ermöglichen, der Verschmutzung des Kryostaten durch die Luft) und Auflösung (automatisches Verfahren die DNP Probe und gibt das resultierende hyperpolarisierten Lösung Meßort, das heißt die NMR-Spektrometer) aufzulösen. Die Polarisation wird durchgeführt, bei 94 GHz, die Probe mit Mikrowellen bestrahlt wird (in einem Polarisationsfeld B 0 </sub&gt; = 3,35 T). Eine Patientenprobe gilt als vollständig polarisiert nach 3 T DNP, wobei T DNP ist die Polarisation Aufbauzeit. T DNP der gleichen Größenordnung ist als die longitudinale Relaxationszeit der Zielkerne im festen Zustand bei dem betreffenden Bereich und Temperatur. In allen Experimenten wurde die Probe für mehr als 5 T DNP polarisiert. Am Ende der Polarisationszeit muss die Probe in einer RT-Lösung, um aufgelöst zu werden, um für die Messung der Enzymaktivität verwendet werden. Während des Auflösungsprozesses, 5 ml von überhitztem D 2 O aus dem Kessel der Auflösung Einsatz (3B) durch komprimierte Heliumgas geschoben (P = 6-8 bar), um die DNP-verstärkten Probe zu erreichen und es aufzulösen. Das resultierende hyperpolarisierten Lösung wird die Auflösung Einsatz durch die komprimierte Heliumgas ausgestoßen, durch die Auflösung Einsatz Steckdose (3C-b </strong&gt;), einem 2 mm Innendurchmesser Teflon Rohrweiche. Die Zeit für den Auflösevorgang benötigt wird, ist 300 msec. 23 die Zeit für den Probentransfer von der benötigten DNP Polarisator zum Aufstellungsort NMR Spektrometer beträgt etwa 3 sec. Der Lösevorgang wird durchgeführt, eine Auflösungs Einsatz (3B) verwenden. Die Auflösung Einsatz besteht aus einem elektronischen pneumatischen Baugruppe (a) eine Kohlenstofffaser-Stick (b) Verbindungsrohre zwischen dem Kessel in die pneumatische Anordnung und dem Probenbehälter Schließfach (c) enthält, die mit der Probe dichte Kopplung ermöglicht out zum Auslass Behälter und zurück. Die elektropneumatischen Baugruppe (3C) verwendet überhitzten D 2 O durch die Kohlefaserstab zu dem Probenbehälter zu erzeugen und fahren und dann die hyperpolarisierte Lösung aus dem Kryostaten zu extrahieren. Der elektropneumatische Baugruppe wird von Pneumatikventilen (a) zusammengesetzt, die die Verbindungen zwischen der CO-Regelungmpressed Helium (P = 6-8 bar) Linie (b), der Kessel (c), wo die D 2 O durch das Ventil (d) eingespritzt wird, und der Ausgang (e) durch die Kohlenstofffaser-Stick (f). Das System wird durch einen Druck G, einem Thermometer und einem Wärmewiderstandsdraht in dem Kessel (c), einem Abzug (h) und einem Anschlusskasten (i) verwendet, um eine Schnittstelle, das System mit dem elektronischen Verwaltungsvorrichtung abgeschlossen. Die DNP Kryostaten und das NMR-Spektrometer sind durch eine Transferleitung, dh eine PTFE-Röhre von 2 mm Innendurchmesser innerhalb dessen das hyperpolarisierte Lösung durch unter Druck stehende Helium (P = 6-8 bar) gedrückt wird verbunden, wenn die Auflösung ausgelöst wird. Die Auflösung Sequenz besteht aus den folgenden Operationen besteht: in den ersten 300 ms, überhitztem D 2 O wird zu dem Probenbehälter geschoben, um das hyperpolarisierte gefrorenen Lösung zu schmelzen und aufzulösen. Danach wird das hyperpolarisierte Lösung aus dem Kryostaten durch Mittel der pres extrahiertensurized (P = 6-8 bar) Heliumgas und schob durch die 2 mm Innendurchmesser PTFE-Schlauch (3C-E) an die Messstelle an der Injektionsstelle mit einem der Verfahren beschrieben in Schritt durchgeführt wird, 6.2.1 oder 6.2 Schritt 0,2. Die zweite Komponente des Lösungs DNP-NMR-Einrichtung ist das NMR-Spektrometer. Im Setup hier beschrieben ist, arbeitet der NMR-Spektrometer bei einer Feld B 0 = 11,7 Tesla. Ein 5 mm NMR-Sonde wird verwendet, um das hyperpolarisierte Signal nach der Auflösung zu messen. Die NMR-Spektrometers wird durch die NMR-Konsole bedient, für verwendet, um sowohl Festkörper- und Flüssig-NMR-Messungen und die Firma bereitgestellte Software xwinnmr. Eine typische Messung eines niedrigen Kippwinkel harten Puls besteht (entweder kalibriert, für liquidstate oder unkalibrierten, für Solid-State-Messungen) durch Signalübernahmen verfolgt. Messungen des Festkörperwärmepolarisationssignal und DNP-derived signal Aufbau werden unter Verwendung des maßgeschneiderten durchgeführt 13 C-Spule an der Stelle des DNP Polarisator (Abbildung 3Ab), die mit der NMR-Spektrometer. In dieser besonderen Situation führen die NMR-Spektrometer Signal Verriegelungs nicht. Wenn Festkörper-Messungen durchgeführt werden, um zu verhindern signifikante Störungen der Polarisation, sollte die Zeitverzögerung zwischen Akquisitionen lang genug sein, etwa mehr als 0,5 T DNP. Die Solid-State-Erweiterung ist definiert als <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation4.jpg" width="100" /> woher <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" /> wird das hyperpolarisierte Signal (in Schritt 3.3 erhalten) und <img alt="Equation6" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation6.jpg" width="23" /> ist die Festkörpersignal (4A) (im thermischen Gleichgewicht bei gepumpt Temperatur von flüssigem Helium in Schritt 3.2 erhalten). Dieser Parameter ddefiniert den maximalen Polarisation für NMR-Experimente zur Verfügung, vor unvermeidlichen Verluste während der Übertragung des hyperpolarisierten Lösung. Die Messung wird mit einem einfachen Puls-acquire Reihenfolge ausgeführt, um eine nicht-abgeglichenen geringen Kippwinkel Puls verwenden. Pulse Kalibrierung wird für Festkörpermessungen häufig übersprungen. Eine analoge Vorgehensweise kann das hyperpolarisierte Signalverstärkung in den flüssigen Zustand zu bestimmen. In diesem Fall wird die in dem Spektrometerrohr platziert Probe vor der Injektion (Schritt 6.2) besteht aus 500 &amp; mgr; l von D 2 O. Nach dem Auflösen und Injektion, gibt es zwei wichtige Parameter zu überwachen. Das erste ist das hyperpolarisierte Enhancement im NMR-Spektrometer Ort, <img alt="Equation7" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation7.jpg" width="95" /> (4B), wobei <img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" /> ist das Signal direkt nach dem Einspritzen des hyper<html> polarisiert Lösung (erhalten in Schritt 7.1) und <img alt="Equation9" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation9.jpg" width="20" /> ist die thermische Polarisationssignal (im Schritt 7.2 erhalten). Die zweite ist die longitudinale Relaxationszeit, T 1 (4B, Einschub), verbunden mit dem Substrat und jede Stoffwechselprodukt (erhalten durch exponentielle Anpassung Signale, erhalten in Schritt 7.1). Diese beiden Parameter definieren die minimale Substratkonzentration erforderlich, um eine ausreichende Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und der verfügbaren Zeitfenster zur Messung der metabolischen Umwandlungen zu erhalten. Das Verhältnis zwischen Festkörper Polarisation <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> und liquidstate Polarisation <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> gibt bei der hyperpolarisierten Lösung Übertragung einer Schätzung der Polarisationsverluste aufgrund Entspannung. Ein Wertation12 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt; sollten in Abwesenheit der Entspannung Verluste beobachtet werden.

<table><tbody><tr><td>DNP polarizer</td><td>Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)</td><td>///</td><td>Cryostat and electronic equipment for sample polarization</td></tr><tr><td>Vacuum system components</td><td>Edwards vacuum (France)</td><td>Various</td><td> &lt;p&gt;- turbomolecular pumping setup&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- membrane pumping setup&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- high capacity roots pumping system&lt;/p&gt; &lt;p&gt;- vacuum fittings and components&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>DNP 3.35T Magnet</td><td>Bruker (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 MHz NMR Spectrometer</td><td>Bruker (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (US)</td><td></td><td>Data analysis software</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;4-Hydroxy-TEMPO 97%</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer, pH&amp;nbsp;=&amp;nbsp;7.0</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDH enzyme in&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin, BSA</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissolution dynamic nuclear polarization instrumentation for real-time enzymatic reaction rate measurements by nmr

Die wichtigste Einschränkung der NMR-basierten Untersuchungen ist niedriger Empfindlichkeit. Dies fordert für lange Aufnahmezeiten, also in Echtzeit NMR-Messungen von Stoffwechselumwandlungen zu verhindern. Hyperpolarisation über Auflösung DNP umgeht Teil der Empfindlichkeit gibt dank der großen Out-of-Gleichgewicht Kernmagnetisierungs aus dem Assoziierungsabkommen Elektron-zu-Kern-Spin Polarisationstransfer. Die hohe NMR-Signal erhalten werden, können chemische Reaktionen in Echtzeit zu überwachen. Die Kehrseite der hyperpolarisierten NMR liegt in der begrenzten Zeitfenster für die Signalerfassung, die in der Regel in Längsrichtung in der Größenordnung des Kernspins ist Relaxationszeit, T 1, oder, in günstigen Fällen in der Größenordnung des konstanten Relaxationszeit im Zusammenhang mit der Singulett-Zustand gekoppelt Kerne, T LLS. Die zelluläre Aufnahme von körpereigenen Molekülen und Stoffwechselraten können wichtige Informationen auf die Tumorentwicklung und Drogen Antwort liefern. Numerous vorherigen hyperpolarisierten NMR-Untersuchungen haben zur Überwachung der enzymatischen Aktivität in vivo die Relevanz von Pyruvat als metabolisches Substrat demonstriert. Diese Arbeit enthält eine detaillierte Beschreibung des experimentellen Aufbaus und Verfahren zur Untersuchung von enzymatischen Reaktionen erforderlich, um insbesondere die Pyruvat zu Lactat Umwandlungsrate in Gegenwart von Lactatdehydrogenase (LDH), die von hyperpolarisierten NMR.

NMR-Signal gewinnt Auflösung DNP mit Die DNP-Effekt besteht in der Übertragung des hohen Polarisation der ungepaarten Elektronenspins, typischerweise von stabilen Radikale Moleküle, NMR-aktiven Kernen, unter Mikrowellenbestrahlung der Probe. Die am häufigsten verwendeten freien Radikale sind TAM (OXO63) und TEMPOL. 4 Polarisationsverfahren TEMPOL Verwendung kann durch &quot;Kreuzpolarisation&quot; optimiert werden. 25 Die Optimierung der Konzentration des stabilen Rest, um den maximalen Kernpolarisation im festen Zustand zu erhalten, ist entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Die optimale Konzentration wurde gefunden TEMPOL 33 mM in den experimentellen Bedingungen dieser Studie zu sein. Diese Polarisation des gewählten Substrats reicht aus, um dessen enzymatische Umwandlung in Echtzeit folgen. Das Magnetfeld der Polarizer in Paris Descartes installiert ist B &amp; sub0; = 3,35 T und die Komponenten dieses Systems wurden oben (Figuren 1 - 3) beschrieben. Der Kryostat Design gewährleistet, dass die endgültige Probenposition mit dem Magneten Isozentrum zusammenfällt. Das Magnetfeld der Polarisator war Rampen und unterlegt die supraleitende Shim-Spulen mit nur mit dem Kryostaten an Ort und Stelle. Der letzte Protonenlinienbreite von einem 1 x 0,5 x 0,5 cm Wasserprobe betrug 23 KHz. wir untersuchten <img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" /> und <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> für [1 13 C] Pyruvat. Um dies zu tun, ist es notwendig, zunächst zu prüfen, die 13 C-DNP-verstärkte Signal <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" /> im festen Zustand in den Polarisator Ort vor der Auflösung (4A). Nach der Auflösung haben wir den [1-13 C] Pyruvat hyperpolarisierten Signal <img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" /> und seine Zerfalls am Spektrometer Ort. Unter Verwendung von 500 &amp; mgr; l von D 2 O als Probe in dem NMR-Spektrometer der flüssige Zustand Signal wurde auf einem Test Auflösung gemessen. Dies ermöglichte es uns, die Solid-State-DNP-Verstärkung (4B, Einschub), die Flüssigkeit-NMR-Polarisationsebene (4B) und die Polarisationsverluste während der Übertragung zu bestimmen. Das Verhältnis zwischen den Signalen in Schritt 3.3 gemessen und Schritt 3.2 die Solid-State-Erweiterung definieren, <img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" /> . Das Verhältnis zwischen dem ersten in Schritt gemessenen Signal 7.1 und dem Signal von Schritt 7.2 definiert den flüssigen Zustand hyperpolarisierten Verbesserung, <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> . Daten aus Schritt 3, Summarized in 4A und 4A (kleines Bild) zeigen, dass die Technik in 13 C zu polarisieren erlaubt [1- 13 C] Pyruvat bis zu <img alt="Equation14" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation14.jpg" width="29" /> = 22 ± 5, entsprechend einer 13 C Polarisations <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> = 1,5 ± 0,3%. Das Polarisationsniveau ist mehr als das Tausendfache der Kohlenstoffwärme Polarisation gemeinsam MRS Bedingungen (zB 11,74 T und 300 K). Daten aus Schritt 7, zusammengefasst in 4B und 4B (kleines Bild), erlauben die Bestimmung der im flüssigen Zustand 13 C-Hyperpolarisation von [1- 13 C] Pyruvat, <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> = 1 ± 0,2%. Die Verbesserung im festen Zustand für die Pyruvat erhaltene7,1 ist ein Maß für die Relaxationszeitkonstante ausreichend für die Zwecke des Experiments, obwohl höhere Verbesserungen verschiedene Reste mit demonstriert. 5 Die Zeitverlaufsdaten aus Schritt passen. Die Pyruvat longitudinale Relaxationszeit in dem Gemisch aus 500 &amp; mgr; l DNP verbesserte Lösung und 500 &amp; mgr; l D 2 O, war T 1 = 75 ± 5 s nach rf Korrektur (siehe Gleichung (3)). Die enzymatische Aktivität und Stoffwechselmessungen Dissolution DNP NMR Nachweis von 13 C-markiertes Substrat (A) kann in Echtzeit enzymatische Umwandlung Dynamik und beobachten die Bildung von Produkt (B) zu folgen, verwendet werden: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation1.jpg" /> Unmittelbar nach der Injektion von hyperpolarisierten Substrat (A),das Signal des Produkts (B) ist null. Dann beginnt der enzymatischen Umsetzung (1) (B) zu erzeugen. Die Magnetisierung der 13 C-Kerne wird durch die unterschiedliche chemische Verschiebungen und die chemische Veränderung der Moleküle beeinflußt. Dennoch kann die neue Umgebung zu verschiedenen Längsrelaxation Raten führen für die 13 C in B. Der Kurs Signal Zeit-Produkt kann qualitativ in drei Schritte unterteilt werden: am Anfang, die enzymatische Umwandlung A in B Umwandlung eine Erhöhung der B-Signal erzeugt; nach einer gewissen Zeit, abhängig von den Versuchsbedingungen, wobei der Rest die Magnetisierungsverluste durch Entspannung, diesen Anstieg und das Signal B ein Maximum erreicht; schließlich, bei längeren Zeiten, zerfällt das Signal B aufgrund Längsrelaxation. In der Hypothese der Enzymsättigung, zu vernachlässigen Rückumwandlung unter Berücksichtigung magnetische Relaxation der Magnetisierung der beiden Molekülarten (A und B) während der enzymatischen Umwandlung kann durch ein pa beschriebenPLED Differentialgleichungssystem: 22 <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation2.jpg" /> wobei M (A, B) (t) Magnetisierungen molekularer Spezies A und B sind jeweils k eff die effektive Umwandlungsgeschwindigkeitskonstante für die Signalübertragung durch die enzymatische Reaktion und R (A, B) sind die scheinbaren Längsrelaxationszeit Geschwindigkeitskonstanten der beobachteten Kerne in der molekularen Spezies A und B jeweils R (A, B) entfallen sowohl die reinen Längsmagnetisierung Entspannung und die Wirkung von HF-Pulsen.: <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation3.jpg" /> wobei T 1, (A, B) ist die LongitudinalrelaxationszeitZeitkonstante des Kerns in der lokalen molekularen Umgebung von molekularen Spezies A bzw. B. θ und τ sind die rf Kippwinkel und die Verzögerung zwischen zwei Signalnahmen, respectively. In dieser Studie Substrat A und Produkt B waren [1- 13 C] Pyruvat und [1- 13 C] Lactat, bzw., und war das Ziel [1- 13 C] Laktatproduktion von LDH unter Bedingungen zu messen, wo kein (isotopisch Lactat unmarkiert) war in der Lösung zu Beginn des Experiments. Die Messung besteht in einer Reihe von 13 C-Spektren mit einer einfachen pulseacquire Sequenz aufgezeichnet bei T = 21 ° C. Ein kalibrierter 10 ° Kippwinkel Impuls wurde für die sequentielle Anregung (Schritt 9) verwendet. Die Verzögerung zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen war τ = 1,5 sek. Die NMR-Erfassungssequenz wurde einige zehn Sekunden vor dem hyperpolarisierten Solut begonnenIonen-Injektion. Die Pyruvat Substratkonzentration in dem Probenröhrchen nach der Injektion war 25-35 mM. In Schritt 10 der Lactat zu Pyruvat Umwandlungsgeschwindigkeit in einem LDH-Konzentration von 10 -3 U / ml gemessen. Das aufgezeichnete Signal von Laktat und Pyruvat passen gut in das Modell in Gleichung (2) (gestrichelte Linie in Abbildung 5) und ergeben k eff = 0,9 ± 0,1 x 10 -3 s -1 (Abbildung 5). Dieser Wert stimmt mit der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit durch das Verhältnis [Lac] / [Pyr] zum Zeitpunkt 0 sec (Abbildung 5, Einschub). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Versuchsanordnung. Der Polarisator (links) besteht aus einem Mikrowellenhohlraum (c) innerhalb eines Kryostaten (d) entfernt angeordnet in einem Breit Bohrung 3,35 T supraleitenden Magneten. Eine maßgeschneiderte NMR-Spule (b) umgebende ter Probe (a) zur Überwachung der Kernspinpolarisation in situ verwendet. Das Helium Badtemperatur wird auf 1,12 ± 0,03 K gehalten, während die Probe bei der Mw = 94 GHz Mikrowellenfrequenz ν bestrahlt wird. Das System ermöglicht die NMR-Messung auf der Festkörperprobe während der Polarisation durchgeführt werden. Das polarisierte Probe in überhitztem Wasser gelöst und mit Druckheliumgas durch die Transferleitung in das Probenröhrchen zuvor innerhalb eines benachbarten NMR-Spektrometer platziert (rechts) gedrückt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig2.jpg" /> Abbildung 2. Kryostat und Vakuumanlagenschemata. (A) Isolierung Kryostaten Dewar; (B) Schrei<html> ostat Haupteinsatz; (C) Vakuumsystem-Verbindungen; (D) Screenshot von Management-Software-Schnittstelle mit Tasten verwendet, um bestimmte Vorgänge in Schritt 2 und Schritt 5 des Protokolls Abschnitt beschrieben durchzuführen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig3.jpg" /> Abbildung 3. Probenhandhabung und Auflösung. (A) Probenhandhabung Einsätze; (B) Auflösung Einsatz; (C) in der elektro-pneumatischen Anschlüsse der Auflösung Einsatz. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig4.jpg" /> Abbildung 4. Festkörper- Polarisation Aufbau und hyperpolarisierte Signalabfall. Dissolution DNP-Signale. (A) Festkörper-NMR Aufbau der Polarisation Signal einer 1,12 M Natrium [1- 13 C] Pyruvat-Lösung während einer DNP Polarisation (Kreuze, ausgestattet mit einer Exponentialfunktion S (t) = A · exp (-t / T b) + B der Zeitkonstante T b = 270 sec) und Entspannung (Kreise, S (t) = A · exp (t / T b) + B, T ss 1 = 840 sec); (A, Einschub) Vergleich zwischen DNPenhanced und thermisch polarisiert (skaliert bis 10 mal) Magnetisierung Signale im festen Zustand (ε ss = 22 ± 5, entsprechend einer Solid-State-Polarisation P SS = 1,5 ± 0,3%); (B) Vergleich zwischen dem ersten Spektrum aufgenommen nach der Auflösung und der Averaged Spektrum (skaliert bis 100 Mal) aus dem thermisch polarisiert 13 C erhalten Spins bei RT 1024 Transienten mit (ε = 1.000 ± 200). Der Lösevorgang dauerte 3,3 sec und die automatische Injektion etwa 2 sec mit einer geschätzten Signalverlust von 40%. Für die Versuche durch manuelle Injektion Übertragen der Probe durchgeführt, zusätzliche Verluste aufgrund der längeren Einspritzverzögerungs wurden auf 30% geschätzt; (B, Einschub) hyperpolarisierte Signalabfall von Pyruvat nach Auflösung in Abwesenheit von LDH (T 1 = 75 ± 5 sec). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53548/53548fig5.jpg" /> Abbildung 5. LDH-Aktivität und Krebszellstoffwechsel Ergebnisse. Aufbau von [1- 13 C] Laktat Signal aufgrund enzymatic Umsetzung bei einer LDH-Konzentration von 10 -3 U / ml von Signalabfall aufgrund Längsrelaxation von 13 C-Magnetisierung gefolgt. Die rote Linie zeigt die Passform mit dem Modell in Gleichung (2), die die Auswirkungen der Entspannung und enzymatische Umwandlung. (Einschub) Verhältnis zwischen [1- 13 C] Laktat und [1 -13 C] Pyruvat-Konzentration bei einer Extrapolation der Reaktionsgeschwindigkeit zum Zeitpunkt t = 0 (rote Linie). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53548/53548fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR at JoVE.com

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Chemical Equilibria

SCIENTISTS IN ACTION

10.6K Aufrufe.  Université Paris Descartes. The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Serie: Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have emerged in conjunction with the state-of-the-art positron emission tomography with 18F-fluorodeoxyglucose ([18F]-FDG PET). 13C magnetic resonance spectroscopic imaging (13CMRSI) is a minimally invasive imaging method that enables the monitoring of metabolism in vivo and in real time. As with any other method based on 13C nuclear magnetic resonance (NMR), it faces the challenge of low thermal polarization and a subsequent low signal-to-noise ratio due to the relatively low gyromagnetic ratio of 13C and its low natural abundance in biological samples. By overcoming these limitations, dynamic nuclear polarization (DNP) with subsequent sample dissolution has recently enabled commonly used NMR and magnetic resonance imaging (MRI) systems to measure, study, and image key metabolic pathways in various biological systems. A particularly interesting and promising molecule used in 13CMRSI is [1-13C]pyruvate, which, in the last ten years, has been widely used for in vitro, preclinical, and, more recently, clinical studies to investigate the cellular energy metabolism in cancer and other diseases. In this article, we outline the technique of dissolution DNP using a 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer and demonstrate its usage in in vitro studies. A similar protocol for hyperpolarization may be applied for the most part in in vivo studies as well. To do so, we used lactate dehydrogenase (LDH) and catalyzed the metabolic reaction of [1-13C]pyruvate to [1-13C]lactate in a prostate carcinoma cell line, PC3, in vitro using 13CMRSI.

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

hyperpolarisiertem<sup&gt; 13</sup&gt; C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

Forschung

Krebsforschung

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Biochemie

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due to fundamental constraints imposed by the hyperpolarized state, exotic imaging and reconstruction techniques are commonly used. A practical system for characterization of dynamic, multi-spectral imaging methods is critically needed. Such a system must reproducibly recapitulate the relevant chemical dynamics of normal and pathological tissues. The most widely utilized substrate to date is hyperpolarized [1-13C]-pyruvate for assessment of cancer metabolism. We describe an enzyme-based phantom system that mediates the conversion of pyruvate to lactate. The reaction is initiated by injection of the hyperpolarized agent into multiple chambers within the phantom, each of which contains varying concentrations of reagents that control the reaction rate. Multiple compartments are necessary to ensure that imaging sequences faithfully capture the spatial and metabolic heterogeneity of tissue. This system will aid the development and validation of advanced imaging strategies by providing chemical dynamics that are not available from conventional phantoms, as well as control and reproducibility that is not possible in vivo.

A multi-compartment dynamic phantom is used to simulate some biology of interest for metabolic studies using hyperpolarized magnet resonance agents.

Die Verwendung eines Mehrfach Dynamische einzelner Enzym-Phantom für Studien von hyperpolarisiertem Magnetic Resonance Agents

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Ingenieurwesen

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important biological processes. Understanding how the balance between structure and dynamics governs biological function is a new frontier in modern structural biology and has ignited several technical and methodological developments. Among these, CPMG relaxation dispersion solution NMR methods provide unique, atomic-resolution information on the structure, kinetics, and thermodynamics of protein conformational equilibria occurring on the &#181;s-ms timescale. Here, the study presents detailed protocols for acquisition and analysis of a&#160;15N relaxation dispersion experiment. As an example, the pipeline for the analysis of the &#181;s-ms dynamics in the C-terminal domain of bacteria Enzyme I is shown.

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the  &#181;s-ms Timescale

Here, a detailed description of the protocol implemented in the laboratory for acquisition and analysis of 15N relaxation dispersion profiles by solution NMR spectroscopy is provided.

15 N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Biotechnik

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...

Chemie

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various factors affect the relaxation rates, such as buffer composition, solution pH, temperature, and magnetic field. In this last regard, the spin-lattice relaxation time can be measured at clinical field strengths, but at lower fields, where these compounds are dispensed from the polarizer and transported to the MRI, the relaxation is even faster and difficult to measure. To have a better understanding of the amount of magnetization lost during transport, we used fast field-cycling relaxometry, with magnetic resonance detection of 13C nuclei at ~0.75 T, to measure the nuclear magnetic resonance dispersion of the spin-lattice relaxation time of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Dissolution dynamic nuclear polarization was used to produce hyperpolarized samples of pyruvate at a concentration of 80 mmol/L and physiological pH (~7.8). These solutions were rapidly transferred to a fast field-cycling relaxometer so that relaxation of the sample magnetization could be measured as a function of time using a calibrated small flip angle (3&#176;-5&#176;). To map the T1 dispersion of the C-1 of pyruvate, we recorded data for different relaxation fields ranging between 0.237 mT and 0.705 T. With this information, we determined an empirical equation to estimate the spin-lattice relaxation of the hyperpolarized substrate within the mentioned range of magnetic fields. These results can be used to predict the amount of magnetization lost during transport and to improve experimental designs to minimize signal loss.

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

We present a protocol to measure the magnetic field dependence of the spin-lattice relaxation time of 13C-enriched compounds, hyperpolarized by means of dynamic nuclear polarization, using fast field-cycled relaxometry. Specifically, we have demonstrated this with [1-13C]pyruvate, but the protocol could be extended to other hyperpolarized substrates.

Messung der Spin-Lattice Relaxation Magnetfeldabhängigkeit von hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protokoll für NMR 15N-Relaxations- und hetNOE-Experimente in der Proteindynamik-Studie

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide groups of the protein backbone or the methyl groups in side chains are used as reporters of structural dynamics in proteins. A structural dynamics study of the protein backbone of globular proteins on 15N labeled and fully protonated samples usually works well for proteins with a molecular weight of up to 50 kDa. When side chain deuteration in combination with transverse relaxation optimized spectroscopy (TROSY) is applied, this limit can be extended up to 200 kDa for globular proteins and up to 1 MDa when the focus is on the side chains. When intrinsically disordered proteins (IDPs) or proteins with intrinsically disordered regions (IDRs) are investigated, these weight limitations do not apply but can go well beyond. The reason is that IDPs or IDRs, characterized by high internal flexibility, are frequently dynamically decoupled. Various NMR methods offer atomic-resolution insights into structural protein dynamics across a wide range of time scales, from picoseconds up to hours. Standard 15N relaxation measurements overview a protein&#39;s internal flexibility and characterize the protein backbone dynamics experienced on the fast pico- to nanosecond timescale. This article presents a hands-on protocol for setting up and recording NMR 15N R1, R2, and heteronuclear Overhauser effect (hetNOE) experiments. We show exemplary data and explain how to interpret them simply qualitatively before any more sophisticated analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erforschung der intrinsisch ungeordneten Proteindynamik durch NMR-Relaxationsexperimente

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can characterize structural protein dynamics in a residue-specific manner. We provide a hands-on protocol for recording NMR 15N R1 and R2 relaxation and {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE) experiments, sensitive to the picoseconds to nanoseconds timescale.

NMR 15N-Relaxationsexperimente zur Untersuchung der Strukturdynamik von Proteinen in Pikosesekunden bis Nanosekunden

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

hyperpolarisiertem

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Die Verwendung eines Mehrfach Dynamische einzelner Enzym-Phantom für Studien von hyperpolarisiertem Magnetic Resonance Agents

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

¹⁵ N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Messung der Spin-Lattice Relaxation Magnetfeldabhängigkeit von hyperpolarisiertem [1-¹³C]pyruvat

NMR ¹⁵N-Relaxationsexperimente zur Untersuchung der Strukturdynamik von Proteinen in Pikosesekunden bis Nanosekunden

NMR ¹⁵N-Relaxationsexperimente zur Untersuchung der Strukturdynamik von Proteinen in Pikosesekunden bis Nanosekunden