Wir danken Bernard Kulemaka und Mitglieder des Smith-Lab für ihre hilfreichen Kommentare und Reagenz Beratung, Sam Connell und Brent Redford von 3i für fielding Bildgebung Fragen und Deborah Bang, Karen Heed und Kay Stewart für Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde von der University of Notre Dame, die Elisabeth und Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der University of Notre und Zentrum von Stammzellen und Regenerationsmedizin an der University of Notre unterstützt. Dame. Alle tierexperimentellen Studien erfolgten in Übereinstimmung mit der University of Notre Dame IACUC Dr. Cody Smith.

Alle Tierversuche wurden von der University of Notre Dame institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung der Zebrafisch-Probe
<ol><li>Legen Sie einen erwachsenen Mann und einem Erwachsenen weiblichen Tg (Cabrio Protein) in einer Paarung Kammer pro Standardverfahren13. Verwenden Sie in diesem Manuskript Tg(sox10:eos) Fisch9 wegen Zugang aber andere transgenen Linien mit Photoconvertible Protein gleichermaßen genutzt werden kann. Richten Sie mehr als eine Kammer für den Fall, dass Fische nicht verlegen zu tun. Lassen Sie die Fische über Nacht in der Kammer verbleiben.</li>
	<li>Sammeln Sie am nächsten Morgen Eiern in 100 mm Petrischalen. Eiern bis zu 24 h nach Befruchtung (hpf) Reifen vor dem Screening zu ermöglichen.</li>
	<li>Wenn Tiere oben heterozygot für das Transgen waren, Filtersätze Bildschirm 24 hpf Gerichte für Tg(sox10:eos) + Embryonen mit 488 nm Lichtquelle und GLP auf dem sezierenden Mikroskop. Tg(sox10:eos) + Embryonen zu isolieren und zu 48 Reifen erlauben hpf.</li>
	<li>Dechorionate Embryonen manuell mit einer Nadel oder Pinzette.</li>
	<li>Bereiten Sie und Mikrowellen Sie-5 mL 0,8 % niedrig schmelzende Punkt Agarose-Lösung.<ol>
<li>Sobald Agarose kühl anfühlen wird, legen Sie 3-4 narkotisierten Tg (Sox10:eos) + 48 hpf Fisch in der Mitte von einem 10 mm Glas-Deckgläschen unten Petrischale.</li>
		<li>Fügen Sie genügend Agarose bedecken die Oberfläche des Deckglases, etwa 1 mL. Verwenden Sie eine Sonde Nadel, um Fisch auf ihren Seiten zu arrangieren. Lassen Sie Agarose zu festigen, um die Montage der Tiere zu gewährleisten. Es möglicherweise notwendig, ständig der Zebrabärbling neu zu ordnen, bis der Agar14erstarrt. Erstarrung dauert ca. 2 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem die Agarose für 2 min erstarrt ist, fügen Sie langsam Embryo Medium mit 0,02 % Aminobenzoic Acid Ester (Tricaine), Schüssel, bis die Bodenfläche des Agar und Gericht untergetaucht ist. Dies sollte etwa 3 mL.</li>
</ol>2. Mikroskop Montage und unkonvertierte Imaging
<ol><li>Öffnen Sie konfokale Software und wählen Sie die Erfassung und Fokus-Fenster [Abb. 1]. Wählen Sie unter das Aufnahmefenster imaging Lab-spezifische Konvertierungseinstellung unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte [Abb. 1] einstellen. Hier wird die Lab-spezifische Einstellung genannt "Imaging-Fisch."</li>
	<li>Probe auf konfokalen Umfang und bringen in den Fokus mit Kurs und Feineinstellung Knöpfe.</li>
	<li>Öffnen Sie das Fenster und suchen Sie die gewünschte Region von Interesse (d.h. Dorsal Root Ganglien).</li>
	<li>Wählen Sie die c488 Laser im Menü Filter setzen. Stellen Sie die Belichtung auf 300 ms, Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2].</li>
	<li>Kontrollkästchen Sie das 3D im Abschnitt Typ zu erfassen . Wählen Sie im Bereich 3D Capture aktuelle Position und überprüfen Sie Bereich um Stromzu. Legen Sie in diesem Abschnitt den Bereich bis 35, die Zahl der Flugzeuge bis 36 und die Schrittweite auf 1. Das Angebot kann erhöht oder verringert, um Platz für die Tiefe der imaging-Bereich. Für das Rückenmark ist ein Wert zwischen 35-40 Stapeln in der Regel ausreichend [Abb. 5].</li>
	<li>Wählen Sie aktuelle Position [Abb. 5].</li>
	<li>Klicken Sie auf Start am unteren Rand des Aufnahmefensters Bild zu erwerben.</li>
</ol>3. Single-Cell Ladungszustand
<ol><li>Öffnen Sie konfokale Software und wählen Sie die Erfassung und Fokus-Fenster [Abb. 1]. Wählen Sie unter das Aufnahmefenster imaging Lab-spezifische Konvertierungseinstellung unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte [Abb. 1] einstellen. Hier nennt man die Lab-spezifische Einstellung "Fisch Abtragen vollen Chip."</li>
	<li>Wählen Sie die c488 und c541 Laser im Menü Filter setzen. Wenn nicht die gleiche Mikroskop-Software verwenden, finden Sie das Menü, verschiedene Laser und wählen Sie die 488 nm und 541 nm Laser auszuwählen. Die Belichtungen auf 300 ms eingestellt, Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2]. Diese Lasereinstellungen werden auf die Produktion von genügend Fluoreszenzsignal ohne Immunofluoreszenz oder Toxizität ausgewählt. Wenn Toxizität oder Immunofluoreszenz visualisiert wird, reduzieren Sie Laserleistung oder Belichtung.</li>
	<li>Öffnen Sie das Fenster und klicken Sie auf die Registerkarte "Photomanipulation" im Fenster "Fokus". Laserparameter entsprechend anpassen. Ändern Sie die Laserleistung Stack auf 2, und klicken Sie dann auf Go. Ändern Sie die Raster-Blockgröße auf 1 und klicken Sie auf festlegen. Ändern Sie doppelklicken Sie auf 4. Ändern Sie die Laserlinie auf v405 [Abb. 3].</li>
	<li>Öffnen Sie die erweiterten Einstellungen im Fenster "Aufnahme". Wählen Sie die Registerkarte "Photomanipulation" und ändern Sie die Doppelklick-Wiederholungen in 2. Klicken Sie auf "OK" [Abb. 4].</li>
	<li>Wählen Sie die Registerkarte "XY" im Fenster "Fokus". Überprüfen Sie die Laserparameter aus Schritt 2 im Register Fotomanipulation [Abbildung 3, Abbildung 4]. Photoconvert die Zelle ohne Ladungszustand der umgebenden Zellen Lasereinstellungen gesetzt.<ol>
<li>Wenn Ladungszustand benachbarter Zellen vorhanden ist, reduzieren Sie Laserleistung. Wenn Ladungszustand der Zellen nicht auftritt, können Laserleistungen erhöht werden. Laserleistung soll optimal, Photoconvert nur die Region von Interesse und nicht die Umgebung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Kontrollkästchen Sie Timelapse unter Typ zu erfassen. Klicken Sie auf [Abbildung 6A] starten .</li>
	<li>Sobald das live Zeitraffer-Fenster öffnet, wählen Sie das Werkzeug Kreis in der oberen Symbolleiste [Abb. 7]</li>
	<li>Zeichnen Sie einen Kreis, in welcher Region der Zelle. Rechtsklick den gezeichneten Kreis, FRAP Regionauswählen, und warten Sie 3 Sekunden. Der ausgewählte Bereich sollte dimmer werden [Abb. 8]. Klicken Sie auf Aufzeichnung beenden.</li>
	<li>Wenn mehr als ein Tier imaging, gehen Sie auf die Registerkarte "XY" im Fokus-Menü und wählen Sie Position 2 zurück. Wiederholen Sie Schritte 4.1-4.6.</li>
	<li>Um eine Population von Zellen zu konvertieren, folgen Sie dem Protokoll und Laser Parameter für Schritte 4.1-4.4 außer statt Zeichnen eines Kreises des Interessenbereichs FRAP, verwenden Sie das Linienwerkzeug. Zeichnen Sie eine Linie auf die Region des Interesses und die Region mit den gleichen Parametern, die oben aufgeführten FRAP.</li>
</ol>4. Post-Ladungszustand Imaging
<ol><li>Nachdem alle Punkte Photoconverted sind. Wählen Sie die Labor-spezifischen standard Bildstapel Einstellung in der Precoversion imaging Schritt 3 beschrieben. Dies finden Sie unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte im Fenster "Aufnahme" [Abb. 5] einstellen.</li>
	<li>Wählen Sie die c488 Laser und stellen Sie die Belichtung auf 300ms Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2].</li>
	<li>Wählen Sie die c541 Laser finden Sie unter das gleiche Menü wie die c488 Laser. Stellen Sie die Belichtung auf 500 ms, Laserleistung bis 10 und bis 75 [Abb. 9] verstärken.</li>
	<li>Kontrollkästchen Sie das 3D im Abschnitt Typ zu erfassen . Wählen Sie im Bereich 3D Capture aktuelle Position und überprüfen Sie Bereich um Strom zu. Legen Sie in diesem Abschnitt den Bereich bis 35, die Zahl der Flugzeuge bis 36 und die Schrittweite auf 1. Die Palette-Anzahl kann erhöhen oder verringern um die gewünschte bildgebenden Tiefe [Abb. 5] unterzubringen.</li>
	<li>In der Registerkarte "XY-Fokus" gibt es mehrere Punkte, die multipoint Liste Option im Fenster "Aufnahme". Wenn dies nicht der Fall ist, wählen Sie aktuelle Position.</li>
	<li>Klicken Sie auf Start am unteren Rand des Aufnahmefensters Bild zu erwerben.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In komplexen Gewebe organisieren verschiedene Zelltypen in bestimmten Domänen. Vor kurzem wurden Techniken zur Bezeichnung einzelner Zellen innerhalb dieser großen Gewebe Strukturen1,2,3genutzt. Hier zeigen wir zwei Techniken, die in ähnlicher Weise genutzt werden können, um einzelne Zelle Interaktionen und Zelle Bevölkerung Wechselwirkungen in komplexen Gewebe sichtbar zu machen. Der Vorteil der Ladungszustand Technik ist die räumliche Kontrolle, die der Wissenschaftler eine Zelle deutlich zu kennzeichnen muss. Mit einem Mikroskop, das die Fähigkeit hat, kleinere aussetzen imaging Gebiete innerhalb der größeren bildgebenden Fenster so klein wie einzelne Zellen oder Bereiche einzelner Zellen anders als andere Zellen bezeichnet werden können. Mehrere Photoconvertible Proteine wurden jetzt in die Gemeinschaft, so dass dies ein verbreiteter Technik7eingeführt. Mit der Fähigkeit, Photoconvert Proteine innerhalb der Zellen haben Wissenschaftler diese Technik oder ähnlichen Ansätzen zu untersuchen, Zellwanderung, Zelldifferenzierung und neuronalen Schaltung Analyse genutzt.
Obwohl die Software und die spezifischen Laserparameter in unser Labor spezifisch sind, zeigt dieser Artikel die universelle Möglichkeit, das Photoconvertable Protein Eos verwenden bei der Unterscheidung von einzelnen Zellen in ein Ganglion. Leider, die meisten genetischen regulatorischen Regionen, die fluoreszierende Proteine in frühen Entwicklungsphasen express weit innerhalb Ganglien fahren verwendet werden können. Dies ist wahrscheinlich, weil diese Zellen aus ähnlichen Vorläuferzellen Pools entstehen und die Marker diese Vorläuferzellen Staaten9 identifizieren. Es ist daher schwierig, die Wechselwirkungen der einzelnen Zellen innerhalb der größeren Ganglien während diese früher Entwicklungsstadien zu visualisieren. Die hier gezeigten Ansätze stellt eine Technik, die kann einzelne Zellen innerhalb eines Ganglion beschriften und somit könnte verwendet werden, um wissenschaftliche Fragen zu Ganglien Entwicklung zu sezieren.
Allerdings ist diese Ladungszustand Technik nicht auf Studien der Ganglien Entwicklung begrenzt. Beispielsweise kann in Studien der Regeneration, Ladungszustand vor Verletzungen Bedingungen genutzt werden, um festzustellen, wie spezifische Zellen innerhalb eines Ganglion reagieren nach Verletzung. Diese Studien können helfen, um der Stammvater-ähnlichen Potenzial bestimmter Zellen in ein Ganglion zu erhellen. In ähnlicher Weise könnte Ladungszustand der bestimmten Tumorzellen und Verfolgung dieser Zellen im Laufe der Zeit Eigenschaften einzelner Zellen innerhalb von komplexen Tumoren aufdecken. Diese Anwendung der Einzelzelle Ladungszustand erweitert somit das Potential der Technik, sinnvolle Entdeckungen in der biomedizinischen Gemeinschaft zu machen.
Dieser Ansatz kann auch selektiv beschriften Sie Zellen in einem Bereich des Rückenmarks. In der Entwicklung wandern Zellen oft aus Vorstufe, differenzierte Zellen in reifer Standorte11,14zu produzieren. Langfristige Schicksal Mapping mit Cre ist effizient verwendet worden, um solche Prozesse zu sezieren. Mit Cre-Techniken beschränkt sich räumlicher Auflösung auf der genomischen regulatorischen Regionen, die Cre Transkription15zu fahren. Mit Ladungszustand kann diese räumliche Auflösung erreicht werden, zusammen mit der Fähigkeit, die Zeit, wann der Ladungszustand auftritt, und die zeitliche Auflösung zu wählen. Daher für kürzere Begriff Schicksal-Mapping hat diese Ladungszustand Technik viele Vorteile gegenüber Cre Schicksal-Mapping. Jedoch dürfte in Proben, wo UV-Licht leicht erreicht werden kann, wie in einer intakten Maus diesen Ladungszustand Ansatz15arbeiten. Darüber hinaus kennzeichnet Cre Schicksal-Zuordnung dauerhaft Zellen ermöglicht mehr langfristige Schicksal Zuordnung als Ladungszustand, die seine Beschriftung verliert, wie die Photoconverted Version des Proteins zerstreut und neue unkonvertierte Protein wird von der Zelle hergestellt. Dennoch kann je nach Fragestellung, Ladungszustand ein nützliches Werkzeug für das Schicksal-Mapping Zellpopulationen sein.
Obwohl nur zwei Beispiele für die Anwendung der Ladungszustand bereitgestellt werden, haben zahlreiche Studien seine Wirksamkeit bewiesen. Abhängig von der räumlichen Präzision erforderlich kann Ladungszustand mit Zugriff auf eine UV-Lichtquelle erfolgen. Wenn der Wunsch ist es, einzelne beschriften können Zellen erweiterte Bildgebung wie konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie notwendig sein. Dennoch hat die Fähigkeit, die räumlichen und zeitlichen Bereich der markierten Zellen wählen deutlich von anderen Zellen innerhalb einer intakten Gewebe UV-induzierten Ladungszustand eine leistungsstarke Technik, biologischen Fragen zergliedern gemacht.

Mehrere unterschiedliche Zellen interagieren, um aufzubauen und zu pflegen komplexe tierischen und pflanzlichen Geweben. Diese Zellen sind oft eingefügten und schwer zu unterscheiden von Nachbarn auf eine einzelne Zellenebene ohne Hochauflösende Mikroskopie, die Fixierung des Gewebes erfordern. Zu verstehen, wie diese Gewebe bilden, sind gepflegt und werden krank, es war jedoch wichtig, zu untersuchen, wie einzelne Zellen im Gewebe sind im Laufe der Zeit interagieren. Idealerweise benötigen diese Experimente die Kennzeichnung einzelner Zellen innerhalb eines Gewebes in einer nicht-invasive Weise ohne das Erfordernis einer Fixierung. Wissenschaftler haben jetzt zahlreiche Techniken, um diese Aufgabe1,2,3,4zu erreichen entwickelt.
Die Entdeckung und Umsetzung von Quallen grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde ein spannender Ansatz, der für die Kennzeichnung von verschiedenen Zellen in einem Gewebe Umwelt1erlaubt. Mit zellspezifische Promotoren, ist es möglich, eine Teilmenge von Zellen genetisch zu wählen, die1bezeichnet werden. Alternativ kann virale induzierte Expression von GFP vom Benutzer ausgewählte Ausdruck der GFP3,4einsetzbar. Obwohl ziemlich nützlich, erlaubt vermittelten Genexpression der GLP nicht vom Benutzer ausgewählte Ausdruck in einer Teilmenge von Zellen im Gewebe; und virale Ausdruck der GFP, zwar vorteilhaft, kann invasive. Mit dem Aufkommen von GFP-Derivaten und clevere Techniken wie Brainbow verschiedene fluoreszierende Proteine mehr spärlich in den Geweben zum Ausdruck zu bringen ist es möglich, einzelne Zellen und die Interaktionen zwischen ihnen in komplexen Gewebe2, zu visualisieren geworden. 5. jedoch diese Ansätze Zellen in einer zufälligen beschriften. Wenn das gewünschte Experiment erfordert Visualisierung einer einzelnen Zelle oder Population von Zellen, die durch den Versuchsleiter definiert ist, sind sie daher beschränkt. Mit solchen Experimenten wäre es vorteilhaft, ein genetisch ausgedrückt fluoreszierendes Protein zu haben, die manipuliert werden können, um in eine einzelne Zelle Art und Weise unterscheiden es von anderen Leuchtstofflampen und nicht fluoreszierenden Zellen.
Um dieses Ziel zu erreichen und die Zellbiologie einzelner Zellen innerhalb einer komplexen lebendes Gewebe zu visualisieren, nutzt die wissenschaftliche Gemeinschaft Einzelzelle Ladungszustand verschiedene fluoreszierende Proteine6,7,8. Mit genetisch kontrolliert Ausdruck eines Photoconvertible Proteins (z.B. Eos, Kaede, etc.), die Übergänge von Grün auf rot fluoreszierenden UV ausgesetzt (488 nm) Licht, können wir eine einzelne Zelle unterscheiden, von seiner Eindringmittel beschrifteten Nachbarn6,7,8. Dieser Ansatz nutzt eine Vorrichtung an unsere confocal Mikroskop das Licht von einem Laser-Stapel zu einer Beugung begrenzte Region of Interest kann direkt angeschlossen. Mit dieser Technik können wir entweder einzelne Zellen oder größere Populationen in einem frei definierbaren Weise9,10,11beschriften. Die Technik ist minimal-invasiv im Vergleich zu einzelnen Zelle Injektionen von viralen GFP. Als ein Proof of Concept zeigen wir, dass wir Photoconvert einzelner Zellen in ein Ganglion im peripheren Nervensystem und Photoconvert größere Populationen wie Zellen befindet sich auf der Bauchseite des Rückenmarks9,10können, 11,12. Wir können diese Photoconverted-Zell-Populationen 24 h später dann visualisieren, um Einblick in ihre Bewegung und Differenzierung während der Entwicklung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1846">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt;width:320pt" width="427">Tg(sox10:eos) zebrafish animals</td>
			<td style="width:125pt" width="167"></td>
			<td style="width:85pt" width="113"></td>
			<td style="width:854pt" width="1139">Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">100 X 15 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.8% Low Melting Point Agarose</td>
			<td>dot scientific inc</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14021-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Needle dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td>
			<td>Fluka analytical</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td>
			<td>Zeiss Axiozoom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td>
			<td>3i spinning disk confocal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">UV light source (laser) for photoconversion</td>
			<td>405 nm laser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Slidebook software</td>
			<td>3i</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

Tierischen und pflanzlichen Gewebe besteht aus unterschiedlichen Populationen von Zellen. Diese Zellen interagieren im Laufe der Zeit zum Aufbau und Erhalt des Gewebes und können verursachen Krankheit wenn gestört. Wissenschaftler haben clevere Techniken um Eigenschaften und natürliche Dynamik dieser Zellen innerhalb von intaktem Gewebe zu untersuchen, zum Ausdruck bringen, fluoreszierende Proteine in Teilmengen von Zellen entwickelt. Jedoch erfordern manchmal Experimente mehr ausgewählten Visualisierung von Zellen im Gewebe, manchmal auf die einzelne Zelle oder Bevölkerung der Zellen Art und Weise. Um dies zu erreichen und Einzelzellen innerhalb einer Bevölkerung der Zellen zu visualisieren, haben Wissenschaftler einzellige Ladungszustand der fluoreszierende Proteine genutzt. Um diese Technik zu demonstrieren, zeigen wir hier wie UV-Licht auf eine Eos exprimierenden Zelle des Interesses an einem intakten, direkte Leben Zebrafisch. Wir Bild dann diese Photoconverted Eos+ Zellen 24 h später um festzustellen, wie sie im Gewebe verändert. Wir beschreiben zwei Techniken: einzelne Zelle Ladungszustand und Photoconversions der Bevölkerung der Zelle. Diese Techniken können verwendet werden, zu visualisieren, Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Schicksal und Differenzierung und Zelle Migrationen, so dass es eine Technik, die in zahlreichen biologischen Fragestellungen anwendbar ist.

Ladungszustand der fluoreszierenden Proteinen kann verwendet werden, um verschiedene Zellen in einem Gewebe6beschriften. Um dies zu demonstrieren, wurden Tg(sox10:eos) Fisch9 verwendet, um das Photoconvertible Protein Eos unter die regulatorischen Sequenzen des sox10. Die Tg(sox10:eos) Tiere bei 48 hpf waren zunächst montiert, und dann ein Image erstellt um eine unspezifische Ladungszustand erkennen, die möglicherweise aufgetreten sind. Die Eos war unkonvertierte Fluoreszenzsignal mit kleinen Eos Photoconverted Fluoreszenzsignal dann visualisiert (Abbildung 10). Tiere wurden in der Dunkelheit, um sicherzustellen, dass unspezifische Ladungszustand ist minimal gehalten. Dann wurden die Regionen von Interesse confocal Mikroskop-Set-up mit UV-Licht ausgesetzt. Um zu bestätigen, dass einzelne Zellen Photoconverted durch die UV-Exposition waren, nahmen wir Z-Stapel von der Fläche, die von der Photoconverted Region. In Übereinstimmung mit erfolgreichen Ladungszustand, gab es wenig Erkennung nicht konvertiert EOS außerhalb des Bereichs des Interesses und Photoconverted Eos war deutlich in der Region von Interesse. Das resultierende Bild zeigt eine einzelne Zelle in ein Ganglion mit der Bezeichnung definitiv von seinen Nachbarn (Abbildung 10).
Um das Dienstprogramm dieser Ladungszustand Technik zu demonstrieren, wurde eine Population von Zellen auch UV-Licht ausgesetzt. In diesem Paradigma Pre-Ladungszustand Bilder wurden und keine un-Photoconverted-Eos-Signal vorhanden war. Als nächstes wurde die ventrale Seite des Rückenmarks UV mit einer Linie (Abbildung 11) ausgesetzt. Um erfolgreiche Ladungszustand bestätigen, Post-Ladungszustand Bilder wurden aufgenommen und Photoconverted Eos in den ventralen Rückenmark Zellen an der Stelle der Linie von Interesse, die wir gezogen haben waren visualisiert (Abbildung 11). Non-Photoconverted Eos Signal war in allen anderen Bereichen sichtbar. Um diese Technik zu erweitern haben wir dann identische Bilder rund um die Uhr nach den Ladungszustand. In diesen Bildern wurden Photoconverted Eos+ Zellen verstreut in der gesamten Region Rückenmark im dorsalen und ventralen Standorte (Abbildung 12) gesehen. Diese Daten stehen im Einklang mit der Hypothese, dass ventrale Wirbelsäule Zellen nach dorsal Standorte wie zuvor beschrieben10verlegt. Zusammen zeigen diese beiden Techniken, Ladungszustand der Eos kann genutzt werden, um einzelne Zellen oder Populationen von Zellen innerhalb einer Gewebe-Region auf benutzerdefinierte Weise visualisieren. Dies hat zu einem besseren Verständnis der zellulären Eigenschaften wie Zellwanderung, Kommunikation und Dynamik beigetragen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig1.jpg"> Abbildung 1 : Erfassen und Windows zu konzentrieren. Screenshot der Software Darstellung der Lage der Abscheidung und Schwerpunkt Windows und das Lab bestimmten "Fisch Abtragen vollen Chip" Drop-down-Registerkarte. Rote Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig2.jpg"> Abbildung 2 : c488 Laserparameter. Screenshot von der Capture-Fenster zeigt die spezifischen Parameter für den c488 Laser. Exposition ist 300 Ms. Laserleistung 5. Intensivierung ist 75. Rote Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig3.jpg"> Abbildung 3 : Ladungszustand Laserparameter. Screenshot der Fotomanipulation Registerkarte im Fenster "Fokus" umreißt die speziellen Lasereinstellungen für Ladungszustand benötigt. Laserstack Power ist 2. Doppelklicken Sie auf Größe ist 4. Raster-Blockgröße ist 1. Rote Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig4.jpg"> Abbildung 4 : Erweiterte Ladungszustand Laserparameter. Screenshot der fortschrittliche Lasereinstellungen im Fenster "Aufnahme". Dies öffnet Fenster Capture Einstellungen mit der Registerkarte "Photomanipulation". Doppelklicken Sie auf Wiederholungen auf 2 festgelegt ist. Rote Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig5.jpg"> Abbildung 5 : Unkonvertierte Imaging Parameter. Screenshots von Fokus und Capture Fenster. Highlights der Capture Fenster spezifische Parameter für unkonvertierte Bildgebung erforderlich. Die Aufnahme-Einstellung ist "Fisch Imaging." Die 3D-Box wird unter den Capture-Typ überprüft. Und die 3D Aufnahmeeinstellungen angegeben sind; Palette ist 35, Anzahl der Flugzeuge ist 36 Schrittweite beträgt 1 und Offset ist-15. Die "aktuelle Position" und "reichen um Strom" Boxen sind ebenfalls ausgewählt. Rote Felder angezeigt. Zeigt, wie Sie einzelne oder mehrere Punkte auf das Aufnahmefenster (links) auswählen und wie Sie einzelne Punkte im Fokus-Fenster (rechts) auswählen. Grüne Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig6.jpg"> Abbildung 6 : Öffnen des Fensters Ladungszustand. Screenshot zeigt den Zeitraffer Aufnahme Typ wird in Übereinstimmung mit vorher eingestellten Parameter ausgewählt. Rote Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig7.jpg"> Abbildung 7 : Einrichten der Ladungszustand. Screenshot zeigt den Standort der Kreisfunktion (oben) und die Erfassung Kontrollfenster (rechts). Rote Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig8.jpg"> Abbildung 8 : Einzellige Ladungszustand. Screenshot zeigt die Verwendung der Ladungszustand Kreisfunktion und die Rechte Maustaste Dropdown-Menü. "Alle Regionen FRAP" Conversion-Aktion befindet sich in der Rechtsklick Drop-down-Menü. Rote Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig9.jpg"> Abbildung 9 : Post-Ladungszustand c561Laser Parameter. Screenshot von der Capture-Fenster zeigt die spezifischen Parameter für den c561 Laser. Exposition ist 500 ms Laserleistung 10. Intensivierung ist 75. Rote Felder angezeigt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig10v2.jpg"> Abbildung 10 : Einzellige Ladungszustand. (A). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch auf 48 hpf zeigt Dorsal Root Ganglien im peripheren Nervensystem vor Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt die ungefähre Lage der DRG Rückenmark Eintrag... (B). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch auf 48 hpf zeigt Dorsal Root Ganglien im peripheren Nervensystem während der Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt DRG Rückenmark Eintritt. Gelber Kreis zeigt Umwandlung Website und Beleuchtung Schraube UV-Licht Exposition. (C). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch auf 48 hpf zeigt Dorsal Root Ganglien in der peripheren Nervensystems Post-Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt DRG Rückenmark Eintritt. CNS ist eine Abkürzung für zentrales Nervensystem und PNS ist eine Abkürzung für periphere Nervensystem (A-C). Maßstabsbalken entspricht 10 ähm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57024/57024fig10v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig11.jpg"> Abbildung 11 : Ladungszustand Verfahren in einer größeren Region, Rückenmark. (A). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks vor Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt dorsalen Region des Rückenmarks. (B). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks während Ladungszustand. Durchgezogene gelbe Linie zeigt ausgewählte Bereich für Ladungszustand. Gestrichelte Linie zeigt dorsalen Region des Rückenmarks. (C). schematische und konfokale Z-Projektionen Tg(sox10:eos) Zebrafisch 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks nach Ladungszustand. Gestrichelte Linien zeigen die dorsalen Region des Rückenmarks. Maßstabsbalken entspricht 10 ähm.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57024/57024fig12.jpg"> Abbildung 12 : Zelluläre Tracking und Visualisierung Post-Ladungszustand. (A). schematische Tg(sox10:eos) Zebrafisch Rückenmark bei 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks nach Ladungszustand. Blitz zeigt UV-Licht-Umwandlung. (B). konfokale Z-Projektionen der Tg(sox10:eos) Zebrafisch Rückenmark ab 48 hpf zeigt OPCs und Dorsal Root Ganglien in der ventrale Region des Rückenmarks nach Ladungszustand. Blitz zeigt UV-Licht-Umwandlung. Maßstabsbalken entspricht 10 ähm.

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Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Aufrufe.  University of Notre Dame. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.

Serie: Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...