Ein. MEA Vorbereitung <ol><li> MEAs zur Verwendung bei Elektroporation Experimenten kann entweder unter Verwendung von Standard-Photolithographietechnik werden, wie zuvor beschrieben 18 oder direkt von gekauften Anbieter von MEA Herstellern wie Multi Channel Systems <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> und Alpha MED Scientific, Inc. <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Die MEAs in unseren Experimenten verwendet wurden, in-house im Reinraum in Arizona State University, die vom Center for Solid State Electronics Research (CSSER) verabreicht wird hergestellt. Die MEAs in unseren Experimenten verwendet wurden, hatten 32 Indium-Zinn-Oxid-Elektroden in einem 8 x 4 Array mit Elektroden-Durchmesser Größen von 50-200 um innerhalb eines 1 cm Innendurchmesser Glas gut. Das Glas wurde auch auf der MEA unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) verklebt ist. </li><li> Sterilisieren MEA in einem Autoklaven vor cell seeding. Andere Verfahren zum Sterilisieren wie eine Einweichen in 70% Ethanol, UV-Behandlung und Behandlung mit heißem Wasser als auch an anderer Stelle beschrieben verwendet, so lange sie nicht gefährden die Integrität des MEA werden. </li><li> Übertragen Sie die autoklaviert MEA zu einer laminaren Strömung Haube und legen Sie sie in einem Standard-sterile Polystyrol Petrischale. Vor dem Aussäen Zellen auf der MEA, sterilisieren Laminarströmungshaube durch Einschalten der UV-Licht für 20 min. Wenn der MEA ist empfindlich gegenüber UV-Licht decken die Petrischale mit der MEA mit steriler Aluminiumfolie während die Strömung Haube ist unter UV-Beleuchtung. </li></ol> 2. Seeding Cells auf der MEA <ol><li> Ernte von Zellen aus einem laufenden Zelllinie von adhärenten Säugetierzellen mit Trypsin / EDTA und heben sie bis zu einer Konzentration von 100-200 Zellen / ul in 1 ml Zellmedium zum Plattieren. In unseren Experimenten haben wir bei der Kultivierung NIH 3T3 Fibroblasten-Zelllinie HeLa-Zelllinie und primären kortikalen und hippocampalen Neuronen auf der MEA erfolgreich. </li><li&gt; Legen Sie eine 20-30 ul Tropfen Medien mit Zellen auf der MEA. Übertragen Sie die Petrischale mit der MEA in den Inkubator. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zelle Tropfengröße groß genug, um alle Elektroden auf der MEA abzudecken. </li><li> 2 h nach dem Aussäen der Zellen übertragen die Petrischale mit der MEA aus dem Inkubator in Laminarströmungshaube und sanft hinzuzufügen 400-500 ul pre erwärmt Medien (37 ° C) zu der MEA gut. Unter dem Mikroskop zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zellen noch gebunden sind und gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt MEA. Übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator. Das 2 hr Warteperiode vor der Zugabe von Medien sorgt genügend Zeit für die Zellen mit der MEA Oberfläche haften. Zugabe von Zell-Medien zu früh nach dem Aussäen der Zellen abzuwaschen die Zellen. Wenn Zellen nicht gut haften kann auf der MEA, kann seine Oberfläche mit Zellhaftung Faktoren wie aspolylysine, Fibronectin und Laminin behandelt werden, um die Zelladhäsion zu verbessern. In unserem HeLa-Zelle Experimente, die wir in der Regel behandeln die MEA Oberfläche mit fibronectin (10 ug / ml) für 1-2 Std. </li><li> 8-12 Stunden nach dem Aussäen der Zellen, führen 1-2 Waschgängen mit PBS sie keine toten Zellen zu entfernen. Zellmedium ersetzt alle 24-48 Stunden nach Bedarf. In einem typischen Experiment werden die Zellen gewöhnlich Transfektion 24-48 h nach der Aussaat. Um die Konsistenz bei der Elektroporation Effizienz zu erhalten empfiehlt es sich zu warten, bis die Kultur ist mindestens 80% konfluent vor der Elektroporation. </li></ol> 3. Site-spezifische Transfektion von siRNA <ol><li> Planen Nukleinsäurelösung. Für siRNA Transfektion, bereiten Sie einen 1-2 uM siRNA Elektroporation Lösung in eiskaltem Elektroporationspuffer, um ein Endvolumen von 200-400 ul erreichen. In diesem Video Artikel zeigen wir die Transfektion von HeLa-Zellen mit Alexa 488 konjugierten verschlüsselten Sequenz von siRNA. </li><li> Übertragen der MEA mit Zellen aus dem Inkubator in sterilen Sterilbank. Entfernen Sie die Zelle Medien aus dem MEA und führen Sie einen Waschgang mit PBS. Danach fügen 200-400 ul des ice kalten 1 uM siRNA Elektroporation Lösung für das gut. </li><li> Anwenden anodischen quadratischen elektrische Impulse an die gezielte Elektroden (siehe 4 zur Bestimmung der optimalen Parameter des elektrischen Impulses Schritt). In unseren Experimenten verwendeten wir einen pragmatischen Instruments 2414A Waveform-Generator in elektrische Impulse und ein Dual-Inline-Package (DIP) 16 pin clip den Kontakt mit den MEA Bondpads machen zu generieren. Der Wellenformgenerator können zur DIP Clips über einen Demultiplexer Leiterplatte an Selektivität der einzelnen Elektroden bereitzustellen angeschlossen werden. Für die Referenzelektrode, legen eine Stahlkathode in dem Zellmedium. Gleichzeitig wird der Stahl Referenzelektrode in den Medien ist es extrem wichtig, um sicherzustellen, dass es keinen Kontakt mit der MEA Oberfläche. Bei Kontakt, kann es zu Schädigungen der Zellen und der MEA. Es wird empfohlen, um die Referenz-Elektrode mit einer Höhe von mindestens 1 mm oberhalb der Zellen abzusenken. Ein Abstandshalter mit einer Höhe von 1 mm können in der Vertiefung zu helfen bei Platzierung des ref abgegeben werdenerenz Elektrode. Ein alternativer Ansatz zur Verwendung eines externen Referenzelektrode ist in benachbarte Elektroden als Kathoden-Anoden-Paare verwendet werden. </li><li> Sofort nach dem Auftragen die elektrischen Impulse an die gezielte Elektroden auf der MEA, übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator. Nach einer Inkubationszeit von 5 min sanft ersetzt 75% des Elektroporation Puffer mit vorgewärmten (37 ° C) Zelle Medien. Später kann Fluoreszenz-Bildgebung durchgeführt, um die Lieferung von fluoreszierend markierten siRNA zu den Zellen zu bestätigen. </li></ol> 4. Elektroporation Parameter Optimization <ol><li> Um die optimalen elektrischen Pulsparameter zur Elektroporation, Design Elektroporation Experimente für einen Bereich von Werten der Impulsamplitude, Impulsdauer, und die Anzahl der Impulse zu bestimmen. Nach unserer Erfahrung mit HeLa-Zellen wurde beobachtet, dass ein einzelner Spannungspuls von Amplitude von 3 V bis 9 V, und die Dauer von 1 msec bis 10 msec für eine Elektrode eine Größe von 100 um führte zu erfolgreichen Elektroporation mit minimal Zelltod. Es ist unsere Empfehlung, dass ein Parameter zu einem Zeitpunkt variiert werden und andere konstant gehalten werden. Um die Effizienz Elektroporation für jeden der Impulsparameter quantifizieren, verwenden wir Propidiumiodid (PI), eine Zelle impermeante Farbstoff daß Flecken Nukleinmaterial und Live Assay basierte Methodik, wie in Schritten von 4,2 bis 4,5 beschrieben. </li><li> Stellen Sie eine Zellkultur auf der MEA nach den Anweisungen in Schritt 1 und 2 dargestellt. </li><li> Vor der Elektroporation bereiten 300-500 ul von 30 ug / ml PI-Lösung in eiskaltem Elektroporation Puffer und 400 ul von 4 uM calcien AM-Lösung in PBS. </li><li> Übertragen der MEA aus dem Inkubator zur Sterilbank. Entfernen Sie die Zelle Medien aus dem MEA und führen Sie einen Waschgang mit PBS. Danach fügen 300-500 ul des eiskalten Elektroporation Puffer mit PI. </li><li> Anwenden elektrischer Impulse mit gewünschten Puls Amplitude und Dauer, um die gezielten Elektroden (Die Ausrüstung in unseren Experimenten zum Erzeugen und Anlegen des elek verwendettric Impuls an der MEA im Schritt 3.3) beschrieben. Für die Referenzelektrode entweder abzusenken einen Stahl-Elektrode in die Elektroporationspuffer in der MEA gut oder den benachbarten Elektrode als Referenz. Durch selektives Anlegen von Impulsen variierender Amplituden oder Dauern, um verschiedene Elektroden mehrere Experimente können auf demselben Gerät durchgeführt werden. Beispielsweise auf einem 32-Elektrode MEA kann durch Spalten 8 Versuche durchgeführt werden, um die Elektroden 32 in 8 Gruppen, jeweils bestehend aus 4 Elektroden. Jede der acht Gruppen können dann durch einen einzigen rechteckigen Spannungsimpuls von 5 msec Dauer mit variierenden Amplituden in 3 V-6 V bei 0,5 V-Schritten und eine Gruppe stimuliert werden kann als Kontrolle verwendet werden. </li><li> Unmittelbar nach dem Auftragen die Spannungsimpulse übertragen die MEA zum Inkubator für 5 min. Danach entfernen Sie vorsichtig 75% der Elektroporation Puffer aus dem MEA gut und ersetzen Sie es mit warmem Zellmedien. Übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator. </li><li> Nach einer Inkubationszeit von 2-4 hersetzen Sie die Zelle Medien in der MEA gut mit 300-500 ul 4 uM Calcein AM-Lösung in PBS. Übertragen Sie die MEA zurück zum Inkubator für weitere 30 min. </li><li> Nach der Inkubation der Zellen mit Calcein AM, Calcein AM ersetzen Lösung in der MEA gut mit PBS nach zweimaligem Waschen mit PBS. Erhalten Fluoreszenzbilder der Zellen unter Verwendung mit einem optischen Mikroskop mit Filtern für PI (Anregung / Emission - 535 nm/617 nm) und Calcein AM (Anregung / Emission - 490 nm/520 nm). Die Aufnahme von PI aufgrund Elektroporation bewirkt Zellen fluoreszieren rot und die Calcein AM verursacht Zellen, die lebendig zu fluoreszieren grün sind. Drei mögliche Szenarien, die beobachtet werden können, sind 1) Zelle elektroporierten und lebendig (fluoreszieren sowohl rot und grün), 2) Cells lebendig, aber nicht elektroporiert (fluoresziert nur grün) und 3) Cells Toten durch Elektroporation (fluoresziert nur rot) . Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozent der Gesamtzahl der Zellen am Leben auf der Elektrode und der Elektroporation eff berechneticiency wurde als Prozent der Gesamtzahl der Zellen mit PI / siRNA geladen berechnet. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt die site-spezifische Belastung von HeLa-Zellen mit PI. Es kann beobachtet werden, dass nur Zellen auf der Elektrode eine Aufnahme von PI (1B) nachzuweisen. Ein Live-Assay durchgeführt nach der Elektroporation wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen (1A) zu beurteilen. Die Elektroporation Effizienz und Zelllebensfähigkeit für das Beispiel in 1 gezeigt sind 81,8% und 96,1% betragen. Hohe Zelllebensfähigkeit und Elektroporation Effizienz kann durch Optimierung der Elektroporation Pulsparameter erreicht werden. Ortsspezifische Transfektion von HeLa-Zellen mit fluoreszierend markierten siRNA zur optimierten Impulses Elektroporation (8 V, 1 ms) ist in Abbildung 2 gezeigt. Die Elektroporation Effizienz für die siRNA bei 8 V, 1 ms wurde festgestellt, dass 74,4 von ± 16,0% undZelllebensfähigkeit wurde gefunden, 87,9 ± 8,4% (alle Angaben als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, N = 5) sein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ortsspezifische Lieferung von PI in HeLa-Zellen auf einem 200 um-Elektrode (6 V, 5 ms). A) Calcien basierende Live-Assay durchgeführt 2 h nach der Elektroporation. Lebenden Zellen werden durch grüne Fluoreszenz. B) Rot-Fluoreszenz zeigt die Aufnahme von PI von Zellen auf der Elektrode. C) Eine überlagerte Bild von A und B. Die weißen Pfeile zeigen Zellen, die Elektroporation und lebendig sind. Die schwarzen Pfeile zeigen Zellen, die tot sind. Der weiße Kreis in A, B und C zeigt den Umriss der Elektrode. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Abbildung 2. Transfektion von HeLa-Zellen mit fluoreszenzmarkierten scramble Abfolge von siRNA. A) Bild von HeLa-Zellen auf einem 100 um Elektrode mit Alexa 488 markierten siRNA (8 V, 1 ms) transfiziert. B) Bild von Zellkerne mit DAPI gefärbt. Der weiße Kreis markiert den Rand der Elektrode.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video Artikel zeigen wir die Verwendung von MEA für die ortsspezifische Transfektion von HeLa-Zellen mit verschlüsselten Sequenz von siRNA. Einer der Vorteile dieser Technologie ist die Anwendbarkeit auf verschiedene Zelllinien einschließlich primären Zelllinien. Unser Labor hat zuvor die Verwendung dieser Technologie für die ortsspezifische Transfektion von primären hippocampalen Neuronen Kultur von E18 Tage alten Ratten und NIH-3T3-Zellen mit verwürfelten siRNA Sequenzen und GFP-Plasmid 18, 19</s...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Cell-Medium: Erweiterte MEM L-Glutamin 200 mM Penicillin / Streptomycin Fötales Rinderserum </td><td> Gibco / Invitrogen HiMedia Laboratories / VWR Lonza Group Ltd Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Cell-Medium Zusammensetzung: 2% FBS, 2% L-Glutamin und 2% Pennstrep in Advance MEM </td></tr><tr><td> Trypsin EDTA </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 und Rhodamin markiert kletterte sequENCE siRNA </td><td> Qiagen, Inc. </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroporationspuffer </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Wellenformgenerator </td><td> Pragmatisch </td><td> 2414A </td><td> Jede Wellenform / Impulsgenerator, die die gewünschten Impulse liefern kann, kann verwendet werden. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

Die Entdeckung von RNAi in Eukaryoten und der anschließenden Entwicklung von RNAi Mittel wie siRNA und shRNA, haben eine potente Verfahren zum Silencing spezifische Gene 1-8 für funktionelle Genomik und Therapeutika erreicht. Eine große Herausforderung bei RNAi basierenden Studien beteiligt ist die Lieferung von RNAi Agenten gezielt Zellen. Traditionelle non-viralen Techniken, wie Bulk-Elektroporation und chemische Transfektionsmethoden fehlt oft die notwendige räumliche Kontrolle über Lieferung und leisten schlechte Transfektionseffizienz 9-12. Jüngste Fortschritte in der chemischen Transfektionsmethoden wie kationische Lipide, kationische Polymere und Nanopartikel wurden in stark verbesserte Transfektionseffizienzen 13 geführt. Allerdings sind diese Techniken immer noch nicht präzise räumliche Kontrolle über Lieferzeiten, die immens Hochdurchsatz-Technologien, einzelne Zelle Studien und Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen können miniaturisierte Nutzen bieten. nt &quot;&gt; Neueste technologische Fortschritte in der Gentransfer haben High-Throughput-Transfektion von adhärenten Zellen 14-23, ein Großteil davon mikroskaligen Elektroporation verwenden aktiviert. Microscale Elektroporation bietet präzise räumlich-zeitliche Kontrolle über Lieferung (bis auf einzelne Zellen) und hat sich gezeigt, um hohe Wirkungsgrade 19, 24-26. Zusätzlich zu erreichen, müssen Elektroporation Ansätze erfordern eine längere Inkubationszeit (in der Regel 4 Stunden) mit siRNA und DNA-Komplexe wie nötig in der chemischen Basis Transfektionsmethoden und führen zu direkten Eingabe der nackte siRNA und DNA Moleküle in die Zelle Zytoplasma. Als Folge Genexpression kann bereits sechs Stunden nach der Transfektion 27 erreicht werden. Unser Labor hat zuvor die Verwendung von Mikroelektrodenarrays (MEA) für die ortsspezifische Transfektion in adhärenter Säugerzellkulturen 17-19 gezeigt. In der MEA Ansatz, erfolgt die Lieferung der genetischen Nutzlast über lokale Mikro-Maßstab electroporati erreichtauf der Zellen. Eine Anwendung des elektrischen Impulses an den ausgewählten Elektroden erzeugt lokale elektrische Feld, die Elektroporation von Zellen in der Region der stimulierten Elektroden führt. Die unabhängige Steuerung der Mikroelektroden stellt räumliche und zeitliche Steuerung über Transfektion und ermöglicht auch mehrere Transfektion basierte Experimente auf der gleichen Kultur durchgeführt werden Erhöhung des Durchsatzes und zur Verringerung experimentellen Kultur-zu-Kultur Variabilität. Hier beschreiben wir den Versuchsaufbau und das Protokoll für die gezielte Transfektion von adhärenten HeLa-Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten verschlüsselten Sequenz siRNA mittels Elektroporation. Das gleiche Protokoll kann auch zur Transfektion von Plasmid-Vektoren verwendet werden. Zusätzlich kann das hier beschriebene Protokoll leicht an eine Vielzahl von Säugetier-Zelllinien mit geringfügigen Modifikationen verlängert werden. Kommerzielle Verfügbarkeit von MEAs sowohl mit vordefinierten und benutzerdefinierten Elektrode Muster machen diese Technik zugänglich to die meisten Forschungslabors mit grundlegenden Zellkultur Ausrüstung.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Der Artikel beschreibt das Protokoll für ortsspezifische Transfektion von verscrambeltem Sequenz von siRNA in einer anhaftenden Säugerzellkultur mit Hilfe eines Mikroelektrodenfeldanordnung (MEA).

Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

13.4K Aufrufe.  Arizona State University. Der Artikel beschreibt das Protokoll für ortsspezifische Transfektion von verscrambeltem Sequenz von siRNA in einer anhaftenden Säugerzellkultur mit Hilfe eines Mikroelektrodenfeldanordnung (MEA).

Serie: High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Gentransfer und Transfektion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen mit Epidermal Growth Factor Gelatin-Based Engineered Nanovektoren Rezeptor-gezielte

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Forschung

Biotechnik

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

Merkmale der Niederschlag gebildet Polyethylene Glycol-Mikrogele durch Molekulargewicht der Reaktanden Controlled

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Gentransfektion in Richtung Spheroid Zellen auf mikrostrukturierten Kulturplatten für genetisch veränderte Zelltransplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...