We thank Joon Kim for expert flow cytometry assistance. Research in the authors&#8217; labs is supported by the SCORE program of the National Institutes of Health (grant SC1-GM095402 to B.D.O) and the Canadian Institutes of Health Research (to J.C.Z.P.). J.C.Z.P. is supported by a Canada Research Chair in Developmental Immunology. The biomedical research infrastructure of Hunter College is supported in part by the NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) program via grant MD007599. We also acknowledge the New York State Stem Cell Science Program (NYSTEM) for its support of the initiation of stem cell research at Hunter College via grant C023048.

1. Herstellung von Kulturmedien, Zytokine und Gelatinierte Platten <ol><li> Bereiten ES-Zell-Medien mit Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit hoher Glukose und Natrium Pyruvat. Fügen Sie 20% ESC qualifiziert Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 1% L-Glutamin, 1% HEPES-Puffer, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1% Gentamicin (50 mg / ml) und 0,1% ( 55 uM) β-Mercaptoethanol. Sterilisieren ES-Zellmedium durch Filtration. </li><li> Vorbereitung OP9 Medien, indem 1 l Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) aus Pulver nach den Anweisungen des Herstellers. Mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Kehren Sie zu mischen. Sterilisieren durch Filtration in zwei 500 ml-Aliquots. HINWEIS: Die Verwendung von Medien aus Pulver hergestellt wird empfohlen und wahrscheinlich verbessert OP9 Zelle Wartung und In-vitro-Differenzierung Ergebnisse. Dieser Ansatz hat sich zu unserem Standardverfahren. Beachten Sie jedoch, wir auch that wir manchmal verwendet vorgefertigten flüssigen α-MEM mit ausreichenden Erfolg. </li><li> Vorbereitung Gefriermedien durch Zugabe von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 90% FBS. Vorsichtig schwenken und zu sterilisieren durch Filtration. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Vorbereitung 2,000x Flt-3-Ligand (10 ug / ml) durch Lösen humanen rekombinanten Flt-3-Ligand (Flt-3L) in komplettem Medium OP9 bis 10 ug / ml. Aliquot in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. Folgen des Lieferanten Empfehlungen bezüglich Stabilität und Lagerung. HINWEIS: Die Stabilität von Flt-3L ist kurz (1 Monat bei 4 ° C oder 3 Monate bei -80 ° C). </li><li> Vorbereitung 1,000x IL-7 (1 ug / ml) unter Verwendung von vollständigen OP9 Medien. Aliquot in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. Folgen Sie den Empfehlungen des Lieferanten, die auf Stabilität und Lagerung (IL-7 ist bei -80 ° C für bis zu 12 Monate haltbar). </li><li> Vorbereitung 1,000x Leukemia Inhibitory Factor (LIF) (10 ug / ml) durch eine 1:10 Verdünnung von 10 7 Einheiten LIF in ES-Zell-Medien. Speicher Aliquots bei 4 ° C ist. Notieren Sie die vom Hersteller auf den aliquoten Fläschchen vorgesehen Ablaufdatum. HINWEIS: Das Produkt ist in konzentrierter oder verdünnter Form mindestens 18 Monate ab dem Datum der Herstellung stabil. </li><li> Bereiten gelatinisierten 6-Well-Platten von 1,5 ml von 0,1% Gelatine-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Die Teller in den sterilen Abzug bei Raumtemperatur mit Deckel auf, so dass mindestens 30 min für die Beschichtung. Die Schalen können auch in einem befeuchteten Inkubator über Nacht stehen gelassen werden. Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Gelatinelösung direkt vor Zellaussaat. Lassen Sie sich nicht die Gelatinelösung vollständig trocknen im gut. </li></ol> 2. Vorbereitung und Wartung von Feeder-Zellen und embryonalen Stammzellen der Maus (MESC) Hinweis: Alle Zellen inkubiert in einer befeuchteten 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. <ol><li> Auftauen embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) <ol><li> Quick-tauen eine gefrorene Fläschchen (~ 5 x 10 6 </sup&gt; Zellen / Flasche) von Mitomycin C-behandelten (oder anderweitig mitotisch verhaftet) MEFs und sie auf einem 15-ml-Tube. </li><li> 8 ml ES-Zell-Medien, um den aufgetauten Zellen in einem Dropdown-weise Mode allmählich verdünnen das DMSO aus dem Gefriermedium. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 400 x g bei 4 ° C für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Zellpellet in 3 ml ES-Zellmedium. </li><li> Vorbereiten einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 33 ml vorgewärmten ES-Zellmedium. Fügen Sie die 3 ml resuspendiertes MEFs, um das Endvolumen auf 36 ml zu bringen. </li><li> Verteilen 3 ml der resuspendierten MEFs in jede Vertiefung zwei gelatinierte 6-Well-Platten. Legen Sie die Platten in den Brutschrank für mindestens sechs Stunden, um damit die Zellen anlagern und ausbreiten vor der Aussaat die mESCs auf sie. Diese mitotisch verhaftet Feeder-Schichten kann für mehrere Tage nach der ersten Aussaat verwendbar sein, wenn ihre Medien wird alle 2-3 Tage gewechselt. HINWEIS: Frisch verhaftet MEFs können ebenfalls verwendet werden. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Seeding mESCs <ol><li> Quick-tauen ein Fläschchen mit einem gefrorenen MESC Klon in der 37 ° C-Wasserbad und bereiten Zellen, wie in 2.1.1-2.1.3 beschrieben. HINWEIS: Wir frieren 2 Fläschchen von MESC aus einer konfluenten Vertiefung einer 6-Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus einer gut (pro MESC Klon) der 6-Well-Platte mit MEF verhaftet Monoschichten (in Schritt 2.1.5 vorbereitet) und Samen der 3 ml mESCs auf dem MEF-Monoschicht. Hinzufügen 3 ul 1,000x LIF (10 ng / ml). Zurück Gerichte in den Brutschrank. </li></ol></li><li> ES-Zell-Wartung und Trypsin-vermittelte Durchgang HINWEIS: Medienwechsel täglich, oder Split basierend auf Zusammenfluss von MESC. Optimal, Ernte und Split / re-Platte die Zellen jeden zweiten Tag. <ol><li> ES-Zell-Medien entfernen und waschen mESCs mit 2 ml PBS. PBS zu entfernen. 1 ml 0,25% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 3-5 min. </li><li> Sammeln trypsiniert Zellen und übertragen sie in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Kräftig pipettieren die Zellsuspension zu brechen Klumpen von mWSR. 2 ml des vollständigen ES-Zellmedium zu der Zellsuspension, um das Trypsin zu neutralisieren. </li><li> Spin-Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und das Pellet in 3 ml ES-Zellmedium. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus 6-Well-Platten, die bereit verhaftet MEF-Monoschichten. Die geeignete Menge der Zellsuspension (basierend auf dem gewünschten Aufteilungsverhältnis) in 3 ml ES-Zellmedium in jede Vertiefung ausgesät zu werden. Hinzufügen 3 ul 1,000x LIF. Eine konfluente MESC gut aufgeteilt 1: 6 bereit für den Durchgang in 2 Tagen sein. </li></ol></li><li> OP9 / OP9-DL1 Zelle Instandhaltung <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen OP9 Zellen (befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 mit OP9 Medien) </li><li> 7 ml OP9 Medien bis 10 cm Gewebekulturschale. Fügen Sie die 3 ml resuspendierten Zellen in einem Dropdown-weise Weise, Verteilung Zellen im ganzen Platte. Legen Sie die Zellen über Nacht im Brutschrank. </li><li> Prüfen Sie am nächsten Tag den Zusammenfluss der OP9 Zellen. Wenn das Gericht viele tote Zellen enthält schwimm Remove die Medien und die 10 ml frischem OP9 Medien. Gibt die Schale in den Inkubator, wenn fast voll Fluss nicht beachtet wird. Split (unter Verwendung von Trypsin) 1: 4 in der Nähe der konfluenten Monolayer OP9. HINWEIS: Die Platten sollten gleiche Ebene Zusammenfluss wieder in ca. 2 Tagen zu erreichen. Achten Sie darauf, OP9 Zellen über-konfluent werden zu lassen. </li><li> Einfrieren der frühen Passagen der OP9 Zellen als Erweiterung Aktien. HINWEIS: Wir frieren 2 Fläschchen von OP9 Zellen von einem in der Nähe von konfluenten 10 cm Schüssel. Jedes Fläschchen der Expansion Lager weiter propagiert werden, um Arbeitsvorräte, die später in MESC Co-Kultur-Experimente verwendet werden zu erstellen. Bewahren Sie alle OP9 Bestände in flüssigem Stickstoff eingefroren und nicht in der -80 ° C-Gefrierschrank, da Temperaturschwankungen können sich negativ auf die Qualität der friert. </li></ol></li></ol> 3. OP9-DL1 Co-Kultur-Verfahren <ol><li> Co-Kultur-Zubereitungen <ol><li> Etwa eine Woche vor dem Beginn der Ko-Kultur, auftauen MEFs, mESCs und OP9 Zelle arbeiten stocks. Seit OP9-DL1 Zellen nicht bis Co-Kultur-Tag 8 erforderlich ist, tauen die OP9-DL1 Zellen während der ersten drei Tage nach der Co-Kultur-Initiation. Erhalten oder zu frieren alle Zellen, wie gebraucht. </li><li> Bestimmen die Anfangszahl von 10 cm-Platten mit OP9 Zellmonoschichten zu 80% Konfluenz auf Co-Kultur Tag 0, basierend auf dem Ausmaß des Experiments zu erreichen (zB Anzahl der MESC Klone unterschieden werden und die Anzahl der Co-Kultur-Zeitpunkte analysiert werden). Um nach einer Co-Kultur vorzubereiten, teilen nahezu konfluenten Gericht OP9 Zellen zwischen 1: 4 und 1: 6 zwei Tage vor, wenn die Monoschichten benötigt werden. HINWEIS: Man wird zumindest eine Platte pro ESC-Klon müssen. Typischerweise ausgesät eine einzige ESC-Klon auf einer einzigen Platte am Tag 0 (wie unten beschrieben) sollte genügend Zellen liefern zu sechs Platten am Tag 5 Gang Samen. Jeder Tag 5 Platte ermöglicht eine anschließende Analyse Zeitpunkt. </li><li> Seit OP9 Monoschichten kontinuierlich für die Co-Kulturpassage erforderlich sein, achten Sie darauf, immer maintain einer ausreichenden Anzahl von zusätzlichen OP9 Kulturplatten parallel mit der Co-Kultur. </li></ol></li><li> Tag 0: Einleitung der Co-Kultur <ol><li> Sammeln MESC wie in 2.3.1-2.3.4. Zählen Sie die Zellen. </li><li> Für jeden Klon MESC vorbereiten 5 x 10 4 MESC in 10 ml OP9 Medien pro Platte. Hinweis: Obwohl wir es nicht verwendet wird, stellen wir fest, dass ein alternatives Medium, das aus α-MEM, 10% FBS und 5 × 10 -5 M β-Mercaptoethanol wurde auch zur Verwendung bei der Differenzierung Co-Kulturen 10 gemeldet. </li><li> Entfernen Sie alte Medien aus OP9 Gerichte und fügen Sie die 10 ml MESC Suspension auf die Gerichte kümmern, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen. Die Schalen werden in der 37 ° C-Inkubator. </li></ol></li><li> Tag 3: Medienwechsel <ol><li> Gerichte zu entfernen aus dem Inkubator und beobachten unter dem Mikroskop. Kolonien sollten anfangen, Glanz verlieren und erscheinen abgeflacht. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus Speisen und schonend 10 ml frischem OP9Medien. </li><li> Bringen Sie die Co-Kulturschalen in den Inkubator. Mesoderm-wie Koloniebildung täglich visuell zu überwachen, um den Zeitpunkt der Zuführung OP9 Mono Vorbereitung für den nächsten Durchgang (Tag 5), die nicht bis ~ 80-90% der Kolonien visuell Mesoderm-ähnliche Morphologie Anzeige durchgeführt werden sollte informieren. Maximale Verschiebung des Tag 5 Zelltransfer Schritt 2 Tage. </li></ol></li><li> Tag 5: Trypsin-vermittelte Durchgang mit Pre-Beschichtung. HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 10 cm-Schalen mit optimal zusammenfließenden OP9 Zellen. Fahren Sie mit den nächsten Schritten nur, wenn die Co-Kulturen visuell die in Schritt 3.3.3 beschriebenen Funktionen anzuzeigen (siehe auch Repräsentative Ergebnisse). <ol><li> Entfernen Sie das Medium aus den Co-Kulturschalen. 4 ml PBS zu waschen. Schwenken Sie die PBS und entfernen. 4 ml 0,25% Trypsin und die Schalen in Inkubator für ~ 5 min. </li><li> Stören die Schicht von Zellen durch Trypsin heftiges Pipettieren, dabei nicht zu hohe Luftblasen einzuführen, bis einehomogenen, überwiegend Einzelzellsuspension erreicht. </li><li> 4 ml komplette OP9 Medien und mischen durch Pipettieren. Transferzellen in eine neue, leere Schüssel 10 cm und in den Brutschrank für 30 Minuten, damit sich die Zellen zu OP9 an der Schale haften. Diese &quot;Pre-plating&quot; Schritt reduziert die Anzahl von Zellen OP9 zum nächsten Schritt der Co-Kultur überführt. </li><li> Bereiten Sie 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 40 um Zellsiebe. </li><li> Sammeln nicht-adhärenten Zellen von der vorgalvanisierten Gericht und leiten sie durch die Zelle Sieb in die Röhre. Vorsichtig waschen die Schale mit 6 ml PBS und geben es durch den gleichen Filter, so dass die Zellen angebracht OP9 hinter sich. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 400 x g 5 Minuten bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und resuspendieren pelletierten Zellen in 3 ml vollständigem OP9 Medien. Zählen Sie die Zellen. </li><li> Entfernen Sie die Medien aus 10 cm-Platten mit optimal zusammenfließenden OP9 Zellen. </li><li> Für jedes Analysezeitpunkt, Samen 5 x 10 5 Zellen auf dem OP9 monoSchicht in 10 ml Endvolumen. </li><li> Mit 5 ng / ml humanes rekombinantes Flt-3L und die Schalen in Inkubator. </li></ol></li><li> Tag 8: hämatopoetischen Vorläuferzelle (HPC) Sammlung HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 6-Well-Platten mit OP9 oder OP9-DL1 Zellmonoschichten, so dass sie in der ~ 80% konfluent in der Zeit für diesen Schritt. <ol><li> Bereiten Sie 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 40 um Siebe. </li><li> Entfernen Sie die Gerichte aus dem Inkubator und beobachten unter dem Mikroskop. Shiny Cluster HPC sollte locker an die OP9 Monolage befestigt werden. Sammeln, wie viele dieser Zellen wie möglich durch Waschen (aber nicht übermäßig zu stören) die OP9 Monoschicht mit einer Pipette und die vorhandenen Medien auf dem Teller. Um Schaumbildung zu verhindern, zumindest 1 ml des Mediums in der Spitze der Pipette in dieser Sammlung HPC / Waschschritt immer verlassen. </li><li> Führen Sie die Zellen durch die 40 um Sieb in einem Rohr. 8 ml PBS auf die gleiche Platte und überprüfen unter dem Mikroskop, wenn alle HPC wirwieder gesammelt. Wiederholen des Wasch / Sammelschritt mit PBS und (falls erforderlich) mit kräftiger Waschen. Belastung der Zellen in das Rohr bereits die Zellen von der gleichen Platte enthält. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. </li><li> Bereiten Sie ein Master-Mix von 3 ml (pro Platte ausgesät am Tag 5) des OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in OP9 Medien mit Flt-3L + IL-7-Master-Mix (3 ml pro 10 cm Schale verarbeitet). Übertragen Sie die gesammelten Zellen von jeder Platte in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit OP9 Zellen. <ol><li> Um Zellen zu Monozyten-, B-Zell-Linien fahren oder Erythrozyten-, Saatgut die gesammelten Zellen auf OP9 Zellen. T-Zellen stammen, Saatgut der Zellen auf OP9-DL1 Zellmonoschichten. </li></ol></li><li> Legen Sie die 6-Well-Platten in Inkubator. </li></ol></li><li> Tag 10: Medienwechsel <ol><li> Bereiten Sie eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen für jede einzelne MESC Klon-Feeder-Zelltyp Combination in Co-Kultur. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus Master OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7. Bereiten Sie 3 ml für jeden gut. </li><li> Sanft sammeln Medien aus jedem Well der 6-Well-Platte kombiniert Medien von mehreren Brunnen die gleiche ESC Klon-Feeder-Zelltyp Kombination enthält. </li><li> 2 ml OP9 Medien Master-Mix (siehe 3.6.2) in jedes Well. </li><li> Zentrifuge die gesammelten Medien bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und jedes Pellet resuspendieren (sehr klein, wenn sichtbar) in 1 ml OP9 Medien Master-Mix (siehe 3.6.2) pro Vertiefung ursprünglich in Schritt 3.6.3 gesammelt. </li><li> Verteilen Sie 1 ml der Zellen wieder in jede Vertiefung, von dem die Medien ursprünglich erhoben bringt die Lautstärke in jedem gut 3 ml. Bringen Sie die Gerichte in den Inkubator. </li></ol></li><li> Tag 12: Kein Durchgang Trypsin HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 6-Well-Platten mit OP9 oder OP9-DL1 Zellen, so dass sie optimal in der Zeit konfluent für dieses s werdenTEP. Tag 12 ist ideal für die Durchflusszytometrie Analysen der Entwicklung von Erythrozyten-, Monozyten-und T-Zellen frühzeitig. <ol><li> Bereiten Sie ein Master-Mix (3 ml für jede Vertiefung, die in Co-Kultur fortsetzen wird) von OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7. </li><li> Vorbereitung 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 40 um Siebe (eine für jeden Klon ESC-Feeder-Zelltyp in Kombination Co-Kultur). </li><li> Kräftig pipettieren die vorhandenen Medien in jede Vertiefung, um alle Zellen (einschließlich der Monoschicht) in der gut zu zerlegen. Fahren Sie mit kraftvollen Pipettieren bis ein Zustand ähnlich einer Einzelzellsuspension erreicht. </li><li> Die gesammelten Zellen passieren durch das Sieb in das Rohr. 3 ml PBS in jedes Well zu waschen und zu sammeln alle übrigen Zellen. Pass-Zellen durch die gleiche Sieb. Kombinieren Sie mehrere Zellen aus dem gleichen Brunnen ESC Klon-Feeder-Zelltyp Kombination enthält. </li><li> Entsorgen Sie die Zelle Sieb und entfernen einen aliquoten entspricht einem gut (~ 6 ml) für jede gewünschteDurchflusszytometrie (oder andere) analysiert, um aus an diesem Tag durchgeführt werden. Bewahren Sie diese Aliquots auf Eis vor dem Gebrauch. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen. Das Pellet aus den 50 ml-Zentrifugenröhrchen in 3 ml pro Vertiefung Master-Mix neu ausgesät werden. 3 ml pro Vertiefung jeder Zellsuspension auf die entsprechende Feeder-Zelltyp und die Schalen in den Brutschrank. </li></ol></li><li> Tag 14: Medienwechsel <ol><li> Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.6 skizziert. </li></ol></li><li> Tag 16: Kein Durchgang Trypsin HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus 6-Well-Schalen optimal zusammenfließenden OP9 oder OP9-DL1 Zellen für diesen Schritt. HINWEIS: Tag 16 ist ideal für die Durchflusszytometrie-Analysen der B-Lymphozyten und T-Zellen mittlere Stufe. <ol><li> Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.7 skizziert. </li></ol></li><li> Tag 18: Medienwechsel <ol><li> Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.6 skizziert. </li></ol></li><li> Tag 20: Kein Durchgang Trypsin HINWEIS: Tag 20 is ideal für die Durchflusszytometrie analysiert der Mitte bis späten Stadium der Entwicklung T-Zellen. <ol><li> Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.7 skizziert. Falls gewünscht, tragen differenzierenden Zellen vergangenen Tag 20 Wechselmedienwechsel und kein Trypsin Gänge alle zwei Tage, mit täglichen Überwachung der Lymphozyten-Expansionsrate. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro.">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li><li>Pui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+expression+in+early+lymphopoiesis+influences+B+versus+T+lineage+determination.">Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination.</a> Immunity. 11, 299-308 (1999).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1101 (1994).</li><li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro.">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li><li>Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-2-deficient+blastocyst+complementation:+an+assay+of+gene+function+in+lymphocyte+development.">RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).</li><li>de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+T+lymphocytes+from+embryonic+stem+cell-derived+prehematopoietic+progenitors.">In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors.</a> Blood. 102, 1649-1653 (2003).</li><li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+autophagic+protein+beclin+1+early+in+lymphocyte+development.">A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development.</a> J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).</li><li>Lahiji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+TCR-alpha+gene+locus+control+region+activity+in+T+cells+derived+in+vitro+from+embryonic+stem+cells.">Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells.</a> J Immunol. 191, 472-479 (2013).</li><li>Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+embryonic+stem+cells+into+endothelial+cells+in+an+in+vitro+model+of+vasculogenesis.">Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis.</a> Blood. 93, 1253-1263 (1999).</li><li>Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+lineage+analysis+by+cell+sorting+and+culture+identifies+FLK1+VE-cadherin++cells+at+a+diverging+point+of+endothelial+and+hemopoietic+lineages.">Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages.</a> Development. 125, 1747-1757 (1998).</li><li>de Pooter, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+requires+GATA-2+to+inhibit+myelopoiesis+from+embryonic+stem+cells+and+primary+hemopoietic+progenitors.">Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors.</a> J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).</li><li>Watarai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+NKT+cells+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+bearing+rearranged+invariant+Valpha14-Jalpha18+TCRalpha.">Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha.</a> 115, 230-237 (2010).</li><li>Pipkin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+transfer+activates+and+delineates+a+locus+control+region+for+perforin.">Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin.</a> Immunity. 26, 29-41 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die OP9-DL1 Co-Kultursystem wurde verwendet, um die Rolle der verschiedenen Genprodukte bei der Entwicklung von Blutzelltypen aus Stammzellen zu untersuchen. 8,12,13 Es wurde auch ein effektives Modell, um die Funktion des Gens regulatorischen DNA zu untersuchen erwiesen während der zellulären Differenzierung. 9,14 Mit diesem Ansatz als Alternative zum gesamten Mausmodelle können erhebliche Einsparungen an Zeit und Kosten für die Experimente, die viele grundlegende Fragen der Hämatopoese-Adresse zu erhalten. , Anpassung des Protokolls für diese Zwecke erfordert jedoch Kenntnis von der potentiellen Variabilität unter MESC Klone, die in diesen Verfahren verwendet werden würde. Die Zeitleiste der veröffentlichten Protokoll ist zu erwarten von der durchschnittlichen, 7 Neben gut gepflegt, nicht manipulierten MESC Linie., MESC Klone für die Erzeugung von chimären Mäusen ausgewählt sind in der Regel von höherer Qualität und sehr robust in OP9 Co-Kultur durchführen . Auf der anderen Seite, MESC Klone Schwellen direkt von stabilTransfektion mit einem ektopisch integrierte Transgen unterschiedlichem Grad der Differenzierung anfänglichen Wirkungsgrad von durchschnittlich bis unterdurchschnittlich an. Das hier beschriebene Protokoll sieht eine strategische 1-2 Tag Verzögerung des Tages 5 Gang Schritt zum Ausgleich von Potentialdifferenzen diese vor der Induktion der Blutbildung in vitro. Der Tag 8 Durchgang ist der Schritt, bei dem die Ausführung dieses Protokoll hat das größte Potenzial für Fehler. Geduld, Übung und sorgfältige Beobachtung wird man ermöglichen, die Technik, die HPC Ernte optimiert und minimiert OP9 Mono Störung zu entwickeln. Über die Taste Tag 5 und Tag 8 Stufen, beinhalten die kritischen Parameter sorgfältige Wartung Zellkultur (insbesondere OP9 Zellen, wie oben beschrieben) und besonderes Augenmerk auf die im Protokoll verwendeten Reagenzien. Der kritischste Reagens der FBS. Deutliche viele FBS wird deutlich in ihrer Fähigkeit, dieses Verfahren unterstützen variieren. Mehrere Lose muss in o getestet werdenrder zu bestimmen, welche robust Differenzierung in diesem Test ergeben wird. Diese Co-Kultursystem hat seine Grenzen. Zum Beispiel ist dieses Modell nicht unterstützt die Differenzierung der einzelnen positiven CD4-Zellen. Ein Grund dafür ist das Fehlen der Expression des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-II-Antigen-Präsentation Infrastruktur in den OP9 Zellen. 1 Zelloberflächenpräsentation des Antigens durch MHC-Klasse II für die richtige Entwicklung der CD4 SP-Zellen erforderlich. Die CD8-Zellen, die entstehen SP tun stellen eine Mischung aus reifen und unreifen CD8 SP Thymozyten Stufen. 1 Darüber hinaus erfolgreiche Transplantation von MESC abgeleitet T-Zell-Vorläuferzellen in eine Maus bedarf der vorherigen Durchgang durch fetalen Thymus Organkultur. 1 Dennoch ist diese Technologie hat sich seine versprechen als eine mächtige Ermittlungsansatz beiden zellulären und molekularen Fragen im Blut und die Entwicklung des Immunsystems, die bisher nur möglich, in v erkunden warenivo. So, abgesehen von, einen neuen Weg, um raschere Fortschritte in diesen Fragen, breitere Annahme des OP9-ESC-Co-Kultursystem die weiteren Auswirkungen der Reduzierung der Verwendung von Versuchstieren haben zu machen.

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.1 This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.2 The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells3 with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).4 Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture &#8220;microenvironment&#8221; that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models5 and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.6 The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals. 
We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.7 We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos8 and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.9 We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this &#8220;day 5&#8221; passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1055">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:355px;">MATERIALS</td>
			<td style="width:127px;">COMPANY</td>
			<td style="width:141px;">CATALOG NUMBER</td>
			<td style="width:432px;">COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Stem cell qualified FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-125</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">L-alanyl L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HEPES buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-003-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Gentamicin Regent Solution (50 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">&#946;-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>0.22&#956;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">&#945;-MEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>12000-022</td>
			<td>Powder, reconstitute per manufacture recommendation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">FBS</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>SH 30396.03</td>
			<td>Testing of individual lots required&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Recombinant Human Flt-3 Ligand</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LIF&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Utrapure water with 0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MEFs mitomycin C treated</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PMEF-CF</td>
			<td>Any mitotically arresteded MEFs can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trypsin EDTA, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue culture dish 100 X 20 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Multiwell 6-well</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Tubes for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ES R1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">OP9 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">OP9-DL1 cells</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Cells can be requested from the Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker laboratory.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">FlowJo software&#160;</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>FACS data analyses</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of t cells in vitro from mouse embryonic stem cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Wenn auf MEFs in Gegenwart von LIF wachsen kann mESCs in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden. Unter idealen Bedingungen als kompakte Kolonien von Zellen durch ein leuchtender Ring im Phasenkontrast-Mikroskopie umgeben (Abbildung 1) erscheinen sie. Diese Kulturen muss täglich überwacht werden. Je nach dem Zusammenfluss der Zellen, können Medien verändert oder Zellen können geteilt werden. Benachbarte MESC Kolonien nicht bis zur Berührung miteinander kommen. Eine normale, gesunde Kultur undifferenzierter mESCs ist ein wesentlicher Ausgangspunkt für die in-vitro-T-Zell-Differenzierung. Nach Einleitung Co-Kultur, ist es empfehlenswert, dass die Zellen vollständig konfluent, ohne überfüllt. Dies ist so die Mehrzahl der Zellen zur Aussaat von Zellen auf OP9 Monolayer geerntet sind MESC (eher als Feeder-Zellen). Wenn große Unterschiede in der Zusammenfluss sind unter den verschiedenen MESC Klone am Tag 0 unterschieden werden beobachtet, dann wäre es am besten sein, MEFs durch Voraus Einhaltung tis entfernenSue Kulturschalen (wie in Schritt 3.4.3-3.4.6 mit kompletten ES-Zellmedium), bevor das Zählen der mESCs für die Co-Kultur Aussaat. OP9 Zellen müssen auch vor der Co-Kultur Einleitung gehalten werden (wie in Abschnitt 2.4 beschrieben). Darüber hinaus wird angenommen, dass OP9 Zellen verlieren einige ihrer Eigenschaften mit verlängerter Kultur und / oder ausgeprägte Erhöhung ihrer Proliferationsrate 7 Vermeidung Split-Verhältnisse über 1:. 5 während der Wartung OP9 Zellen, und nach sechs Wochen Verwerfen kontinuierlichen OP9 Kulturen, So vermeiden Sie diese Fallstricke. Bei der anfänglichen Zellbesiedelung und Zellenübertragungsschritte der Co-Kultur (Tag 0, 5, 8, 12, 16), sollte OP9 Monoschichten in einem optimalen Bereich des Zusammenflusses ist. 2 zeigt die niedrige (2A) und hoher (Abbildung 2B) endet der Bereich von OP9 Zellkonfluenz ratsam für den Einsatz als Co-Kultur-Monoschichten. Ein Beispiel einer Über konfluenten Platte ist in FigUre 2C. Nicht optimale Zusammenfluss aufrechterhalten kann die Bildung von Adipozyten (2D), die in großen Mengen, kann sich negativ auf die Co-Kultur zu induzieren. Am Tag 0 wird der Co-Kultur auf OP9 Zellen anstelle OP9-DL1 Zellen begonnen, da Mesoderm Bildung auf OP9 Zellen begünstigt. Zellen werden auf OP9-DL1 Zellen-Monoschichten, die am Tag 8 beschichtet, um T-Zell-Produktion zu induzieren. Während einige MESC Klone optisch robust und quantitative (~ 90%) die Bildung von Mesoderm artige Kolonien von Tag 5 der Co-Kultur (3A-B) angezeigt wird, können andere Verzögerungen bei diesem Schritt (3C-F) an. Unter dem Mikroskop werden die Mesoderm-Kolonien wie in diesem Test abgeleitet wurden variabel ähnelt Wagenräder oder Krater (4A) oder Starbursts oder Röschen (4B) beschrieben. Während die veröffentlichte OP9-DL1 Protokoll spiegelt eine Norm der quantitativen Mesoderm-forma-tion von Tag 5 der Co-Kultur, 7 finden wir, dass nicht alle ESC-Klone zu erreichen, dass die Norm in diesem Zeitrahmen. In diesen Fällen haben wir das Medium am Tag 5 zu ändern und warten weitere 1-2 Tage vor der Durchführung des &quot;Tag 5&quot; Zellernte / Transfer-Protokoll. Das Ziel dieser Verzögerung ist, um visuell zu mesodermalen vor der Übertragung erlauben ~ 80-90% der ES-Zell-Kolonien. Es ist wichtig, deutlich zu machen, dass dieser 80-90% Zahl spiegelt eine streng visuelle Kriterium erkennbar durch einfache Phasenkontrast mikroskopische Untersuchung der Koloniemorphologie in den Co-Kulturschalen. Sie bezieht sich nur auf den Anteil der ESC-Kolonien, die den in 4 gezeigten ähnlich sind. Es ist möglich, dass einige ESC Klone dieser visuellen Kriterium nicht erreicht, selbst nach einer zweitägigen Verzögerung. In einem solchen Fall ist es möglich, für die blutbildenden Vorläufern mesodermalen Durchflusszytometer Zellsortierung für Flk-1 +-Zellen anzureichern, wie es zuvor beschrieben wurde. 6,11 in jedem Fall für das SAke der Nomenklatur Bequemlichkeit, wir &quot;stellen Sie die Uhr&quot; und beziehen sich auf den Tag der Mesoderm-Kolonie wie Transfer als &quot;Tag 5&quot; Wenn mehrere ESC-Klone, die parallel zu unterscheiden, ist es möglich, dass einige Co-Kulturen wird bereit für den Tag 5 Durchgang auf Zeit zu sein, während andere zurückbleiben. In diesem Fall empfiehlt es sich, den Durchgang von allen Co-Kulturen zu verzögern, bis die langsameren aufholen Klone zu den anderen. Die Verzögerung scheint nicht schaden, um die &quot;auf Zeit&quot; Co-Kulturen zu tun, aber profitiert die nachfolgende Differenzierung der langsameren Klone sehr viel. Tag 8 (dh drei Tage nach mesodermalen Kolonie Transfer) sieht die Entstehung und Anhäufung von HPC. HPC sind glänzend Cluster von Zellen, die lose an den OP9 Feeder-Zellen (Figur 5) angeklebt sind sichtbar. Eine sorgfältige Waschverfahren, mit einer Pipette und die Medien auf dem Teller, wird zu lösen und sammeln die HPC, währenddie OP9 Mono weitgehend intakt (6A-C). Dies ist vielleicht der Technik empfindlichen Schritt des Protokolls. Es braucht etwas Übung, um die entsprechenden Bewegungen und Medienausstoßdruck zu finden, um das gewünschte Gleichgewicht der maximalen Ernte von HPC mit minimaler Unterbrechung des Feeder-Schicht zu erreichen. Es ist akzeptabel, wenn einige der OP9 Monoschicht abhebt, da die Mehrheit aller Streumonoschicht in der 40 um Nylon-Mesh-fangen werden nach der Filterung. 6D zeigt eine Monoschicht nach über Pipettieren was zu mehr Mono Störung als nötig. Während dieser Waschschritt ist es wichtig, unter dem Mikroskop, ob alle HPC gesammelt worden zu überprüfen, und passen Sie die Waschdruck. Fortschritt der Co-Kultur kann durch Flusszytometrie überwacht werden. Gezielt analysieren die nicht-hämatopoetischen erythroid Nachkommen des ESC, ist es wichtig, zuerst zu Tor auf Live-CD45 +-Zellen.Dieser Schritt Bildschirme aus den OP9 Zellen aus den Analysen, während die Verwendung von DAPI oder andere Kernfärbung Farbstoff ermöglicht den Ausschluss von nicht lebensfähigen Zellen. Am Tag 12 sollten viele Cluster von kleinen, runden, glänzend Zellen sichtbar sein. Es ist nicht notwendig, um die Zellen in diesem Stadium zu zählen. Wir haben aber beobachtet, dass zu leben, sind gated Durchflusszytometrie Veranstaltung zählt in der Regel im Bereich von 1-3 x 10 5 pro Tag 12 Co-Kultur gut. Durchflusszytometrie-Analysen von Live-gesteuerten Zellen auf der OP9 Monoschicht unterschieden werden erythroiden ergeben (CD45 neg, TER119 +) und monozytären (CD45 +, CD11b hallo) Linien (7A). Analysen von Live-, CD45 +-Zellen differen auf OP9-DL1 Monoschichten sollte Marker charakteristisch für CD4 / CD8 doppelt negativ zu offenbaren (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, neg CD4, CD8 neg) und DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) Stufe T-Zellen (7B </stro<html> ng&gt;). Nach Tag 16, gibt es eine signifikante Zunahme in der Menge von kleinen, runden, glänzend Zellen in den Kulturen. Auf OP9-DL1s, T-Zell-Differenzierung Produkte Fortschritt auf die DN3 (CD44 neg, CD25 + CD4 neg, CD8 neg) und DN 4 (CD44 neg, CD25 neg, neg CD4, CD8 neg) Stufen. Einige DP (CD4 +, CD8 +) T-Zellen können auch beginnen Schwellen Tag 16 (7B). HPC ausgesät auf OP9 Zellen ergeben B-Zellen (CD19 +) bei Tag 16. Am Tag 20 der OP9-DL1-MESC Co-Kultur, wird es große Mengen von DP T-Zellen und einzelne positive (SP) CD8 + T-Zellen vorhanden (sein 7B). Abbildung 8 zeigt ein Diagramm mit einer Zusammenfassung der wichtigsten Schritte der oben genannten Verfahren, und die vorgeschlagenen Analysezeitpunkten während der Co-Kultur. ghres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Phasenkontrastmikroskopie Bild von undifferenzierten mESCs (scharfkantige Kolonien) wächst auf einem MEF Monoschicht (100-facher Vergrößerung). <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 2:. Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen von Mono OP9 Konfluenz (A) Niedrigster und (B) höchsten Ebenen Konfluenz ratsam für Co-Kultur-Passage / Aussaat (40-facher Vergrößerung) (C) Beispiel eines über konfluenten OP9 Monoschicht (40-facher Vergrößerung. ). (D) Über konfluenten OP9 Monoschicht (200-facher Vergrößerung) mit Adipozyten-Bildung (groß, Vesikel enthalten, Zellen). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Phasenkontrastmikroskopy Bilder von Mesoderm-wie Koloniebildung bei &quot;Tag 5&quot; der Co-Kultur. (A) 40x und (B) 100 x Ansichten von Co-Kulturplatten mit&gt; 90% mesodermalen Differenzierung Kolonie. Diese Platten sind bereit für Tag 5 Gang. (CF) Beispiele für Tag 5 Co-Kultur-Platten, die 1-2 Tage Aufschub vor der Übertragung (C &amp; E, 40-facher Vergrößerung, D &amp; F, 100-facher Vergrößerung) erfordern. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen von der Vielfalt der Mesoderm-Kolonie wie Formationen am Tag 5 der Co-Kultur (A) Die Koloniemorphologie als &quot;Krater&quot; bezeichnet oder (B) Die Kolonie Morphologie bezeichnet wird. &quot;Wagon Wheel&quot;. als &quot;Starburst&quot; oder &quot;Blümchen&quot; (200-facher Vergrößerung). Abbildung 5. Phasenkontrastmikroskopie Bild von Tag 8 Co-Kulturplatte mit Trauben von kleinen, runden, glänzend HPC auf einem OP9 Monoschicht (40-facher Vergrößerung). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig6highres.jpg" /> Abbildung 6:.. OP9 Monolage nach HPC-Sammlung auf Co-Kultur-Tag 8 (AC) entsprechenden Bereich von Störungen des OP9 Monolage nach sorgfältigem Waschen zu ernten HPC (D) Ein Beispiel für eine Monolage, die OP9 gewesen ist von Tag zu Tag über gestört 8 HPC Ernteverfahren. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig7highres.jpg" /> Abbildung 7: Repräsentative Durchflusszytometrie (FACS) analysiert zu bestimmten Zeitpunkten während derMESC Differenzierung in vitro. (A) Färbung auf erythroiden (links), monozytären (Mitte) und B-Zellen (rechts) Produkte MESC-OP9 Co-Kultur am Tag 12 bzw. 16, wie angegeben. (B) Färbung zu entwickeln T-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten MESC-OP9-DL1 Co-Kultur. Bitte siehe Text detaillierte Beschreibungen der Immunphänotypen. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig8highres.jpg" /> Figur 8. Schematische Darstellung der Schritte des MESC-OP9 Co-Kulturverfahren. (A) die Schlüssel-Zellenübertragungsschritte der ersten acht Tagen der Co-Kultur. Die ungefähre Anzahl der Zellen auf OP9 Zellen beimpft an den Tagen Null und fünf sind angegeben. (B) Am Tag 8 Übertragungsschritt und der erwarteten Zelldifferenzierung Produkte durch Durchflusszytometrie an wichtigen Zeitpunkten der Co-Kultur nachgewiesen. Bitte siehe Text detaillierte Beschreibungen der Immunphänotypen.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

derivation-of-t-cells-in-vitro-from-mouse-embryonic-stem-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

10.9K Aufrufe.  City University of New York. Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Serie: Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

Ableitung von Thymuslymphom T-Zell-Linien aus Atm - / -</sup Und P53 - / -</sup Mäuse

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll