Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management. 
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. &#197;ke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsr&#229;det Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten S&#246;derberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.

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The authors have nothing to disclose.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die robuste Induktion von menschlichen CD4 + FOXP3 + iTregs von menschlichen naiven CD4 + T - Zellen. Es enthält ein neues Protokoll , das wir vor kurzem beschrieben, eine Kombination aus TGF-β unter Verwendung ATRA und Rapamycin, für die Induktion von iTregs mit überlegener in vitro suppressive Funktion 22. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Protokollen, ist ein weiterer Vorteil der Induktion verschiedener iTreg Populationen parallel von unterschiedlichen Protokollen, die den direkten Vergleich der Wirkungen bestimmter iTreg induzierende Faktoren ermöglicht, zusammen mit Kontrollzellen, die in Gegenwart von IL-2 allein aktiviert werden, . Die beschriebenen Protokolle ermöglichen reproduzierbare Induktion von FOXP3 mit geringer Spender Variation. Naiver CD4 + T - Zellen in diesem Protokoll sind durch magnetisch aktivierte Zellsortierung isoliert, sondern fluoreszenzaktivierte Zellsortierung ist ebenfalls möglich. Die erwartete Rendite von naiven CD4 + T - Zellen , die mit diesem Protokoll ist in der Regel zwischen 5-10%,<html> sondern hängt stark von dem Spender (Alter) und erscheint auch niedriger, wenn hohe Anteile an Erythrozyten vorhanden sind. Wenn eine Schätzung erforderlich ist, kann PBMCs gefärbt werden (siehe Schritt 1.4) während der Monozytendepletion Schritt. Typischerweise ist die Ausbeute von naiven CD4 + T - Zellen etwa die Hälfte der &quot;percentage naiven CD4 + T - Zellen der Lymphozyten - Gate&quot; in der PBMC - Färbung. Dieses Protokoll verwendet begrenzte Mengen an CD25 beads 29 CD25-hoch (nTreg) Zellen zu erhalten. Diese sind jedoch nicht rein Tregs, aber diese sind nur in Tregs angereichert als Positivkontrolle verwendet werden. Wenn reine Tregs benötigt werden, sollten andere Kits verwendet werden (wie zum Beispiel in Kombination mit CD4 - Anreicherung und CD127-Depletion) oder alternativ CD25 + Zellen mit 8 ul CD25 Perlen vorangereicherte pro 10 7 Zellen und gefärbt und sortiert durch Fluoreszenz-aktivierte Zell Sortierung mit hohen CD4 + CD25 ++ Gating. Auch die Aufnahme von anderen Markern, wie beispielsweise CD127 Ausschluss, sollte berücksichtigt werden. _content &quot;&gt; Es ist wichtig , dass FOXP3 ist zu prüfen, aber nicht ausreichend Treg Identität zu verleihen 30. Während iTregs verwendet werden können , bestimmte Aspekte, beispielsweise zu untersuchen, FOXP3 Regulierung, es ist jedoch wichtig zu beachten , dass iTregs von nTregs abweichen in mehreren Aspekten. Es ist daher von entscheidender Bedeutung für Kultur nTregs (idealerweise vom selben Spender stamm) parallel zu iTregs in allen Tests zum Vergleich. die Differenz zwischen nTregs und iTregs durch nur eine teilweise Überlappung der nTreg und iTreg Transkriptom veranschaulicht wird, wie gemessen in murine iTregs 31. Andere Treg Unterschrift Gene zusätzlich zu FOXP3 aus diesem Grund sollte gemessen werden, und in menschlichen Zellen Diskriminierung von aktivierungsinduzierten FOXP3 Expression zu gewährleisten. zum Beispiel sollte iTregs höhere Expression von CD25, CTLA-4 und EOS zeigen im Vergleich auf aktivierten T-Zellen, während die Expression von IFN-γ und SATB1 sollten von den hier beschriebenen Protokolle induziert in nTregs und iTregs niedrig sein, wie zuvor veröffentlicht <sup&gt; 22. Eine weitere wichtige Hauptunterschied zwischen nTregs und iTregs ist der Mangel an stabilen Foxp3 - Expression in iTregs, die am ehesten entspricht Methylierung des TSDR Region im FOXP3 locus in iTregs 13. Auch auf einer genomweiten Maßstab, wurde beschrieben , dass epigenetische Muster von DNA - Methylierung und Histon - Modifikationen in murine iTregs nicht die Muster in nTregs 30 gefunden zu reflektieren. Wir haben bereits zuvor, dass durch die hier induzierte iTregs Protokolle beschrieben, im Gegensatz zu nTregs, zeigte keine TSDR Demethylierung. Dementsprechend verloren iTregs FOXP3 wenn restimuliert, aber beibehalten FOXP3 Ausdruck , wenn eine weitere, die in Gegenwart von IL-2 und ohne Restimulation 22. Interessanterweise durch ein alternatives Protokoll M2 induzierten iTregs Makrophagen mit Stände angezeigt FOXP3 Stabilität verbessert, trotz Mangel an TSDR Demethylierung und TGF-β ist ursächlich für FOXP3 Induktion 27. Änderung der iTreginduzierenden Protokolle durch Zugabe von Verbindungen (wie Vitamin C oder Schwefelwasserstoff) , die Ten-elf Translokation (TET) Methylcytosin Dioxygenase Enzyme beeinflussen, wie 32 kürzlich beschrieben - 34, darf die DNA - Methylierung in FOXP3 Stabilisieren von beeinflussen. Auch die Stimulationsstärke und Timing hat einen Einfluss auf Foxp3 - Expression und Stabilität 35. In diesem Sinne wurde die Verwendung von bead-gekoppelter CD3 / CD28 - Antikörper anstelle von platten gebundenen Antikörper gezeigt , wenn auch 36 TSDR Demethylierung unabhängigen murine iTreg in vivo suppressive Funktion und Stabilität zu erhöhen. Ein weiterer Faktor, der als eine mögliche Quelle der Variation berücksichtigt werden muss, ist die Verwendung von Serum, das nicht definierte Faktoren, einschließlich TGF-β enthält, die auch aus Rinderquelle 100% kreuzreaktiv mit humanen Zellen ist. Ebenso kann die Quelle und der Aktivität von IL-2 drastisch die Ergebnisse FOXP3 Induktions beeinflussen. Ein wichtiger feature von Treg ist ihre suppressive Fähigkeit, die anschließend in diesem Protokoll generiert mit iTregs getestet werden muss. Es sollte beachtet werden, dass die Unterdrückung Assays mit iTregs nicht trivial und die Literatur zu suppressive Fähigkeiten iTregs ist umstritten. Mehrere Methoden und Protokolle suppressive Funktion der menschlichen Treg anderswo 22,37 veröffentlicht wurden zur Beurteilung - 41, mit in vitro Proliferationsassays die am häufigsten verwendete basierend auf Durchflusszytometrie Auslesungen wie Verdünnung von Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) ist. Es ist wichtig, vor der Verwendung in iTregs Unterdrückungs Assays zu waschen und zu ruhen, und es muss berücksichtigt werden, dass iTregs im Gegensatz zu nTregs nicht anergischen sein können, aber sich während der Unterdrückung Assays proliferieren. Wir halten es für äußerst wichtig, zu verwenden `mock&#39; stimulierten T-Zellen als Kontrolle Suppressorzellen den Grad der unspezifischen Unterdrückung (wie durch CTLA-4-Expression, IL-2 consum zu identifizierenption und Kultur übermäßiges Wachstum von aktivierten T-Zellen), die auf FOXP3 + Treg-spezifischen Wirkungen in keinem Zusammenhang ist, und das häufige Fehlen dieser Regelung kann auf einige Kontroversen in der Literatur beitragen. Mit dieser Steuerung definierten wir , dass nur TGF-β / ATRA / Rapa-induzierte iTregs unterdrückende Aktivität in vitro 22 angezeigt. Daraus schließen wir, dass suppressive Aktivität bezüglich (wenn auch nicht höchsten Anteil an FOXP3 + Zellen), TGF-β / ATRA / Rapa die beste Kombination von Faktoren der beschriebenen Protokolle iTregs zu induzieren. Trotzdem ist suppressive Aktivität in vitro nicht notwendigerweise unterdrückende Aktivität in vivo zu reflektieren, und in der Tat haben wir festgestellt , daß menschliche durch diese Protokolle erzeugt iTregs nicht in einem xenogenen Modell Graft - versus -host Krankheit unterdrücken hat zumindest unter den Bedingungen 22 getestet. Dies kann zu einer instabilen FOXP3 Expression in Beziehung gesetzt werden , die in iTregs auf Restimulation verloren wurde, im Einklang mit einem Mangel an TSDR Demethylierung 22 </sup&gt;. Abhängig davon, welcher Aspekt iTreg Merkmale (hoher Anteil an FOXP3 + Zellen, überlegene unterdrückende Aktivität, FOXP3 Stabilität) ist am wichtigsten für eine spezielle Fragestellung können unterschiedliche Protokolle geeignetsten sein, diese Fragen zu untersuchen, wodurch es schwierig wird die allgemein zu definieren &quot;besten &quot;Protokoll für die Treg Induktion. Weiterhin mehrere oben beschriebenen experimentellen subtile Unterschiede können die Ergebnisse beeinflussen und kann zu Kontroversen im Hinblick auf Phänotyp und suppressive Funktion der TGF-β-induzierte iTregs die zwischen Berichten auch bei scheinbar ähnlichen Protokollen für iTreg Generation 42 erscheinen beitragen. Beispielsweise auch innerhalb eines Labors, beobachteten wir , dass mit TGF-β und IL-2 in Serum enthaltendem RPMI Medium induziert iTregs einige suppressive Aktivität zeigten verglichen Zellen 27 zu steuern, während TGF-β / IL-2-induzierte iTregs erzeugten definierten serumfreien T - Zellenkulturmedium war nicht 22, drotz ähnliche Niveaus von FOXP3. Zukünftige Anwendungen auf diesen Protokollen basieren sollte sich bemühen, weitere Treg Induktion Bedingungen zu optimieren, einen Phänotyp mit stabiler FOXP3 Expression zu erreichen, TSDR Demethylierung, stabilen Phänotyp ohne Umwandlung in Zytokin-produzierende Effektor-T-Zellen und optimal unterdrückende Aktivität. Die Weiterentwicklung von iTreg Induktionsprotokollen kann nützlich sein, für adoptiven Transfer in die Zukunft nähert, in welcher Therapie von Treg-Transfer für die potenzielle Behandlung von Autoimmun- und Entzündungserkrankungen vielversprechend ist.

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulatorischen T - Zellen (Tregs) unterdrücken andere Immunzellen und sind kritische Vermittler der peripheren Toleranz, die Verhütung von Autoimmun- und übermäßige Entzündung 1. Die Bedeutung der Treg wird von der menschlichen Krankheit immunodysregulation Polyendokrinopathie Enteropathie X-chromosomal-Syndrom (IPEX), in dem Verlust von Treg aufgrund von Mutationen in der `Master&#39; Treg Transkriptionsfaktor forkhead Feld P3 (FOXP3) führt zu schweren systemischen Autoimmunerkrankung exemplifiziert, tödlich in einem frühen Alter. Allerdings wirken Tregs als zweischneidiges Schwert in das Immunsystem , wie sie auch Antitumor - Immunität in bestimmten Einstellungen 2 behindern. Die therapeutische Beeinflussung von Treg Anzahl und Funktion ist deshalb Gegenstand zahlreicher klinischer Untersuchungen. Bei Krebs Erschöpfung der Tregs kann wünschenswert sein , und einige Erfolg klinischer Ansätze fördert die weitere Forschung 3. In Autoimmun- und Entzündungserkrankungen, zusätzlich zu den therapeutischen Wirkungen von Treg in seveNeueste in-Man - Studien von Adoptiv Treg Transfer ral Maus Krankheitsmodelle, um zu verhindern Graft - versus -host Erkrankung (GvHD) 4 - 7 und die Sicherheit zu bewerten bei Typ - 1 - Diabetes 8 zeigten vielversprechende Ergebnisse zu behandeln. Natürlich vorkommende Treg (nTregs) Thymus abgeleitete tTregs umfassen und peripher induzierte pTregs, mit nicht-redundanten wesentlichen Funktionen in die Aufrechterhaltung der Gesundheit von 9 bis 11. Allerdings sind nTreg Zahlen begrenzt, die komplementären Ansatz zur Induktion Tregs (iTregs) in vitro aus naiven T - Zell - Vorläufer 12 ermutigend. Noch Stabilität iTregs, vermutlich aufgrund des Fehlens von Demethylierung in der sogenannten Treg-spezifischen demethylierten Bereich (TSDR) im FOXP3 Genlocus 13 bleibt ein Problem und einige Studien zeigen , dass Treg in vivo induziert 14 stabiler sind. Bis heute bleibt FOXP3 das beste Protein mArker für Tregs , aber es ist nicht absolut spezifisch , weil die menschliche konventionellen CD4 + CD25 - T - Zellen transient Zwischenstufen FOXP3 auf 15,16 Aktivierung auszudrücken. Obwohl erhebliche Fortschritte bei der Aufklärung der Regulation der Foxp3-Expression erzielt wurden, bleibt noch viel vor allem in menschlichen Zellen in Bezug auf die Induktion, Stabilität und Funktion von FOXP3 entdeckt zu werden. Trotz der Unterschiede zu nTregs, in vitro induzierten FOXP3 + CD4 + T - Zellen können als Modellsystem verwendet werden , um molekulare Mechanismen der FOXP3 Induktion zu studieren und als Ausgangspunkt zu entwickeln Protokolle in die Zukunft , die für die Erzeugung von iTregs ermöglichen , die mehr sind ähnlich wie in vivo erzeugt Tregs, die für Adoptivtransfer - Strategien in der Zukunft anwendbar sein könnte. Es gibt keine `Gold Standard&#39; Protokoll für die menschliche iTregs induzieren und aktuellen Protokolle auf nachahmt Treg-induzierenden Bedingungen in vivo entwickelt basiert: Interleukin 2 (IL-2) Und β - Wachstumsfaktor (TGF-β) Signalisierungs Transformation für FOXP3 Induktion in vivo entscheidend 17 und all-trans - Retinsäure (ATRA) - , die in vivo durch darmassoziierten dendritischen Zellen produziert wird - verwendet wird , häufig FOXP3 Induktion zu verbessern in vitro 18-21. Wir haben zusätzliche menschliche Treg-induzierende Protokolle Butyrat 22, einen Darmmikrobiota gewonnenen Fettsäure kurzkettigen mit entwickelt , die vor kurzem murine Treg Induktion 23,24 zu erhöhen wurde gezeigt. Wir stellten auch vor kurzem ein neues Protokoll für die Erzeugung von iTregs mit überragender Unterdrückungsfunktion in vitro durch eine Kombination von TGF-β mit ATRA und 22 Rapamycin, letztere eine klinisch zugelassenen mammalian target of Rapamycin (mTOR) sein Inhibitor, der bekannt ist , zu fördern FOXP3 Wartung während der menschlichen Treg Expansion 25,26. Diese Methode beschreibt die reproduzierbarvitro - Erzeugung von humanen CD4 + FOXP3 + iTregs eine Reihe von verschiedenen Bedingungen verwendet, und deren anschließende Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie und quantitative reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) protokollspezifische Muster der Expression von FOXP3 und andere Treg Signatur - Moleküle zu offenbaren solche wie CD25, CTLA-4, EOS, sowie Unterdrückung von IFN-γ und SATB1 Ausdruck 22. Die erzeugten Zellpopulationen können für funktionelle Assays verwendet werden, unterdrückende Aktivität in Bezug auf oder für molekulare Studien, entweder allgemeine FOXP3 Regulierer über oder Effekte für bestimmte Verbindungen wie Butyrat oder Rapamycin zu studieren. Ein weiteres Verständnis der molekularen Mechanismen Treg Differenzierung der Fahrt ist sehr relevant für zukünftige therapeutische Ansätze für Autoimmun- oder Krebs gezielt Moleküle in Treg Generation und Funktion beteiligt Ziel.

<table><tbody><tr><td>All-trans retinoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD25 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD28 antibody, LEAF Purified&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PE clone UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Density centrifugation medium: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye, eFluor 780&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 or 65-0865-18&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Staining Buffer Set</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>human naive CD4 T cell isolation kit II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Human serum albumin 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin from Streptomyces conglobatus &gt;98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 &amp;#956;g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet plastic, individually packed</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2, CF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; assay ID: Hs01085834_m1</td><td>Caution: contains paraformaldehyde</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; assay ID: Hs04194366_g1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Caution: contains paraformaldehyde</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of human cd4+foxp3+ induced regulatory t cells (itregs) from na&#239;ve cd4+ t cells using a tgf-&#946;-containing protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

Abbildung 1 zeigt ein Schema des experimentellen Aufbaus. Figur 2 zeigt eine repräsentative Reinheitskontrolle Färbung für magnetisch isoliert naive CD4 + T - Zellen und nTregs. B ild 3A zeigt die Durchflusszytometrie Gating - Strategie und 3B zeigt repräsentative FOXP3 und CD25 - Zytometrie Anfärbungen am Tag fließen 6 der Kultur unter den angegebenen iTreg oder Kontrollbedingungen. Nach in vitro Stimulation upregulate meisten Zellen CD25, die in Gegenwart von Rapamycin reduziert wird. Nur unter Zugabe von iTreg auslösenden Faktoren eine klare Population von FOXP3 + Zellen zeigt sich , was auch in CD25 + Zellen unter iTreg Bedingungen angereichert ist. 3C zeigt die phänotypischen Erscheinungsbild iTreg Kulturen im Mikroskop mit Zellen gesehen als dunkle Cluster vermehren. Jede i<html> Treg Zustand zeigt eine spezifische und reproduzierbare Muster der Zellproliferation: Unter diesen Kulturbedingungen, TGF-β erhöht Proliferation leicht und ATRA erhöht die weitere Verbreitung. Zur gleichen Zeit wird die Hemmung der Proliferation von Rapamycin ist durch die stark reduzierte Clustergröße deutlich. Das mikroskopische Bild der Proliferation Stärke entspricht auch Gesamtzellzahlen (Daten nicht enthalten). Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse der qRT-PCR - Analysen von FOXP3 mRNA Induktion in iTreg (und Kontrolle) Kulturen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Wie für FOXP3 Protein ist FOXP3 mRNA - Expression in allen iTregs höher im Vergleich stimulierten Zellen zu steuern, mit Rapamycin behandelten iTregs einem relativ niedrigen Niveau, die im Vergleich zu anderen iTregs. FOXP3 mRNA in nTregs höher ist als in iTregs. es / ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Versuchsschema für iTreg Induktion, nTreg Isolation und Treg - Analyse. Menschliche naive CD4 + T - Zellen wurden aus buffy coats isoliert und in Serum-freiem Medium mit anti-CD3 und anti-CD28 - Antikörper stimuliert plus 100 U / ml IL-2 für bis zu 6 Tage, entweder in Abwesenheit ( `mock Kontrollzellen &#39;) oder Anwesenheit verschiedener Treg-induzierende Faktoren ( `iTreg&#39;) wie angegeben. nTregs werden isoliert und parallel getestet. Die phänotypische Analyse kann mittels Durchflusszytometrie und qRT-PCR erfolgen. Geändert von Schmidt, A. et al. 2016 22. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55015/55015fig2.jpg" /> Abbildung 2: Zell Reinheit der Bevölkerung beginnen. Naïve menschliche CD<html> 4 + T - Zellen wurden durch die Naïve CD4 T - Zell - Isolation Kit II, Mensch isoliert. Oberplatte: Naive CD4 + T - Zell - Reinheit, bezogen auf CD4, CD45RA und CD45RO, war 94 bis 98% und die Reinheit für einen repräsentativen Spender von mehr als 30 gezeigt ( `Tnaïve&#39;). Ex vivo Treg ( `nTreg&#39;) wurden isoliert durch begrenzte Mengen an CD25 Microbeads verwenden und als positive Kontrolle für iTreg Experimente verwendet. nTreg Reinheit eines repräsentativen Spenders, basierend auf CD25 und CD4, dargestellt ist. Untere Tafel: Intrazelluläre FOXP3 Färbung (durchgeführt , wie in 3 und pre-gated an lebenden CD4 + Zellen) für naive CD4 + T - Zellen und nTregs jeweils gezeigten Zellen vom gleichen Spender wie in der oberen Tafel verwendet wird . Geändert von Schmidt, A. et al. 2016 22. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55015/55015fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die phänotypische Erscheinung iTregs und nTregs. Menschliche naive CD4 + T - Zellen wurden in serumfreien Medium unter den angegebenen Bedingungen. T-Zellen wurden mit anti-CD3 und anti-CD28-Antikörper plus 100 U / ml IL-2 ( `Stim.&#39;) stimuliert. Wo angegeben, TGF-β1 ( `TGF&#39;), Rapamycin (` Rapa&#39;), all-trans-Retinsäure ( `ATRA&#39;) oder Butyrat zugegeben. nTregs (ex vivo isolierten peripheren Blut CD25 ++ Zellen) wurden unstimulierte links ( `unstim.&#39;) und als positive Kontrolle verwendet. Unstimulierten naiver T-Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet. (A) Am Tag 6 der Kultur wurden die Zellen gefärbt mit Oberflächen Antikörper einschließlich anti-CD25 und anti-CD4, dann mit fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff gefärbt und anschließend fixiert / permeabilisiert und intrazellulär mit anti-FOXP3 und Anti-CTLA-4 oder Isotyp gefärbten Fortsetzung<html> rol Antikörper. Akquisitions- und Kompensations wurde auf einem Cyan ADP Durchflußzytometer durchgeführt und die Daten wurden mit der FlowJo Software analysiert. Die Gating-Strategie wird durch die roten Pfeile angedeutet, und das gezeigte Beispiel ist ein iTreg Probe induziert mit TGF + ATRA. (B) Zellen wurden wie in (A) gefärbt, und FOXP3 und CD25 - Expression in T - Zellen und Kontroll iTregs durch verschiedene Protokolle induziert gezeigt. Die Pseudo Plots zeigen repräsentative FOXP3 und CD25 Anfärbungen für einen Spender, auf Singulett - pre-gated, leben CD4 + Zellen , wie in (A). Der Isotyp Beispiel ist für eine iTreg gezeigt (Stim. + TGF + ATRA) Probe. (C) Repräsentative Mikroskopiebilder (40 - facher Vergrößerung) der einzelnen 96U-Plattenvertiefungen von kultivierten Zellen für 4 Tage. Dunkle Cluster von Zellen repräsentieren wuchernden Zellen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55015/55015fig4.jpg" /> Abbildung 4: FOXP3 mRNA - Expression bei der Verwendung von verschiedenen Protokollen für iTreg Differenzierung. iTregs wurden wie in Abbildung 3 unter den angegebenen Bedingungen erzeugt werden , und zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen und Zell RNA extrahiert wurde. Unstimulierten naiven T - Zellen und nicht - stimulierten nTregs, wurden am Tag 0 entnommen Proben durch qRT-PCR analysiert, und FOXP3 mRNA - Expression wurde für jede Probe zu RPL13A Expression normalisiert. FOXP3 mRNA - Expression in nicht - stimulierten naiven T - Zellen wurde auf 1 gesetzt, und mehrfache Änderung der FOXP3 mRNA berechnet wurde. Dargestellt sind Mittelwerte und den Bereich der PCR replizieren Brunnen für einen repräsentativen Spender. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 + T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.1K Aufrufe.  Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory.  Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 + T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten. 

Serie: In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly secretes GM-CSF without producing interferon (IFN)&#947; or interleukin (IL)-17 and is found to play an essential role in the autoimmune neuroinflammation. A method of isolation of naive CD4+ T cells from a single-cell suspension of splenocytes and THGM cell generation from naive CD4+ T cells would be a useful technique in the study of T cell-mediated immunity and autoimmune diseases. Here we describe a method that differentiates mouse naive CD4+ T cells into THGM cells promoted by IL-7. The outcome of the differentiation was assessed by the analysis of the cytokines expression using different techniques, including intracellular cytokine staining combined with flow cytometry, a quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR), and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Using the THGM differentiation protocol as described here, about 55% of the cells expressed GM-CSF with a minimal expression of IFN&#945; or IL-17. The predominant expression of GM-CSF by THGM cells was further confirmed by the analysis of the expression of GM-CSF, IFN&#945;, and IL-17 at both mRNA and protein levels. Thus, this method can be used to differentiate naive CD4+ T cells to THGM cells in vitro, which will be useful in the study of THGM cell biology.

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

Here, we present a protocol to differentiate murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) cells from naive CD4+ T cells, including isolation of naive CD4+ T cells, differentiation of THGM, and analysis of differentiated THGM cells. This method can be applied to studies of the regulation and function of THGM cells.

In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

<meta charset="utf8"></head><body>Th17-Zelldifferenzierung aus naiven CD4+ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erreichen einer hochreinen In-vitro-Differenzierung von Th17-Zellen durch Modulation der Zytokinkonzentration

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

In vitro Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

In vitro Differenzierung von humanen CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 ⁺ T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Zusammenfassung

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