Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio de Reynolds en Rosalind Franklin de la Universidad de Medicina y Ciencia, y el laboratorio de Chen Dong de la Universidad del Centro Oncológico MD Anderson de Texas para la optimización de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por una beca para JMR de los Institutos Nacionales de la Salud (K22AI104941).

Todos los procedimientos experimentales se realizaron utilizando los protocolos aprobados por la Oficina de Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad Rosalind Franklin de Medicina y Ciencia. C57BL / 6 ratones (adquirida de NCI) que se utiliza para este protocolo fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos, y todos los experimentos con animales se realizaron usando protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en la Universidad Rosalind Franklin de Medicina y Ciencia. 1. Preparación del instrumental, insumos y reactivos <ol><li> Coat de 48 pocillos o placas de 24 pocillos con anti-CD3 y anti-CD28 (Tabla 1) en PBS estéril, cubierta y envolver en parafina para prevenir la evaporación y la contaminación, y luego se incuban O / N a 4 ° C el día antes T aislamiento de células. Alternativamente, los pozos de la capa 1 h a 37 ° C. Realice condiciones Th0, Th1, Th2, y iTreg mediante el recubrimiento de tanto anti-CD3 y anti-CD28 de 1 g / ml en 0,5-1 ml devolumen tal (placa de 48 pocillos). Para Th17, típicamente la capa anti-CD3 a 2 g / ml y anti-CD28 a 1 mg / ml. NOTA: Hemos encontrado que una concentración más baja anti-CD3 es óptima para la generación de Th1, Th2, y iTreg mientras que una concentración de anti-CD3 más alta es óptima para la generación de Th17. Por lo tanto, las concentraciones de anti-CD28 y anti-CD3 se deben titular y optimizados para los laboratorios individuales (tabla 2). </li><li> Esterilizar un conjunto de herramientas de disección (tijeras y fórceps) por solución autoclave o desinfectante. Se necesitarán un tubo o vaso de precipitados pequeño que contiene 70% de etanol para la esterilización rápida de herramientas entre las disecciones. Finalmente, se necesitará una botella de spray que contiene 70% de etanol para la esterilización de la superficie del ratón antes de la disección. </li><li> Preparar una superficie disección envolviendo una pieza plana de espuma de poliestireno o corcho en papel de aluminio. Alfileres o agujas de disección se utilizan para fijar el animal en su lugar. </li><li> Preparar platos o placas para la recogida de tiT EMAS. Si los tejidos de fondo común, de 60 mm platos separados que contienen 3 ml de PBS estéril + 1% FBS (PBS +) para los tejidos del bazo y de los ganglios linfáticos es suficiente. Si de mantenimiento de los tejidos de ratones individuales se separan, preparar un 1 ml placa de 24 pocillos que contiene de PBS + en el número deseado de pozos. </li><li> Preparar medio RPMI completo para el cultivo celular y pre-calentamiento antes de su uso (Tabla 1). NOTA: rutinariamente Utilizamos RPMI pero otros medios como IMDM y DMEM puede ser igualmente efectivo o superior dependiendo del laboratorio y el experimento. </li><li> Cut 2x2 cm cuadrados de malla de nylon con un tamaño de poro de 120 micras y autoclave para esterilizar (Tabla 1). </li><li> Opcional: si se utiliza la célula magnética de alta velocidad del sistema de clasificación como autoMACS para el enriquecimiento de células CD4 +, en ejecución de pre-calentamiento y enjuague buffers en un baño de agua a 37 ° para evitar daños a la máquina. </li><li> NOTA: Se recomienda Enriquecimiento para aumentar el rendimiento de clasificación y reducir el tiempo de clasificación. </li><li> Todospasos de preparación, excepto para la disección, deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril. </li></ol> 2. Aislamiento de los ganglios linfáticos y el bazo de los ratones <ol><li> La eutanasia el número requerido de animales utilizando una técnica aprobado institucionalmente. Utilice C57BL / 6 ratones hembra, edad 5-10 semanas, debido a su alto porcentaje de células T vírgenes y menor grasa corporal en comparación con los hombres o con los ratones de más edad. NOTA: Las células derivadas de ratones machos llevará a cabo de manera similar in vitro y los pasos del protocolo siendo el mismo. Los ratones hembra, 5-10 semanas de edad, normalmente producirán 6.3 x 10 6 ingenuos células T CD4 + por ratón. Sin embargo, utilizando diferentes cepas de ratones pueden afectar el rendimiento y el rendimiento. Por ejemplo, las células de ratones C57BL / 6 son mejores para la generación de células Th1, mientras que las células de ratones Balb.c son mejores para la generación de células Th2. </li><li> Difundir las extremidades del animal y el pin en su lugar como se muestra en la Figura 1. Cortar la piel a largoitudinally desde el ano hasta la barbilla con cuidado de no perforar el tejido más profundo. </li><li> Spread abrir la piel con pinzas y el pin de la piel en el lugar para permitir el fácil acceso a los ganglios linfáticos, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Cosecha de los ganglios linfáticos accesibles desde los lugares mostrados en la Figura 1. Agarrando el ganglio linfático con un par de fórceps mientras se separa el tejido con otro par de pinzas permita la eliminación fácil. Coloque el tejido en el plato de colección. </li><li> Cosechar el bazo de la ubicación que se muestra en la Figura 1. En este caso, se necesita cuidado de corte en el peritoneo para obtener acceso al bazo. Coloque el tejido en un plato de colección. </li><li> Repita el procedimiento si se cosecharán más tejidos. De lo contrario, continúe con los pasos siguientes. En este punto, realizar todos los pasos restantes en hielo hasta el forro de las células T después de la clasificación. </li></ol> 3. Procesamiento de tejidos y células CD4 + Enriquecimiento<ol><li> Procesar los ganglios linfáticos y el bazo en diferentes platos para aumentar el rendimiento como preparaciones de células de ganglios linfáticos no requieren lisis de los eritrocitos, lo que puede resultar en la muerte de leucocitos menor. Por lo tanto, los pasos siguientes describen un método para procesar las poblaciones de bazo y de ganglios linfáticos, seguida por separado mediante la combinación de antes del marcaje para la clasificación. </li><li> Retire el tejido (bazo o ganglios linfáticos agrupados) desde el plato de recogida y colocar en una nueva placa de 60 mm que contiene 3 ml de PBS +. Coloque una escuadra de nylon estéril malla sobre el tejido usando pinzas esterilizadas. </li><li> Tome el lado del pulgar de un émbolo de la jeringa (3-10 ml) y aplastar suavemente el tejido contra la malla. Casi todo el tejido debe entrar en suspensión. Como alternativa, coloque el tejido entre dos diapositivas esmerilado autoclave y molido en suspensión. </li><li> Pipetear la suspensión arriba y abajo varias veces para disolver los grumos solubles restantes. Coloque un nuevo pedazo cuadrado de malla de nylon sobre la apertura de un15 ml tubo cónico y filtrar la suspensión a través de eliminar los escombros restantes. </li><li> Repita los pasos 2-4 para los ganglios linfáticos adicionales y tejido esplénico. </li><li> Una vez que la suspensión se ha filtrado en un tubo de 15 ml llenar el resto del tubo con PBS + e invertir varias veces. Centrifugar las células a 475 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Para las células esplénicas, aspirar el sobrenadante después de la centrifugación y resuspender el sedimento celular en 1 ml de solución de ACK 1X enfriado con hielo por bazo durante 1 min para lisar los eritrocitos. A continuación, añadir 10 ml de PBS + en la parte superior de la ACK, invierta el tubo y centrifugar 475 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Para las células de los ganglios linfáticos, aspirar el sobrenadante y resuspender en 2 ml de PBS +. Si se desea, estos se pueden combinar con las células esplénicas después de su lisis ACK y etapa de lavado. </li><li> Aspirar el sobrenadante después de la centrifugación de los esplenocitos y resuspender en otros 10 ml de PBS +. En este punto, la suspensión de los ganglios linfáticos puede ser unadded en la parte superior de la suspensión bazo si se requiere la puesta en común de tejido para la clasificación. Centrifugar el tubo de nuevo a 475 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> El sedimento de células se puede ahora preparados para el enriquecimiento de CD4. Si no se realiza este paso, continúe con los pasos de preparación de clasificación. </li><li> Para el enriquecimiento de CD4 utilizando el sistema de clasificación celular magnética de alta velocidad, resuspender el sedimento celular con perlas de CD4. Típicamente 15 l de perlas diluidas en 85 l de PBS + se utiliza para etiquetar los tejidos a partir del 1 de ratón. Eleva el volumen de la mezcla de grano, según sea necesario, volver a suspender el sedimento, y se incuba durante 15-30 minutos a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con 10 ml de PBS +, pasar la suspensión a través de nylon en un nuevo tubo de 15 ml para eliminar los desechos, y se centrifuga de nuevo a 475 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado en 100 l de PBS + por ratón y proceder a la selección positiva en el sistema de clasificación celular magnética de alta velocidad. Si se utiliza un sistema de separación manual, figa las instrucciones del fabricante para el enriquecimiento. Alternativamente, resuspender las muestras en tampón FACS: PBS con 1 mM EDTA (pH = 8) y 1% de BSA, esterilizada por filtración. </li><li> Retire la fracción positiva y lavar de nuevo con 10 ml de PBS +. La fracción de células CD4 + enriquecido ya está listo para ser etiquetado para la clasificación. </li></ol> 4. Las células T CD4 + Clasificación Naïve <ol><li> Etiquetar el sedimento celular con PBS + anticuerpos fluorescentes contienen dirigidos contra CD62L, CD44, CD25 y CD4. Si el uso de los anticuerpos listados en la Tabla 1, se proporcionan diluciones para cada uno. Para la tinción, un volumen de 100 l de la mezcla de anticuerpos se utiliza por los tejidos de un ratón. </li><li> Resuspender el precipitado en cóctel de anticuerpos y se incuba durante 15-30 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con 10 ml de PBS y centrifugar + 475 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Pase la mezcla sobre otro filtro de nylon o filtro celular tapa para volvermover cualquier residuo sobrante. Pipetear las células marcadas en un tubo que es compatible para el clasificador de células. Mantener las células en hielo y protegido de la luz hasta el estilo. </li><li> Preparar tubos de recogida de pipeteando 1-2 ml de medio RPMI completo o FBS en el fondo de los tubos compatibles para la recolección sobre un clasificador de células. </li><li> Ordenar las células T CD4 + vírgenes como CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - población (Figura 2). Se lavan las células recogidas con medio RPMI completo y se centrifuga como se describe anteriormente. </li><li> Resuspender el precipitado en RPMI completo, contar las células de los animales, y ajustar la concentración de 1 x 10 6 células / ml. </li></ol> 5. Configuración de la diferenciación in vitro <ol><li> Aspirar los pocillos de las placas recubiertas de anti-CD3 y anti-CD28 y lavar cada pocillo con 1 ml de PBS estéril (sin FBS). Para placas de 48 pocillos, placa 0,5 x 10 6 células / pocillo en 0,5 ml de RPMI. Para placas de 24 pocillos, cultura 1 x 10 6 células / pocillo en 1,0 ml de RPMI. </li><li> Si probar la influencia de un factor tal como un fármaco añadir la sustancia a los pocillos apropiados, ya sea antes, durante o después del proceso de diferenciación dependiendo del experimento. A continuación, complementar los medios de cultivo con citoquinas y anticuerpos bloqueantes en consecuencia. Th0: 30 U / ml de hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml de hIL-2, y 5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml de hIL-2, 2000 ng / ml soluble 37,51, y 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml de hIL-2, 5,000 ng XMG1.2 / ml, y 5,000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng XMG1.2 / ml, y 5,000 ng / ml 11B11. NOTA: Las condiciones presentadas anteriormente resultaron ser óptima para maximizar la producción de citoquinas como se mide al final del experimento diferenciación (sección de resultados representativos). Sin embargo, cada condición debe ser optimizado para los laboratorios individuales (Tabla 2 </strong&gt;). Además, la adición de anti-CD28 soluble además de la anti-CD28 unido a la placa se ha encontrado para mejorar la producción de citocinas Th2 en nuestro laboratorio, pero no tiene ningún efecto en otros subconjuntos de células T: </li><li> Incubar la placa a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 4-5 d antes del análisis de la expresión génica y la producción de citoquinas. Alternativamente, retirar las células de los estímulos de TCR después de 2 d, se ajustó a 1 x 10 6 células / ml con medio fresco, y la placa en nuevos pozos (no recubierto) para aumentar la proliferación y el rendimiento final. En este caso, no son necesarias las citoquinas polarización frescas y anticuerpos pero deben añadirse 10 U / ml de IL-2 a los nuevos medios de Th0, Th1, Th2 y culturas iTreg. </li></ol> 6. Análisis de Diferenciación <ol><li> Para el análisis de citoquinas por citometría de flujo, reestimular cada pocillo con 10 ng / ml de PMA y 1,000 ng / ml ionomicina o Tabla / ml anti-CD3 durante 4-6 horas en presencia de un inhibidor de golgi como brefeldin A (1 g1). Realizar tinción intracelular de citoquinas dependiendo del experimento (Figura 3). NOTA: Mancha no específicos de linaje citoquinas o factores de transcripción, tales como IL-4 (no mostrado) y IFN (Figura 3) de los cultivos Th17, para cada condición como controles negativos y como indicador de la eficiencia de diferenciación. Además, Foxp3 mancha para cultivos Th17 como el desarrollo recíproco de Tregs puede ocurrir con la adición de TGF. </li><li> Para la cuantificación de proteína, recoger los sobrenadantes de cada pocillo de ensayo y por citoquina ELISA específico (Figura 3). Si existe la preocupación de que el factor está probando ha influido en la proliferación en comparación con las muestras de control, las células se pueden lavar, se contaron, normalizada, y luego volvieron a estimular con 1 g / ml de anti-CD3 para 24 h antes de recoger los sobrenadantes para los ensayos de ELISA. Si el ensayo de IL-4 de Th2 es necesario condiciones, lavado y volviendo a estimular para eliminar IL-4 que puede ser leftover del cultivo inicial diferenciación. </li><li> Para el análisis de la expresión génica mediante PCR en tiempo real, las células de la cosecha después de que el período de incubación, se lavan, se normalizan, y re-estimulan durante 2-6 horas con 1 g / ml de anti-CD3 antes de la recolección de ARNm (Figura 3). </li></ol>

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J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Mientras que el bazo contiene células Th ingenuo, la proporción de esta población en los ganglios linfáticos es mucho mayor. No identificar correctamente y extirpar los ganglios linfáticos en este protocolo se traducirá en un pobre rendimiento de células ingenuas. Esto puede ser especialmente difícil en ratones más viejos o los ratones machos que tienen más tejido adiposo. Como se muestra en la Figura 1, la fijación adecuada y la fijación de las extremidades y la piel de animales permitirá más fácil la visualización de los ganglios linfáticos exteriores accesibles. Una vez que se procesan ganglios linfáticos y el bazo, la clasificación de células es el método preferido de obtención de una población naïve altamente purificada de células T CD4 +. La pureza es fundamental para prevenir nTregs o efectoras y de memoria Th células de influir en el proceso de diferenciación de las células naïve. Las dificultades para obtener un alto rendimiento de células T vírgenes son causadas por la recogida de tejidos ineficiente y el procesamiento o la pérdida de células durante las etapas de separación. Para aumentar el rendimiento de maquillaje sUre para procesar las células usando tampones fríos y las incubaciones en hielo. Además, para evitar la pérdida de células durante el enriquecimiento y / o clasificación, la optimización de los reactivos y protocolos de separación de antemano se recomienda. Por último, como se ha mencionado en varios puntos de los pasos del protocolo, condiciones de diferenciación deben ser optimizados para los laboratorios individuales antes de realizar experimentos a gran escala (Tabla 2). Como se muestra en la Figura 2, las células T CD4 + vírgenes se pueden fácilmente ser distinguidos de la nTreg (CD4 + CD25 +) y el efector (CD4 + CD44 + CD62L -) poblaciones. La clasificación es una de las formas más fiables para prevenir la contaminación de efector Th subconjuntos, que también existen en el bazo y los ganglios. Contaminación Treg durante la diferenciación puede resultar en la supresión de la activación, así como la producción de citoquinas. La contaminación de otro efector Th subconjuntos pueden resultar enla producción de citoquinas que son inhibitorios para el desarrollo de los linajes Th deseados. Clasificación instalación de las tasas pueden ser costosos y algunos consideran que es más fácil para enriquecer en células T CD4 + por separación magnética para reducir el tiempo de clasificación, como se describe en este protocolo. En ausencia de un clasificador, algunas empresas ofrecen ahora kits de separación diseñados específicamente para el aislamiento de células T CD4 + vírgenes. Sin embargo, la pureza de la población siempre se debe revisar después de la separación, similar a las muestras clasificadas. El hallazgo de una baja frecuencia de ingenuo células T CD4 + (CD62L +) en comparación con las células de memoria / efectoras (CD44 -) puede indicar un problema con el ratón, como una infección o un tumor. En este caso las células no deben ser utilizados para este tipo de experimento. Hay bastantes maneras de determinar la eficacia de Th diferenciación. El análisis de proteínas se realiza tradicionalmente mediante tinción de citoquinasing, que dará una idea del porcentaje de células de los animales que se han polarizado a un linaje específico (Figura 3). Proteína cuantificación por ELISA es también una herramienta útil para determinar la cantidad total de citocinas que se liberan en los medios de comunicación. La advertencia con el análisis de proteínas ELISA es sin embargo que comparar los resultados entre los grupos experimentales pueden ser difíciles si un factor particular que está siendo probado tiene una influencia en la proliferación y la supervivencia. En este caso, el número total de células productoras de citoquinas pueden ser diferentes entre los grupos al final del experimento. Por lo tanto, la normalización de el recuento de células y volviendo a estimular durante un corto período de tiempo (por ejemplo, anti-CD3 durante 24 h) es necesario para obtener resultados adecuados. Además, la IL-4 se utiliza como un factor de polarización para la generación del subconjunto Th2, por lo que estas células debe ser lavado, normalizada, y volvieron a estimular antes de realizar un ELISA para IL-4. Análisis de expresión génica mediante PCR en tiempo real es útil no sólo fo el análisis de la transcripción de genes de citoquinas, sino también para factores de transcripción específicos de linaje (Figura 3). Por lo tanto, dependiendo del experimento, hay varias maneras para ensayar la eficacia de Th diferenciación.

El concepto de linajes o subconjuntos de CD4 + T helper distintas células (Th) ha estado presente desde la última parte del siglo 20 1. El reconocimiento de antígeno afín en presencia de señales coestimuladoras resultados en varias rondas de proliferación celular y la eventual diferenciación en células Th efectoras. El tipo de célula Th generado durante este proceso es dependiente del entorno de citoquinas presentes durante la activación 2. Inicialmente, se creía que las células Th ingenuas para polarizar en 2 linajes distintos siguientes receptor de células T (TCR) de activación, la ligadura de CD28 coestimuladora, y la señalización de citoquinas. Tipo 1 de células helper (Th1) se caracterizan por su producción efector de la citocina IFN así como su requisito para la señalización de IL-12 durante el proceso de diferenciación 3,4. Finalmente se descubrió que las células Th1 diferenciadas tienen un perfil genético que se caracteriza más claramente by la expresión del factor de transcripción de la familia caja T, TBX21 (T-bet), que se considera el regulador maestro del programa genético Th1 5. Además, IL-12, así como IFN puede promover la expresión de T-bet 6,7. En la respuesta inmune, las células Th1 son importantes para la defensa del huésped contra patógenos intracelulares, así como promotores fuertes de la inflamación autoinmune. En contraste, las células helper de tipo 2 (Th2) requieren IL-4 para su desarrollo y sus citocinas efectoras, incluyendo IL-4, IL-5 e IL-13, son importantes para la conducción de las respuestas de células B y son patógenos en la alergia 8, 9. De manera similar a las células Th1, se encontró que las células Th2 para expresar su propio regulador transcripcional principal, denominado GATA-3 10,11. Curiosamente, la presencia de citocinas polarizantes y la generación de un linaje Th específicas son antagónicos al desarrollo de otros 2,12, lo que sugiere que sólo un subconjunto Th particular puede llegar a ser dominante durante una re inmunerespuesta. Desde la identificación de los linajes Th1 y Th2, un trabajo adicional ha demostrado aún más único subconjuntos de células T auxiliares, incluyendo folicular helper (TFH), IL-9-producción (Th9), e IL-22 de producción de (Th22) (recientemente revisado en 13). Para los propósitos de los experimentos in vitro de diferenciación, este protocolo se centrará solamente en dos subconjuntos de Th adicionales, denominados células T reguladoras (Treg) y células T CD4 + de IL-17 de producción de (Th17). Las células T reguladoras CD25 + pueden ocurrir naturalmente (nTreg) en el timo; células Th naïve también pueden ser inducidas (iTreg) para convertirse en regulador en la periferia (revisado en 14,15). Ambos tipos de células T reguladoras expresan un factor de transcripción característico, denominado caja forkhead P3 (Foxp3), que es crítica para sus mecanismos de supresión efectoras que incluyen la producción soluble anti-inflamatoria mediador, IL-2 el consumo, y la célula de mecanismos dependientes del contacto 14,15. La falta de FOXP3 resultados de la expresión de un trastorno autoinmune multiorgánico grave denominan desregulación inmune, poliendocrinopatía, enteropatía, síndrome ligado al cromosoma X (IPEX), lo que demuestra el papel fundamental de este subconjunto Th en la resolución de la inflamación y la regulación de la tolerancia periférica a la libre antígenos 16. In vitro, las células T auxiliares CD4 + vírgenes hasta de regular Foxp3 y se convierten comprometido con el programa Treg a la estimulación con IL-2 y TGF-β 14,15. Puede haber moderado a considerable plasticidad en linajes de células T CD4 +, especialmente cuando se considera solamente la producción de citoquinas (revisado en 17,18). Sin embargo, a los efectos de protocolos de diferenciación in vitro, vamos a discutir cada subconjunto como un linaje único. Recientemente, un subconjunto de células Th17 que produce la citoquina IL-17 se identificó como un linaje único con funciones de pro-inflamatorias que son particularmente patógena durante la inflamación autoinmune 19-21. Células Th17 expresan un factor de transcripción único, denominado relacionados retinoide-receptor gamma huérfano t (RORγt) que coordina el programa genético Th17 22. TGF es importante para la generación de Th17 linaje a través de la inducción de RORγt. Sin embargo, se cree que el efecto de la señalización de TGF sólo para inducir el compromiso Th17 en sinergia con IL-6 (revisado en 12). Otros estudios han demostrado que una variedad de otras señales que pueden regular positivamente el compromiso Th17, incluyendo IL-1β, el aumento de sodio, y TLR de señalización 23-26. Otros informes han sugerido que las células Th17 patógenos in vivo son los que realmente omiten la señalización de TGF y en su lugar se basan en una combinación de IL-1, IL-6 e IL-23 para su diferenciación 27. Así, las células Th17 se pueden derivar de una variedad de vías de señalización; para los fines de este protocolo, que se utiliza comúnmente el (TGF e IL-6) y la vía de Th17 linaje compromisoserá presentado. Los protocolos de diferenciación se describen a continuación para todos los linajes efectoras se basa en anticuerpo fija como estímulos para la TCR y CD28 a lo largo de todo el curso del experimento. Sin embargo, otros han demostrado que la activación del TCR con células presentadoras de antígeno 28 o entrecruzamiento de anticuerpos anti-CD28 con el anticuerpo de hámster anti-CD3 y durante 2 días 29 también son medio muy eficaz para inducir la generación de diversos subgrupos Th. El protocolo que aquí se presenta se basa en métodos reportados previamente para el aislamiento de células T CD4 + murinas de los órganos linfoides secundarios 30 y la generación de células Th17 31. Una diferencia importante es que este protocolo se basa en el uso de un clasificador de células para aislar células T CD4 + vírgenes de los tejidos linfoides. Sin embargo, muchas compañías ahora ofrecen kits de separación rápidos que pueden enriquecer las células T naïve CD4 +, que puede ser capaz de pasar por alto el requisito fo clasificación dependiendo del experimento. Los métodos y reactivos que se presentan en este protocolo son lo que habitualmente utilizamos y encontramos a ser el más eficaz. Sin embargo, tenga en cuenta que existen reactivos y metodologías alternativas para muchos de los pasos que se presentan a continuación y le corresponde al laboratorio individual para determinar lo que funciona mejor para sus propósitos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete RPMI:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 micron nylon mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0120-10YD</td>
			<td>Cut into 2 cm2 squares and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative: 100 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td>Alternative to cutting nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS rinsing solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 beads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human (h) IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-12</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>210-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTGFb</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C11 (anti-CD3)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37.51 (anti-CD28)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11B11 (anti-IL-4)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD62L-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104406</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102008</td>
			<td>Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-PerCP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100434</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103012</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol&#160; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8139</td>
			<td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-0634</td>
			<td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4506-51</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

El punto de tiempo para el análisis de la diferenciación puede variar dependiendo de la condición Th está probando así como la fuerza de la activación del receptor de células T. Después de 2-3 días de diferenciación, las células pueden ser visualizadas por microscopía de luz para determinar el grado de proliferación de células T. Wells expositoras extensa proliferación y de agrupación de células más probable es estar listo para el análisis en el día 4. Condiciones de diferenciación que dependen de la adición de IL-2 exógena, como Th1 y Th2, es probable que agotar los medios de comunicación después de 4 días de cultivo. Para maximizar la producción de citoquinas, tales pozos con medios agotada puede ser repuesta con RPMI fresco que contenía IL-2 o contaron y se re-sembraron a 1 x 10 6 células por pocillo en RPMI fresco que contenía IL-2 para extender la diferenciación para otro día o dos usando este método. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig1.jpg" /> Figure 1. Ilustración de la colocación de los clavos para fijar un ratón para el aislamiento de bazo y los ganglios linfáticos. (A) Difundir las extremidades aparte y fijarlos con una aguja estéril o pin disección. Desde esta posición, cortar la piel y la piel longitudinalmente desde la cola a la barbilla. (B) Después de cortar, suavemente difundir la piel aparte para exponer los ganglios linfáticos, como se muestra en la imagen. Las ubicaciones de los ganglios linfáticos que son fácilmente accesibles desde esta posición se enumeran en el cuadro. El bazo se encuentra justo debajo de la caja torácica en el lado derecho del animal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig2.jpg" /> Figura 2. Representante estrategia de clasificación para el aislamiento de CD4 + naïve </sup&gt; Células T por clasificación de células. A partir de la parte superior izquierda, los linfocitos se gated primero por tamaño y luego las células son discriminadas singlete a partir de células doblete. Gating en singletes revela una población de células que son nTregs CD4 + CD25 +. Puerta en el CD4 + CD25 - población y luego ordenar ingenuo (CD62L + CD44 -) desde el efector / memoria (CD62L - CD44 +) las células CD4 +. Las líneas de puntos indican el origen puerta de la siguiente trama. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig3.jpg" /> Figura 3. Datos de la muestra in vitro siguiente Th diferenciación. (A) Intracdatos de tinción de citoquinas ellular (cerradas en CD4 +) de Th1, Th2, iTreg, y diferenciaciones Th17. Típicamente, las citoquinas específicas no linaje, tales como IL-4 y IFN para cultivos Th17, deben teñirse para determinar la calidad de la diferenciación. De datos (B) de ELISA siguiente 4 d Th diferenciación, lavado, y 24 h reestimulación de células con anti-CD3. (C) en tiempo real los datos de PCR 1 mg / ml de factores de transcripción específicos de linaje siguientes 4 d diferenciación y la reestimulación durante 4 h con 1 mg / ml anti-CD3. Todas las cantidades de genes se normalizaron a la expresión de β-actina y ARNm de las células T vírgenes indiferenciadas sirven como línea de base para la expresión génica. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Tabla 1. Ver Tabla de Materiales a continuación. <table border=&quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Rango recomendado Titulación </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Las citoquinas: </td><td></td></tr><tr><td> Human (h) IL-2 </td><td> 5 U / ml - 50 U / ml </td></tr><tr><td> rmIL-4 </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> rmIL-6 </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> rmIL-12 </td><td> 10 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> hTGFb (Th17) </td><td> 0,1 ng / ml - 5 ng / ml </td></tr><tr><td> hTGFb (iTreg) </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos: </td><td></td></tr><tr><td> 2C11 (anti-CD3) </td><td> 500 ng / ml - 5000 ng / ml </td></tr><tr><td> 37,51 (anti-CD28) </td><td> 250 ng / ml - 2500 ng / ml </td></tr><tr><td> 11B11 (anti-IL-4) </td><td> 5000 - 10.000 ng / ml </td></tr><tr><td> XMG1.2 (anti-IFNg) </td><td> 5000 - 10.000 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Recomendaciones Range Titulación para la Optimización de la diferenciación Condiciones.

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.7K vistas.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

Video: Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle toxicity testing in immortalized cell lines or primary cells have shown discrepancies, highlighting the need to extend the use of primary cells for in vitro assays. This protocol describes the isolation of mouse liver macrophages, named Kupffer cells, and their use to study nanoparticle toxicity. Kupffer cells are the most abundant macrophage population in the body and constitute part of the reticulo-endothelial system (RES), responsible for the capture of circulating nanoparticles. The Kupffer cell isolation method reported here is based on a 2-step perfusion method followed by purification on density gradient. The method, based on collagenase digestion and density centrifugation, is adapted from the original protocol developed by Smedsr&#248;d et al. designed for rat liver cell isolation and provides high yield (up to 14 x 106 cells per mouse) and high purity (&#62;95%) of Kupffer cells. This isolation method does not require sophisticated or expensive equipment and therefore represents an ideal compromise between complexity and cell yield. The use of heavier mice (35-45 g) improves the yield of the isolation method but also facilitates remarkably the procedure of portal vein cannulation. The toxicity of functionalized carbon nanotubes f-CNTs was measured in this model by the modified LDH assay. This method assesses cell viability by measuring the lack of structural integrity of Kupffer cell membrane after incubation with f-CNTs. Toxicity induced by f-CNTs can be measured consistently using this assay, highlighting that isolated Kupffer cells are useful for nanoparticle toxicity testing. The overall understanding of nanotoxicology could benefit from such models, making the nanoparticle selection for clinical translation more efficient.

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen