Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Reynolds a Rosalind Franklin University of Medicine and Science, e il laboratorio di Chen Dong presso l&#39;Università del Texas MD Anderson Cancer Center per l&#39;ottimizzazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per JMR dal National Institutes of Health (K22AI104941).

Tutte le procedure sperimentali sono eseguite utilizzando protocolli approvati dall&#39;ufficio di salute ambientale e sicurezza presso l&#39;Rosalind Franklin University of Medicine and Science. C57BL / 6 topi (acquistato da NCI) utilizzato per questo protocollo è stato ospitato in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti utilizzando i protocolli approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l&#39;Rosalind Franklin University of Medicine and Science. 1. Preparazione di strumenti, accessori e reagenti <ol><li> Coat 48 pozzetti o 24 pozzetti piastre con anti-CD3 e anti-CD28 (Tabella 1) in PBS sterile, coperchio e avvolgere in parafilm per evitare l&#39;evaporazione e la contaminazione, e poi incubare O / N a 4 ° C il giorno prima T isolamento delle cellule. In alternativa, i pozzetti cappotto 1 ora a 37 ° C. Eseguire condizioni Th0, Th1, Th2, e iTreg rivestendo sia anti-CD3 e anti-CD28 a 1 ug / ml in 0,5-1 ml diVolume tal (piastra 48 pozzetti). Per Th17, di solito cappotto anti-CD3 a 2 mg / ml e anti-CD28 a 1 mg / ml. NOTA: Abbiamo scoperto che una concentrazione di anti-CD3 inferiore è ottimale per la generazione Th1, Th2, e iTreg mentre una maggiore concentrazione anti-CD3 è ottimale per la generazione Th17. Così, anti-CD3 e anti-CD28 concentrazioni dovrebbero essere titolati e ottimizzati per i singoli laboratori (Tabella 2). </li><li> Sterilizzare un insieme di strumenti di dissezione (forbici e pinze) per la soluzione in autoclave o disinfettante. Saranno necessari un tubo o un piccolo bicchiere contenente etanolo al 70% per una rapida sterilizzazione di strumenti tra dissezioni. Infine, sarà necessaria una bottiglia spray contenente 70% di etanolo per sterilizzare la superficie del mouse prima dissezione. </li><li> Preparare una superficie di dissezione avvolgendo un pezzo di polistirolo o sughero in fogli di alluminio. Perni dissezione o aghi vengono utilizzati per fissare l&#39;animale in luogo. </li><li> Preparare piatti o piastre per la raccolta di tiUESTIONI. Se i tessuti pooling, separati 60 millimetri piatti contenenti 3 ml di PBS sterile + 1% FBS (PBS +) per milza e linfonodi tessuti è sufficiente. Se mantenendo tessuti da singoli topi separati, preparare un 1ml 24-pozzetti contenenti di PBS + il numero desiderato di pozzetti. </li><li> Preparare i media RPMI completo per colture cellulari e pre-caldo prima dell&#39;uso (Tabella 1). NOTA: Noi abitualmente utilizziamo RPMI ma altri media come IMDM e DMEM può essere altrettanto efficace o superiore a seconda del laboratorio e l&#39;esperimento. </li><li> Cut 2x2 cm quadrati di nylon ingranano con una dimensione dei pori e autoclave a 120 micron per sterilizzare (Tabella 1). </li><li> Opzionale: se si utilizza il cellulare magnetico ad alta velocità del sistema di smistamento come autoMACS per l&#39;arricchimento di cellule CD4 +, corsa pre-caldo e risciacquo buffer in un bagno d&#39;acqua C 37 o per evitare danni alla macchina. </li><li> NOTA: arricchimento si consiglia di aumentare il rendimento di smistamento e ridurre i tempi di ordinamento. </li><li> Tuttopassaggi di preparazione, fatta eccezione per la dissezione, devono essere eseguite in una cappa coltura tissutale sterili. </li></ol> 2. Isolamento dei linfonodi e della milza di topi <ol><li> Euthanize il numero di animali utilizzando una tecnica istituzionalmente approvato. Utilizzare C57BL / 6 topi di sesso femminile, di età 5-10 settimane, a causa della loro alta percentuale di cellule T naive e grasso corporeo inferiore rispetto ai maschi o ai topi anziani. NOTA: Le cellule derivate da topi maschi si esibiranno in modo simile in vitro e le fasi del protocollo rimangono gli stessi. Topi femmina, 5-10 settimane vecchie, in genere produrrà 3-6 x 10 6 naïve cellule CD4 + T per mouse. Tuttavia, utilizzando diversi ceppi di topi possono influenzare il rendimento e le prestazioni. Per esempio, cellule di topi C57BL / 6 sono migliori per la generazione di cellule Th1 mentre le cellule da topi Balb.c sono migliori per generare cellule Th2. </li><li> Distribuire gli arti dell&#39;animale e perno in posizione, come mostrato in Figura 1. Tagliare la pelle lungoitudinally dall&#39;ano al mento facendo attenzione a non forare tessuti più profondi. </li><li> Diffusione aprire la pelle con una pinza e pin la pelle in atto per permettere un facile accesso ai linfonodi come mostrato in Figura 1. </li><li> Raccogliere linfonodi accessibili dalle posizioni indicate nella figura 1. Afferrando linfonodo con un paio di pinze, mentre la separazione dei tessuti con un altro paio di pinze permette una facile rimozione. Posizionare il tessuto nel piatto di raccolta. </li><li> Raccolto milza dalla posizione mostrata in figura 1. In questo caso, il taglio attenzione nel peritoneo è necessario per ottenere l&#39;accesso alla milza. Posizionare il tessuto in un piatto di raccolta. </li><li> Ripetere la procedura se saranno raccolte più tessuti. Altrimenti procedere con i passi successivi. A questo punto, eseguire tutte passaggi rimanenti in ghiaccio fino fasciame delle cellule T dopo la cernita. </li></ol> 3. Tissue Processing e CD4 + arricchimento<ol><li> Trattare i linfonodi e la milza in piatti diversi per aumentare la resa di preparazioni di cellule linfonodali non richiedono eritrociti lisi, che possono provocare la morte dei leucociti minore. Pertanto, le seguenti operazioni descrivono un metodo per il trattamento della milza e dei linfonodi popolazioni seguiti separatamente unendo prima di etichettatura per l&#39;ordinamento. </li><li> Rimuovere il tessuto (milza o linfonodi aggregati) dal piatto di raccolta e posto in un nuovo piatto 60 millimetri contenente 3 ml di PBS +. Inserire un quadrato di nylon sterile maglia sopra il tessuto con pinze sterilizzate. </li><li> Prendete il lato del pollice di un stantuffo della siringa (3-10 ml) e distruggere il tessuto delicatamente contro la rete. Quasi tutto il tessuto dovrebbe andare in sospensione. In alternativa, posizionare il tessuto tra due vetrini smerigliati autoclavato e rettificato in sospensione. </li><li> Pipettare la sospensione su e giù per un paio di volte per rompere i grumi solubili rimanenti. Inserire un nuovo pezzo quadrato di maglia di nylon sopra l&#39;apertura di unTubo da 15 ml e filtrare la sospensione attraverso per rimuovere i detriti rimanenti. </li><li> Ripetere i passaggi 2-4 per linfonodi supplementare e tessuto splenico. </li><li> Una volta che la sospensione è stata filtrata in un tubo 15ml riempire il resto del tubo con PBS + e invertire alcune volte. Centrifugare le cellule a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Per le cellule spleniche, aspirare il surnatante dopo centrifugazione e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di soluzione ghiacciata 1X ACK per milza per 1 min per lisare gli eritrociti. Aggiungere quindi 10 ml di PBS + sulla parte superiore del ACK, invertire il tubo, e centrifugare 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Per le cellule linfonodali, aspirare il surnatante e risospendere in 2 ml di PBS +. Se lo si desidera questi possono essere combinati con le cellule della milza dopo la loro lisi ACK e lavaggio. </li><li> Aspirare il surnatante dopo centrifugazione dei splenociti e risospendere in altri 10 ml di PBS +. A questo punto la sospensione linfonodo può esseredded sulla parte superiore della sospensione milza se è richiesto il pool di tessuto per l&#39;ordinamento. Centrifugare il tubo di nuovo a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Il pellet cellulare può essere preparato per CD4 arricchimento. Se non viene eseguita questa operazione, passare alle fasi di preparazione di smistamento. </li><li> Per CD4 arricchimento utilizzando il sistema cell sorting magnetico ad alta velocità, risospendere il pellet cellulare CD4 con perline. Tipicamente 15 ml di perline diluito in 85 ml di PBS + è usato per etichettare i tessuti dal 1 mouse. Rampa il volume della miscela sferette, se necessario, risospendere il pellet, e incubare per 15-30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS +, passare la sospensione attraverso nylon in un nuovo tubo 15 ml per rimuovere i detriti e centrifugare di nuovo a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere il precipitato in 100 ml di PBS + per topo e procedere alla selezione positiva sul sistema di smistamento cellulare magnetica ad alta velocità. Se si utilizza un sistema di separazione manuale, fsusseguirsi le istruzioni del produttore per l&#39;arricchimento. In alternativa, risospendere i campioni di tampone FACS: PBS con 1mM EDTA (pH = 8) e 1% BSA, sterile filtrata. </li><li> Rimuovere la frazione positiva e lavare di nuovo con 10 ml di PBS +. La frazione arricchita CD4 + è ora pronto per essere etichettato per l&#39;ordinamento. </li></ol> 4. cellule Ordinamento Naïve CD4 + T <ol><li> Etichettare il pellet di cellule con PBS + anticorpi fluorescenti contenenti diretti contro CD62L, CD44, CD25, e CD4. Se utilizzando gli anticorpi elencati nella Tabella 1, sono forniti diluizioni per ciascuno. Per la colorazione, un volume di 100 ml di cocktail anticorpo viene utilizzato per tessuti da un mouse. </li><li> Risospendere il pellet in cocktail di anticorpi e incubare per 15-30 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS + e centrifugare 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Passare il composto sopra un altro filtro di nylon o filtro cella cap rispostare i detriti avanzi. Pipettare le cellule marcate in un tubo che è compatibile per il cell sorter. Mantenere le cellule in ghiaccio e protetti dalla luce fino al genere. </li><li> Preparare tubi di raccolta pipettando 1-2 ml di mezzi completi RPMI o FBS nel fondo dei tubi compatibili per la raccolta su un cell sorter. </li><li> Ordina l&#39;ingenuo cellule CD4 + T come CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - popolazione (Figura 2). Lavare le cellule raccolte con mezzi completi RPMI e centrifugare come descritto sopra. </li><li> Risospendere il pellet in completo RPMI, contare le cellule naive, e regolare la concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol> 5. Impostare la differenziazione in vitro <ol><li> Aspirare i pozzetti delle piastre rivestite anti-CD3 e anti-CD28 e lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS sterile (senza FBS). Per piastre 48 pozzetti, piastra 0,5 x 10 6 cellule / pozzetto in 0,5 ml di RPMI. Per piastre da 24 pozzetti, cultura 1 x 10 6 cellule / pozzetto in 1,0 ml di RPMI. </li><li> Se testare l&#39;influenza di un elemento quale un farmaco aggiungere la sostanza ai pozzetti appropriati sia prima, durante o dopo il processo di differenziazione seconda dell&#39;esperimento. Avanti, integrare il terreno di coltura con citochine e anticorpi bloccanti conseguenza. Th0: 30 U / ml di hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml di hIL-2, e 5.000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml di hIL-2, 2,000 ng / ml solubile 37.51, e 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml HIL-2, 5.000 ng XMG1.2 / ml, e 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5.000 ng XMG1.2 / ml, e 5.000 ng / ml 11B11. NOTA: Le condizioni sopra esposte sono risultati essere ottimale per massimizzare la produzione di citochine misurata alla fine dell&#39;esperimento differenziazione (sezione Risultati rappresentativi). Tuttavia, ogni condizione deve essere ottimizzato per i singoli laboratori (Tabella 2 </strong&gt;). Inoltre, l&#39;aggiunta di anti-CD28 solubile in aggiunta al anti-CD28 piastra-bound è stato trovato per migliorare la produzione di citochine Th2 nel nostro laboratorio, ma non ha alcun effetto su altri sottogruppi di cellule T: </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C con il 5% di CO 2 per 4-5 d prima analisi dell&#39;espressione genica e della produzione di citochine. In alternativa, rimuovere le cellule dagli stimoli TCR dopo 2 d, rettificato per 1 x 10 6 cellule / ml con mezzi freschi, e la piastra in nuovi pozzi (non rivestito) per migliorare la proliferazione e la resa finale. In questo caso, le citochine polarizzanti fresche e gli anticorpi non sono necessari, ma di 10 U / ml di IL-2 dovrebbero essere aggiunti nuovi media per Th0, Th1, Th2, e culture iTreg. </li></ol> 6. Analisi della Differenziazione <ol><li> Per l&#39;analisi di citochine mediante citometria a flusso, restimolare ogni pozzetto con 10ng / ml PMA e 1.000 ng / ml ionomicina o Tabella / ml anti-CD3 per 4-6 ore in presenza di un inibitore golgi come brefeldina A (1 mg1). Eseguire intracellulare colorazione citochine seconda dell&#39;esperimento (Figura 3). NOTA: Stain citochine o fattori di trascrizione, quali IL-4 (non mostrato) e IFNγ non specifico lineage (Figura 3) per colture Th17, per ciascuna condizione come controlli negativi e come indicatore dell&#39;efficienza differenziazione. Inoltre, macchia Foxp3 per culture Th17 come lo sviluppo reciproco delle Tregs può verificarsi con l&#39;aggiunta di TGFβ. </li><li> Per la quantificazione delle proteine, raccogliere il surnatante da ogni dosaggio bene e specifici citochine ELISA (Figura 3). Se si teme che il fattore in fase di test ha influenzato la proliferazione rispetto a campioni di controllo, le cellule possono essere lavati, contati, normalizzata, e quindi restimolati con 1 mg / ml di anti-CD3 per 24 ore prima di raccogliere surnatanti per test ELISA. Se saggiare IL-4 da Th2 è necessaria condizioni, lavaggio e restimolare rimuovere IL-4 che può essere leftover dalla cultura iniziale differenziazione. </li><li> Per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica mediante real time PCR, le cellule raccolto dopo il periodo di incubazione, lavare, normalizzano, e ri-stimolano per 2-6 h con 1 mg / ml di anti-CD3 prima della raccolta mRNA (Figura 3). </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4(+)+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1.">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li><li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pathogenic+T(H)17+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling.">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Mentre la milza contiene cellule Th naïve, la percentuale di questa popolazione in linfonodi è molto più alta. La mancata corretta identificazione e rimozione dei linfonodi in questo protocollo si tradurrà in una scarsa resa di cellule naïve. Questo può essere particolarmente difficile in topi di età superiore o topi maschi che hanno più tessuto grasso. Come mostrato in Figura 1, fissaggio e spinatura corretta degli arti animali e la pelle consentirà di facilitare la visualizzazione dei linfonodi esterni accessibili. Una volta linfonodi e milze vengono elaborati, separazione delle cellule è il metodo preferito per ottenere una popolazione altamente purificata naive CD4 + T cellule. La purezza è essenziale per prevenire o nTregs effettrici e memoria gi cellule di influenzare il processo di differenziazione delle cellule ingenuo. Difficoltà di ottenere un alto rendimento di cellule T naive sono generalmente provocate dalla raccolta dei tessuti inefficiente e l&#39;elaborazione o la perdita di cellule durante le fasi di separazione. Per aumentare la resa make sure per elaborare le celle utilizzando tamponi freddi e incubazione su ghiaccio. Inoltre, per evitare la perdita di cellule durante arricchimento e / o smistamento, ottimizzando i reagenti e protocolli di separazione in anticipo è raccomandato. Infine, come accennato in vari punti nei passaggi di protocollo, condizioni differenziazione dovrebbe essere ottimizzato per singoli laboratori prima di eseguire esperimenti su larga scala (Tabella 2). Come mostrato in Figura 2, le cellule T CD4 + naive possono essere facilmente distinti dal nTreg (CD4 + CD25 +) ed effettrici (CD4 + CD44 + CD62L -) popolazioni. L&#39;ordinamento è uno dei modi più affidabili per prevenire la contaminazione di effettori Th sottoinsiemi, che esistono anche nelle milza e linfonodi. Treg contaminazione durante la differenziazione può comportare la soppressione dell&#39;attivazione così come la produzione di citochine. La contaminazione di altri effettori Th sottoinsiemi possono causarela produzione di citochine che inibiscono lo sviluppo di linee Th desiderati. Ordinamento spese di impianto possono essere costosi e alcuni scoprire che è più facile di arricchire per le cellule CD4 + T per la separazione magnetica di ridurre il tempo di ordinamento come descritto in questo protocollo. In assenza di un sorter, alcune aziende offrono ora i kit di separazione progettato specificamente per l&#39;isolamento delle cellule CD4 + T naive. Tuttavia, la purezza della popolazione deve sempre essere controllata dopo la separazione, simili ai campioni filtrate. Il ritrovamento di una bassa frequenza di ingenui cellule CD4 + T (CD62L +) rispetto alle celle di memoria / effettrici (CD44 -) può indicare un problema con il mouse, come ad esempio una infezione o tumore. In questo caso le cellule non devono essere utilizzati per questo tipo di esperimento. Ci sono alcuni modi per determinare l&#39;efficacia della Th differenziazione. L&#39;analisi delle proteine ​​è tradizionalmente eseguita da macchia citochinezione, che darà un&#39;idea della percentuale di cellule naive che sono stati polarizzato ad una linea specifica (Figura 3). Protein quantificazione da ELISA è anche uno strumento utile per determinare la quantità totale di citochine essere rilasciato nei media. L&#39;avvertimento con ELISA analisi delle proteine, tuttavia, è che confrontando i risultati tra i gruppi sperimentali possono essere difficile se un fattore di particolare in fase di test ha un&#39;influenza sulla proliferazione e la sopravvivenza. In questo caso, il numero totale di cellule producenti citochine possono essere diversi tra i gruppi alla fine dell&#39;esperimento. Così, normalizzando il numero di celle e restimolare per un breve periodo di tempo (ad esempio, anti-CD3 per 24 h) è necessario per ottenere risultati appropriati. Inoltre, IL-4 è usato come fattore di polarizzazione per la generazione del sottoinsieme Th2, così queste cellule deve essere lavato, normalizzata, e restimolata prima di eseguire un test ELISA per IL-4. Analisi di espressione genica mediante real time PCR è utile non solo fo l&#39;analisi di gene citochine trascrizione, ma anche per i fattori di trascrizione specifici lineage (Figura 3). Così, a seconda dell&#39;esperimento, ci sono vari modi per saggiare l&#39;efficacia della differenziazione Th.

Il concetto di linee o di sottoinsiemi di CD4 + T helper distinti (gi), le cellule è stato intorno dal momento che la seconda metà del 20 ° secolo 1. Riconoscimento dell&#39;antigene cognate in presenza di segnali di costimolazione risultati in vari cicli di proliferazione cellulare e l&#39;eventuale differenziazione in cellule effettrici Th. Il tipo di cellule Th generati durante questo processo dipende sull&#39;ambiente citochina presente durante l&#39;attivazione 2. Inizialmente, le cellule Th naive sono stati pensati per polarizzarsi in 2 linee distinte seguenti recettore delle cellule T (TCR) attivazione, costimolazione CD28 legatura, e la segnalazione di citochine. 1 le cellule helper tipo (Th1) sono caratterizzati dalla loro produzione effettore della citochina IFNγ nonché la loro esigenza di IL-12 di segnalazione durante il processo di differenziazione 3,4. Alla fine si è scoperto che le cellule Th1 differenziate hanno un profilo genetico che è più tipicamente caratterizzata by l&#39;espressione del fattore di trascrizione famiglia scatola T, Tbx21 (T-bet), che è considerato il principale regolatore del programma genetico Th1 5. Inoltre, IL-12 e IFNγ può promuovere espressione T-bet 6,7. Nella risposta immunitaria, le cellule Th1 sono importanti per la difesa contro i patogeni intracellulari e forti promotori di infiammazione autoimmune. In contrasto, cellule helper di tipo 2 (Th2) richiedono IL-4 per il loro sviluppo e le citochine effettrici, tra IL-4, IL-5 e IL-13, sono importanti per guidare le risposte delle cellule B e sono patogeni allergia 8, 9. Simile a cellule Th1, le cellule Th2 sono stati trovati ad esprimere la propria principale regolatore trascrizionale, chiamato GATA-3 10,11. È interessante notare la presenza di citochine polarizzanti e la generazione di una specifica linea Th sono antagonisti allo sviluppo di altri 2,12, suggerendo che solo un particolare sottoinsieme Th può diventare dominante durante un re immunitariorisposta. Poiché l&#39;identificazione delle linee Th1 e Th2, ulteriore lavoro ha dimostrato ancora più unica sottogruppi di cellule T helper, incluse follicolare helper (TFH), IL-9-produzione (Th9), e IL-22-produzione (Th22) (recentemente rivisto in 13). Ai fini di esperimenti di differenziazione in vitro, questo protocollo si concentrerà solo su due sottoinsiemi gi altri, chiamati cellule T regolatorie (Treg) e-17-producono IL cellule CD4 + T (Th17). Cellule T regolatrici CD25 + possono verificarsi in natura (nTreg) nel timo; cellule Th naïve possono anche essere indotti (iTreg) per diventare normativa in periferia (rivisto in 14,15). Entrambi i tipi di Tregs esprimono un fattore di trascrizione caratteristico, definito scatola forkhead P3 (Foxp3), che è critica per i loro meccanismi di soppressione effettori che includono la produzione solubili anti-infiammatori mediatore, IL-2 consumo, e delle cellule meccanismi contatto-dipendente 14,15. La mancanza di Foxp3 risultati espressione di una grave, multiorgano malattia autoimmune chiamati disregolazione immunitaria, poliendocrinopatia, enteropatia, la sindrome X-linked (IPEX), dimostrando il ruolo critico di questo sottoinsieme Th nel risolvere l&#39;infiammazione e regolazione tolleranza periferica di auto antigeni 16. In vitro, le cellule helper CD4 + T naive up-regolano Foxp3 e diventare impegnati nel programma Treg dopo stimolazione con IL-2 e TGF-β 14,15. Ci possono essere da moderata a notevole plasticità in linee cellulari T CD4 +, soprattutto se si considera solo la produzione di citochine (rivisto in 17,18). Tuttavia, ai fini di protocolli di differenziamento in vitro, discuteremo ogni sottoinsieme come un lignaggio unico. Recentemente, un sottogruppo di cellule Th17 che produce la citochina IL-17 è stato identificato come un lignaggio unico con funzioni pro-infiammatorie che sono particolarmente patogeni durante l&#39;infiammazione autoimmune 19-21. Cellule Th17 esprimono un fattore di trascrizione unico, chiamato retinoidi legati orfano recettore gamma t (RORγt) che coordina il programma genetico Th17 22. TGFβ è importante per la generazione di Th17 lineage attraverso l&#39;induzione di RORγt. Tuttavia, l&#39;effetto di segnalazione TGFβ è creduto per indurre unico impegno Th17 su synergizing con IL-6 (valutata in 12). Ulteriori studi hanno dimostrato che una varietà di altri segnali che possono regolare positivamente impegno Th17, comprese IL-1β, aumento del sodio, e TLR segnalazione 23-26. Altri studi hanno suggerito che i patogeni cellule Th17 in vivo sono quelli che ignorano di fatto la segnalazione TGFβ e invece si basano su una combinazione di IL-1, IL-6 e IL-23 per la loro differenziazione 27. Così, le cellule Th17 possono essere ricavati da una varietà di vie di segnalazione; ai fini del presente protocollo, comunemente usato il (TGFβ e IL-6), percorso per Th17 lineage impegnosarà presentato. I protocolli di differenziazione descritti di seguito per tutti i lignaggi effettrici si basa su anticorpi fisso come stimoli per il TCR e CD28 durante l&#39;intero corso dell&#39;esperimento. Tuttavia, altri hanno dimostrato che l&#39;attivazione TCR con l&#39;antigene cellule presentanti l&#39;28 o cross-linking anti-CD3 e anti-CD28 con anticorpi criceto per 2 giorni 29 sono anche mezzo altamente efficace per indurre la generazione di vari sottoinsiemi Th. Il protocollo presentato qui si basa su metodi precedentemente segnalati per isolare le cellule CD4 + T murine da organi linfoidi secondari 30 e la generazione di cellule Th17 31. Una differenza importante è che questo protocollo si basa sull&#39;utilizzo di un cell sorter isolare le cellule CD4 + T naive dai tessuti linfoidi. Tuttavia, molte aziende offrono ora i kit di separazione rapidi che possono arricchire le cellule T CD4 + naïve, che può essere in grado di bypassare il requisito fo l&#39;ordinamento seconda dell&#39;esperimento. I metodi e reagenti presentati in questo protocollo sono ciò che abitualmente usiamo e troviamo per essere il più efficace. Tuttavia, tenere presente che esistono reagenti e metodi alternativi per molti dei passi presentati di seguito e spetta al laboratorio individuo per determinare che cosa funziona meglio per i loro scopi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete RPMI:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 micron nylon mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0120-10YD</td>
			<td>Cut into 2 cm2 squares and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative: 100 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td>Alternative to cutting nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS rinsing solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 beads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human (h) IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-12</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>210-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTGFb</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C11 (anti-CD3)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37.51 (anti-CD28)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11B11 (anti-IL-4)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD62L-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104406</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102008</td>
			<td>Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-PerCP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100434</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103012</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol&#160; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8139</td>
			<td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-0634</td>
			<td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4506-51</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Il punto di tempo per l&#39;analisi di differenziazione può variare a seconda della condizione Th in prova e la forza di attivazione del recettore delle cellule T. Dopo 2-3 giorni di differenziamento, le cellule possono essere visualizzati al microscopio ottico per determinare l&#39;entità della proliferazione delle cellule T. Wells espositrici vasta proliferazione e aggregazione delle cellule saranno molto probabilmente pronti per l&#39;analisi al giorno 4. Condizioni di differenziazione si basa su l&#39;aggiunta di esogeno IL-2, come Th1 e Th2, probabilmente esaurire i media dopo 4 giorni di coltura. Per massimizzare la produzione di citochine, tali pozzi con i media esausti possono essere rifornite con RPMI fresco contenente IL-2 o contate e ri-placcato a 1 x 10 6 cellule per pozzetto in RPMI fresco contenente IL-2 per estendere la differenziazione per un altro giorno o due con questo metodo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig1.jpg" /> Figure 1. Illustrazione di posizionamento perno per fissare un mouse per l&#39;isolamento di milza e linfonodi. (A) Stendere le membra a pezzi e fissarli con un ago sterile o pin dissezione. Da questa posizione, tagliare il pelo e la pelle longitudinalmente dalla coda al mento. (B) Dopo il taglio, delicatamente diffondere la pelle a parte per esporre i linfonodi, come mostrato in figura. Le posizioni dei linfonodi che sono facilmente accessibili da questa posizione sono elencati in figura. La milza si trova appena sotto la gabbia toracica sul lato destro dell&#39;animale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig2.jpg" /> Figura strategia di smistamento 2. Rappresentante per l&#39;isolamento di CD4 + naïve </sup&gt; Cellule T da cellule di smistamento. Partendo dalla parte superiore sinistra, i linfociti vengono prima gated per dimensione e quindi le cellule di singoletto sono discriminati dalle cellule doppietto. Gating su canottiere rivela una popolazione di CD4 + CD25 + cellule che sono nTregs. Gate sulla CD4 + CD25 - popolazione e quindi ordinare ingenuo (CD62L + CD44 -) dalla effettrici / memoria (CD62L - CD44 +) cellule CD4 +. Le linee tratteggiate indicano l&#39;origine cancello del prossimo trama. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig3.jpg" /> Figura 3. Dati di esempio seguente in vitro Th differenziazione. (A) Intracdati ellular citochine colorazione (gated su CD4 +) da Th1, Th2, iTreg e differenziazioni Th17. Tipicamente, citochine specifiche non lignaggio, quali IL-4 e IFNγ per culture Th17, devono essere colorati per determinare la qualità della differenziazione. Dati (B) ELISA seguente 4 d Th differenziazione, lavaggio, e 24 h restimolazione di cellule con 1 mg / ml. (C) time-CD3 anti- reale PCR dati dei fattori di trascrizione specifici lineage seguenti 4 d differenziazione e restimolazione per 4 ore con 1 mg / ml di anti-CD3. Tutte le quantità di geni sono stati normalizzati per l&#39;espressione di β-actina e mRNA da cellule T naive indifferenziate servono come base per l&#39;espressione genica. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52739/52739fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Tabella 1. Vedere Materiali tabella qui sotto. <table border=&quot;0&quot; cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagente </td><td> Consigliato Titolazione Gamma </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Le citochine: </td><td></td></tr><tr><td> Umano (h) IL-2 </td><td> 5 U / ml - 50 U / ml </td></tr><tr><td> rmIL-4 </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> rmIL-6 </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> rmIL-12 </td><td> 10 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td> hTGFb (Th17) </td><td> 0,1 ng / ml - 5 ng / ml </td></tr><tr><td> hTGFb (iTreg) </td><td> 5 ng / ml - 30 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi: </td><td></td></tr><tr><td> 2C11 (anti-CD3) </td><td> 500 ng / ml - 5.000 ng / ml </td></tr><tr><td> 37.51 (anti-CD28) </td><td> 250 ng / ml - 2.500 ng / ml </td></tr><tr><td> 11B11 (anti-IL-4) </td><td> 5.000 - 10.000 ng / ml </td></tr><tr><td> XMG1.2 (anti-IFNg) </td><td> 5.000 - 10.000 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Consigliato titolazione Gamma per la ottimizzazione della differenziazione condizioni.

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.7K Views.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

Video: Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle toxicity testing in immortalized cell lines or primary cells have shown discrepancies, highlighting the need to extend the use of primary cells for in vitro assays. This protocol describes the isolation of mouse liver macrophages, named Kupffer cells, and their use to study nanoparticle toxicity. Kupffer cells are the most abundant macrophage population in the body and constitute part of the reticulo-endothelial system (RES), responsible for the capture of circulating nanoparticles. The Kupffer cell isolation method reported here is based on a 2-step perfusion method followed by purification on density gradient. The method, based on collagenase digestion and density centrifugation, is adapted from the original protocol developed by Smedsr&#248;d et al. designed for rat liver cell isolation and provides high yield (up to 14 x 106 cells per mouse) and high purity (&#62;95%) of Kupffer cells. This isolation method does not require sophisticated or expensive equipment and therefore represents an ideal compromise between complexity and cell yield. The use of heavier mice (35-45 g) improves the yield of the isolation method but also facilitates remarkably the procedure of portal vein cannulation. The toxicity of functionalized carbon nanotubes f-CNTs was measured in this model by the modified LDH assay. This method assesses cell viability by measuring the lack of structural integrity of Kupffer cell membrane after incubation with f-CNTs. Toxicity induced by f-CNTs can be measured consistently using this assay, highlighting that isolated Kupffer cells are useful for nanoparticle toxicity testing. The overall understanding of nanotoxicology could benefit from such models, making the nanoparticle selection for clinical translation more efficient.

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Kupffer isolamento delle cellule di nanoparticelle test di tossicità

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura di Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti