Wir danken Drs.. Robert Bonneau und Neil Christensen für hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde von der Pennsylvania State University College of Medicine Fonds unterstützt.

1. Isolierung von T-Zellen aus Milz und Lymphknoten von Mäusen BDC2.5 <ol><li> Verwenden Sie 6 Wochen alten Pre-diabetischen weiblichen Mäuse BDC2.5 als Spender von diabetogene CD4 + T-Zellen. Mäuse sollten Diabetes-frei durch Uringlucose Messung (siehe unten) bestimmt. </li><li> Euthanize jede Maus mit CO 2-Erstickung und entfernen Sie die Milz, Achsel-und brachial Lymphknoten unter sterilen Bedingungen. Um die Milz zu entfernen, tränken Sie das Fell mit 70% Ethanol, dann geschnitten und einfahren Haut. Die Milz wird sichtbar als dunkelrotes Organ auf der linken Seite der Maus. Machen Sie eine 1-Zoll-Schnitt im Bauchfell mit den kleinen Schere und sanft greifen die Milz in der Mitte mit einem Paar kleine Pinzette. Sorgfältig schneiden das Bindegewebe und die angeschlossenen Fett so weit wie möglich zu entfernen und die Milz. </li><li> Sammeln Sie die Milz und die Lymphknoten in 10 ml Dulbecco&#39;s-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie eine einzelne Zelle Suspension mit the Ende einer sterilen 10 ml Spritze Kolben vorsichtig auf die lymphatischen Organen durch 70 um Zelle Siebe (eine pro Milz Sieb und 4-6 Lymphknoten pro Sieb) in den gleichen 50 ml konischen Röhrchen. </li></ol> Während des Prozesses, spülen jedes Sieb mit 1 ml DMEM mehrmals, um die Gewinnung von Zellen aus dem Sieb zu maximieren. <ol start="5"><li> Übertragen der gesammelten Zellen von dem 50 ml konischen Röhrchen in ein 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 300-400 xg für 7 min bei RT. </li><li> Um rote Blutzellen lysieren, den Überstand verwerfen, wieder die Zellen in 5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK)-Puffer (pH 7,2) und inkubieren Sie die ACK-Zell-Suspension bei RT für 5 min. </li><li> 10 ml DMEM dem ACK-Zell-Suspension und zentrifugieren wie oben. Waschen Sie das Zellpellet einmal in 10 ml DMEM. </li></ol> 2. Fluorescence-Activated Cell Sorting von diabetogene CD4 + T-Zellen von Mäusen BDC2.5 <ol><li> Re-suspend Zellen in 5 ml FACS sTaining Puffer und zählen die Anzahl der lebensfähigen Zellen (mit einem Phasenkontrast-Mikroskop und einer Zählkammer) durch Trypanblau Ausgrenzung. </li><li> Mit FACS-Puffer, passen die Zellsuspension Volumen bis 5 x 10 7 Zellen / ml. Entfernen ~ 1 x 10 6 Zellen pro Färbung Kontrolle (1 keine Flecken, 3 Einzelzimmer Flecken). Färben der Probe auf nicht-aktivierten transgenen CD4 + T-Zellen mit anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) und Anti-CD62L (PE) monoklonaler Antikörper (mAb) in einem 15 ml-Röhrchen. Führen Zellfärbung mit den mAb Konzentrationen vom Hersteller für 20-30 min schlug bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Probe und einzigen Fleck Kontrollen mit FACS-Puffer bei&gt; 3X der Färbereaktion Volumen. Zentrifugieren bei 300-400 xg, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in FACS-Puffer (1-2 x 10 7 Zellen / ml für die Sortierung von Probe und 300 ul für einzelne Fleck Kontrollen) und auf Eis lagern bis zum nächsten Schritt. </li><li> Übergeben Sie die Zelle Probe durch eine 35 um ZelleSieb Haubenrohr zu entfernen Zellklumpen. Ordnen Sie die Proben für CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + Zellen auf einem Cell Sorter mit einem geschulten Bediener. Sammeln Sie die sortierten Zellen in 3 ml DMEM in einer 15 ml Tube. Erlauben 2,5-3 Std., einschließlich Setup, bis 1,5 x 10 8 Zellen (die ungefähre Anzahl von Zellen aus 3 Donormäusen erhalten) an einer Art von 2 x 10 4 insgesamt events / sec sortieren. Erwarten ~ 2,5 x 10 6 nicht aktivierten transgenen CD4 + T-Zellen pro Maus nach cell sorting. </li><li> Notieren Sie sich die absolute Zahl der sortierten Zellen am Ende der Sortierung und zentrifugieren für 7 min bei 300-400 g x. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen (2 x 10 6 Zellen / ml) in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 +-frei) für die T-Zell-Transfer Adoptiveltern. </li></ol> 3. Adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Zellen aus BDC2.5 Mäuse <ol><li> Mit einer 1-ml-Spritze und ein 18-1 ½-Gauge-Nadel, sanft resuspendieren die FACS-gereinigten CD4 +T-Zellen und laden Sie die 1 ml Spritze. In Vorbereitung zur Injektion, ersetzen Sie den 18-1 ½-Gauge-Nadel mit einer 27-Gauge-Nadel ½. </li><li> Expose 6-8 Wochen alte weibliche NOD.SCID Empfängermäuse einer Wärmelampe, bis sie Pflege Verhalten zeigen. </li><li> Zurückhalten Empfängermäuse in einem Verzögerer und wischen dem Schwanz mit 70% (v / v) Ethanol, um die Injektionsstelle zu desinfizieren. </li><li> Spritzen 1-2 x 10 6 FACS sortierten Zellen / Maus (in bis zu 500 ul PBS) entweder in der seitlichen Schwanzvenen. </li></ol> Nicht mit Gewalt den Kolben. Wenn die Nadel richtig in der Vene liegt, wird die Einspritzung fast ohne Widerstand zu nehmen. 4. Überwachung Empfänger Mäuse für Hyperglykämie und T1D <ol><li> Beginnend fünf Tage nach der T-Zell-Übertragung werden NOD.SCID Empfängermäuse täglich erhöhten Urin Glucose unter Verwendung von Teststreifen (Bayer Diastix) gemäß den Anweisungen des Herstellers überwacht. Mäuse, die mit zwei aufeinanderfolgenden urine Blutzuckerwerte&gt; 250 mg / dl gelten als Diabetiker. </li></ol>

<ol>
	<li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+of+a+non-obese,+diabetic+strain+of+mice.">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li><li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+etiology,+immunology,+and+therapeutic+strategies.">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li><li>Delovitch, T. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8++cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice.">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li><li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+maintenance,+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines/clones+from+the+nonobese+diabetic+mouse.">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li><li>Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. 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M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4++Foxp3++cells+in+BDC2.5NOD+mice.">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li><li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonobese+diabetic+scid+mouse:+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency.">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li></ol>

Alle Mäuse wurden an der Penn State College of Medicine specific pathogen-freie (SPF)-Anlage in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Penn State Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss untergebracht. Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

T1D in Empfängermäuse bei unterschiedlichen Wirkungsgrade durch adoptiven Transfer von ganzen Milzzellen oder T-Zell-Untergruppen von diabetischen NOD-Mäusen oder Mäusen transgenen TCR von diabetogene T-Zell-Klone abgeleitet induziert werden. Wir berichten hier über ein reproduzierbares Verfahren zur Induktion in Empfängermäuse innerhalb von zwei Wochen T1D bei 100% Inzidenz durch Übertragung FACS-gereinigten CD62L + BDC2.5 transgenen CD4 + T-Zellen in Mäusen NOD.SCID. Besondere Vorteile der T-Zell-Transfer BDC2.5 hier beschriebenen Modell sind die sehr kurzen Induktionszeit von T1D gegenüber Monate für spontane Diabetes und bis zu mehreren Wochen für Diabetes Übertragung durch diabetogene T-Zell-Untergruppen oder T-Zell-Klone. Darüber hinaus aufgrund ihrer Homogenität, sind nur eine geringe Anzahl von gereinigtem BDC2.5 transgenen T-Zellen erforderlich zu übertragen T1D mit hoher Effizienz und Konsistenz. Im Gegensatz zu einigen anderen T-Zellen-Transfer-Methoden, in vitro-Aktivierung von T-Zellen transgener BDC2.5 vor transfer ist nicht in unserem Protokoll notwendig. Ein weiterer Vorteil der monospezifischen T-Zell-Übertragung Verfahren ist, dass die neuen therapeutischen Strategien in der Homing von Insel-Antigen-spezifischen T-Zellen zum Zielorgan eingreifen selektiver als bei anderen Protokollen untersucht werden, dass die Übertragung Diabetes mit heterogenen T-Zellpopulationen. Eine mögliche Einschränkung der Methode ist, dass es nicht geeignet ist, den Beitrag von CD4 + und CD8 + T-Zell-Untergruppen in T1D Pathogenese bestimmen, da monospezifischen, diabetogen CD4 +-T-Zellen verwendet werden, um Diabetes zu übertragen. In Abwesenheit eines FACS Instrument BDC2.5 transgenen T-Zellen können durch Säulenchromatographie Reinigung isoliert werden mit PE-markiertem anti-TCR Vβ4 mAb und anti-PE magnetischen Kügelchen von CD4 + CD62L + gefolgt magnetischen Kügelchen (Miltenyi). Es sollte angemerkt werden, dass FACS-gereinigt sowie säulengereinigt T-Zellen, wird eine kleinere Population von CD4 +-T-Zellen thbei nicht Ausdruck der transgenen TCR aufgrund unvollständiger allelic Ausschluss des endogenen TCR Gene 15. Das gereinigte T-Zell-Fraktion kann auch CD4 + CD25 + Zellen, die Treg T1D Entwicklung Empfänger unterdrücken kann. Da beide T-Zell-Populationen berichtet worden, um in BDC2.5 Mäuse mit dem Alter zu erhöhen, empfehlen wir die Verwendung BDC2.5 Mäuse, die nicht älter als 6 Wochen 22,23. CD4 + CD25 + Treg Zellen können alternativ aus BDC2.5 T-Zellen durch FACS-Sortierung oder Trennung mit CD4 ausgeschlossen + CD25 + magnetische Kügelchen (Miltenyi) bei älteren BDC2.5 Mäusen. Alternativ oder zusätzlich zu T1D Überwachung von Urin Glukose Messungen kann Blutzuckerspiegel genau in Empfänger-Mäuse mit einem Handheld glucometer bestimmt werden. Kritische Schritte in diesem Protokoll sind das Alter BDC2.5 Spender und Empfänger NOD.SCID Mäusen. Mit jungen BDC2.5 Mäuse (6 Wochen) wird sichergestellt, dass sie Diabetes-frei sind und dass die Häufigkeit der beiden enendogenen nicht-transgenen T-Zellen und Treg-Zellen niedrig sind, wie oben dargelegt. Es ist auch wichtig, junge (&lt;12 Wochen) NOD.SCID Mäusen als Empfänger Mäuse zu verwenden, da dieser Stamm ist anfällig für die Entwicklung, die sich manifestiert thymomas nach 20 Wochen von 24 Jahren und kann T1D Entwicklung nach adoptiven T-Zell-Transfer zu verwechseln. Zukünftige Anwendungen des beschriebenen Verfahrens sind Untersuchungen in CD4-T-Zell-vermittelte Mechanismen der Pathogenese T1D und neue Strategien zum selektiven Eingreifen in Induktion der Krankheit, die nicht beim Menschen möglich.

Die NOD-Maus entwickelt Autoimmundiabetes spontan und wurde vielfach als Tiermodell für die menschliche T1D 1,2 verwendet. Pathogenese der T1D in NOD-Mäusen durch Infiltration, beginnend bei 3-4 Wochen alt, der pankreatischen Langerhans-Inseln von dendritischen Zellen und Makrophagen durch T und B-Zellen folgte. Diese Phase der zerstörungsfreien peri-Insulitis führt zu einem langsamen, fortschreitenden Zerstörung der Insulin-produzierenden β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, was zu manifester Diabetes von 4-6 Monaten 3 Jahren. Übertragen von Splenozyten 4,5, CD4 + oder CD8 + 6,7 8,9 T-Zellen von diabetischen NOD-Mäusen haben gezeigt, dass Diabetes bei immungeschwächten Mäusen NOD vermitteln, was anzeigt, dass Insel-reaktiven T-Zellen eine zentrale Rolle in T1D Pathogenese spielen. Abhängig von den experimentellen Bedingungen, entwickelt Diabetes in Empfängermäuse langsam, über mehrere Wochen in diesen Studien. Ebenso verschiedenen T-Zell-Klone, von Zeit-und kostenintensive abgeleitetKultivieren von diabetogenen T-Zellen wurde berichtet, Diabetes mehrere Wochen nach der Überführung in Empfängermäuse 7,10 vermitteln. Mit der Verfügbarkeit von transgenen Mäusen, die TCRs von CD4-oder CD8-restringierte T-Zell-Klone diabetogen, mehreren Laboratorien abgeleitet wurden später gezeigt, dass Milz-T-Zellen aus diesen Mäusen in der Lage, Diabetes Empfänger 11-13 übertragen wurden. Insbesondere sind BDC2.5 NOD-Mäuse transgen für das BDC2.5 TCR, die spezifisch für Chromogranin A, ein Protein in pankreatischen beta-Zellen 14-16 ist. Übertragen von in vitro-aktivierten oder un-aktivierte ganz oder fraktionierte Milzzellen offen Diabetiker oder prediabetic BDC2.5 Mäuse übertragen Diabetes bei Neugeborenen oder immungeschwächten NOD-Mäuse in unterschiedlichen Wirkungsgrade 11,17-19. Wir beschreiben eine einfache Methode, die gereinigt transgenen CD4 + T-Zellen nutzt von Pre-diabetischen Mäusen BDC2.5 in Empfängermäuse bei hohem Wirkungsgrad und consiste T1D induzierenncy. Eine große Anzahl von naiven Insel Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus diesen Mäusen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für CD4 + CD62L + T Zellen, die das transgene TCR Vβ4 Kette isoliert. Gereinigtes transgenen T-Zellen werden dann ohne Aktivierung in NOD.SCID Mäusen, die Funktions-T-und B-Zellen fehlt und Insulitis-und Diabetes-freie 20 übertragen. Die Empfänger-Mäuse werden für erhöhte Konzentrationen von Urin Glucose T1D anzeigt, die sich schnell entwickelt sich innerhalb von zwei Wochen nach der T-Zell-Transfer überwacht. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die übertragen diabetogene T-Zellen mit heterogenen Besonderheiten, unser Protokoll FACS-sortierten CD4 + T-Zellen, die fast ausschließlich Ausdruck der diabetogene BDC2.5 TCR verwendet. Aufgrund ihrer Homogenität, sind nur eine kleine Anzahl von T-Zellen übertragen (~ 1x10 6 Zellen / Maus) für die schnelle Entwicklung T1D innerhalb von 2 Wochen bei 100% Inzidenz erforderlich. Ein weiterer Vorteil ist, dass unser Protokoll irradiation des Empfängers Mäusen ist nicht notwendig, da es für einige andere Methoden. Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist, dass es nicht zulassen, die Untersuchung der Beteiligung von CD4 und CD8 T-Zell-Untergruppen oder insbesondere CD8-T-Zellen bei Diabetes. Die beschriebene Protokoll wird nützlich für die Untersuchung schneller T1D Entwicklung von naiven monospezifischen CD4 + T-Zellen, sowie therapeutische Strategien vermittelt, um in Homing von Inselzellen-Antigen-spezifische Th-Zellen in das Zielorgan eingreifen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(Tcr&alpha;BDC 2.5, Tcr&beta;BDC 2.5)</td>
			<td>JAX</td>
			<td>004460</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J)</td>
			<td>JAX</td>
			<td>001303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
			<td>Themo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Diastix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM2803</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical tweezers</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile small pair scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile large pair scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &mu;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &mu;m cell strainer cap tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlowTM sheath fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (APC) mAb</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005616</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TCR V&beta;4 (FITC) mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553365</td>
			<td>clone KT4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L (PE) mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553151</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-1&frac12; gauge needles (sterile)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27&frac12; gauge needles (sterile)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accelerated type 1 diabetes induction in mice by adoptive transfer of diabetogenic cd4+ t cells

Die nonobese diabetischen (NOD) Maus spontan entwickelt Autoimmun-Diabetes nach 12 Wochen alt und ist der am intensivsten untersuchten Tiermodell der menschlichen Typ-1-Diabetes (T1D). Zelltransfer Studien in bestrahlte Mäuse Empfänger haben festgestellt, dass T-Zellen sind entscheidende in T1D Pathogenese in diesem Modell. Wir beschreiben hier ein einfaches Verfahren, um schnell durch adoptiven Transfer von gereinigtem T1D induzieren primäre CD4 + T-Zellen von Pre-diabetischen NOD-Mäusen transgen für die Insel-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) BDC2.5 in NOD.SCID Empfängermäuse. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik sind, dass Isolation und adoptiven Transfer von T-Zellen diabetogene abgeschlossen werden kann innerhalb des gleichen Tages, Bestrahlung der Empfänger nicht erforderlich ist, und eine hohe Inzidenz von T1D ist innerhalb von 2 Wochen nach entlockte T-Zell-Transfer werden. So können Untersuchungen der Pathogenese und therapeutische Interventionen in T1D mit einer schnelleren Rate als bei Methoden, die auf heterogenen T-Zell-Populationen oder Klonen verlassen gehenabgeleitet von diabetischen NOD-Mäusen.

Unsere Ergebnisse zeigen, die Isolierung von transgenen BDC2.5 exprimieren CD62L, die kritisch für die T-Zellen, nach Hause zu sekundären lymphatischen Organe wie Lymphknoten an ist. Unsere Ergebnisse zeigen weiterhin die starke Fähigkeit dieses monospezifische T-Zell-Population, um schnell und effizient zu übertragen NOD.SCID Empfängermäuse T1D. Isolierung von diabetogenen CD4 + T-Zellen von Mäusen BDC2.5 ist in Abbildung 2 dargestellt. Ungefähr 5 x 10 7 Zellen aus gepoolten Milz und Lymphknoten wurden pro Spender Maus vor cell sorting erhalten. Nach der durchflusszytometrischen Art, ~ 2,5 x 10 6 naive transgene CD4 + T-Zellen (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) wurden von jedem Spender BDC2.5 Maus mithilfe der angegebenen Gating-Strategie erhalten. Wie erwartet, adoptiven Transfer von einer kleinen Anzahl von CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + Zellen (~ 1 x 10 6 Zellen / Maus) aus BDC2.5 Donormäusen in allen NOD.SCID re induzierte T1D<html> fänger (100% Inzidenz) am Tag 11, wie durch erhöhte Uringlucose (Abbildung 3). Im Vergleich, die Übertragung von heterogenen CD3 + T-Zellen erforderlich BDC2.5 3-5 fach mehr Zellen zu induzieren T1D in 80% NOD.SCID Empfänger von 3 Wochen 21. Diese Daten zeigen, dass adoptiven Transfer von einer kleinen Anzahl von FACS-gereinigten BDC2.5 transgenen CD4 + CD62L + T-Zellen in Mäusen induziert NOD.SCID T1D schneller und effizienter. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50389/50389fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablauf der experimentellen Veranstaltungen. Milz und Lymphknoten wurden aus BDC2.5 Mäusen gesammelt. Naive transgenen CD4 + T-Zellen (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) wurden durch FACS isoliert. T-Zellen wurden in PBS resuspendiert und intravenös in NOD.SCID Empfänger, der anschließend auf erhöhten Uringlucose wurden überwacht anzeigt T1D injiziert. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50389/50389fig2.jpg" /> Abbildung 2. Gating-Strategie zu sortieren CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + Milz und Lymphknoten-Zellen abgeleitet von BDC2.5 Mäusen durch FACS. Eine Einzelzell-Suspension vereinigt Milzen und Lymphknoten wurde mit fluoreszenzmarkierten Anti-CD4 (APC) gefärbt, anti -TCR Vβ4 (FITC) und Anti-CD62L (PE) mAb. Die Dot-Plot auf der linken Seite zeigt die CD4 + TCR Vβ4 + Zellpopulation, die verwendet werden, um die Gate-CD62L + Zellen im rechten Dot-Plot gezeigt wurde. Boxed Zellen stellen Prozentsätze der gated Zellpopulationen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50389/50389fig3.jpg" /> Abbildung 3. Adoptiven Transfer von diabetogene CD4 T-Zellen. FACS-isolierten CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + Zellen aus BDC2.5 Mäuse wurden intravenös injiziert (1,3 x 10 6 Zellen / Maus) in NOD.SCID Empfängermäuse (n = 5). Mäuse were für T1D durch Messung der Glukosekonzentration im Urin in den Empfängern überwacht. Mäuse, die mit zwei aufeinander folgenden Lesungen von&gt; 250 mg / dl wurden als Diabetiker.

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Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

accelerated-type-1-diabetes-induction-mice-adoptive-transfer

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.6K Aufrufe.  Pennsylvania State University College of Medicine. Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Serie: Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Herstellung von CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...