אנו מודים בני הזוג. רוברט בונו וניל כריסטנסן על הערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מכללת פנסילבניה סטייט של קרנות רפואה.

1. בידוד של תאי T מטחול ובלוטות לימפה של עכברים BDC2.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש BDC2.5 נקבות עכברים טרום סוכרת 6 בן שבוע כתורמים של CD4 + T תאי diabetogenic. עכברים צריכים להיות חופשיים, כפי שנקבעו על ידי סוכרת מדידת גלוקוז בשתן (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים כל עכבר באמצעות חנק CO 2 ולהסיר את בלוטות הלימפה בטחול, בבית השחי וזרוע בתנאים סטריליים. כדי להסיר את הטחול, יש להשרות את הפרווה עם 70% אתנול, ואז לחתוך ולחזור בו עור. הטחול יהיה גלוי כאיבר אדום כהה בצדו השמאלי של העכבר. ביצוע חתך 1 אינץ&#39; בצפק באמצעות מספריים הקטנים ולתפוס בעדינות את הטחול במרכז עם פינצטה קטנה. לקצץ בזהירות את רקמות חיבור ושומן מצורף ככל האפשר ולהסיר את הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הטחולים ובלוטות לימפה ב10 מ&quot;ל בינוני של Dulbecco&#39;s-Modified הנשר (DMEM) בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השעיה תא בודדת באמצעות הסוף הדואר של בוכנת מזרק 10 מ&quot;ל סטרילי ללחוץ את האיברים הלימפה בעדינות דרך מסננות 70 מיקרומטר תא (אחד טחול למסננת ו4-6 בלוטות הלימפה במסננת) לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li></ol> במהלך התהליך, יש לשטוף את כל מסננת עם 1 מ&quot;ל DMEM מספר פעמים על מנת למקסם את ההתאוששות של תאים מהמסננת. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים שנאספו מצינור חרוטי 50 מ&quot;ל לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטי ב300-400 XG במשך 7 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlyse תאי דם אדומים, לבטל את supernatant, מחדש להשעות את התאים ב5 מיליליטר אמוניום-כלוריד, אשלגן (ACK) חיץ (pH 7.2), ודגירת ההשעיה ACK התאים ב RT למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של DMEM להשעית ACK-תא וצנטריפוגות הצינור כאמור לעיל. שטוף את התא גלולה פעם אחת ב 10 מ&quot;ל DMEM. </li></ol> 2. מיון תא הקרינה המופעל מסוג CD4 + T Diabetogenic תאים מהעכברים BDC2.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מחדש להשעות ב5 מ&quot;ל FACS שלTaining חיץ ולספור את מספר תאי קיימא (באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב וhemocytometer) על ידי הרחקת trypan הכחולה צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחיץ FACS, להתאים את עוצמת קול ההשעיה תא 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל. הסר ~ 1 x 10 6 תאים לכל שליטה מכתים (1 מס 3 כתמי כתם, בודדים). כתם המדגם עבור CD4 המהונדס שאינם מופעל + תאי T מסוג CD4 עם אנטי (APC), אנטי TCR Vβ4 (FITC) ונוגדנים נגד CD62L (PE) חד שבטיים (מב) בצינור 15 מ&quot;ל. לבצע מכתים תא באמצעות ריכוזי מב שהוצעו על ידי היצרן עבור 20-30 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את פקדי כתם בודדים מדגם ועם חיץ FACS ב&gt; 3X נפח התגובה מכתים. צנטריפוגה צינור ב300-400 XG, להסיר את supernatant, מחדש להשעות את התאים בFACS חיץ (1-2 x 10 7 תאים / מ&quot;ל למיון והמדגם 300 μl עבור פקדי כתם יחידים) ולאחסן על קרח עד למחרת צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת התא דרך מיקרומטר תא 35צינור כובע מסננת כדי להסיר גושי תאים. מיין את דוגמאות לסוג CD4 + TCR Vβ4 + + CD62L תאים בסדרן תא עם מפעיל מיומן. לאסוף את התאים הממוינים ל3 מ&quot;ל DMEM בצינור 15 מ&quot;ל. לאפשר 2.5-3 שעות, כולל התקנה, כדי למיין 1.5 x 10 8 תאים (מספר המשוער של תאים המתקבלים מ3 עכברים תורמים) בשיעור סוג של 2 x 10 4 אירועים / שני בסך הכל. מצפה ~ 2.5 x 10 6 CD4 מהונדס שאינם מופעל + T תאים לכל עכבר לאחר מיון תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים בסוף המיון וצנטריפוגות ל7 דקות ב 300-400 x גרם. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים (2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל) בסטרילי פוספט שנאגרו מלוח (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + חינם) להעברת תא T המאמצת. </li></ol> 3. העברת מאמצת של CD4 + T Diabetogenic תאים מעכברים BDC2.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל ומחט מד ½ 18-1, בעדינות מחדש להשעות את הסוג CD4 +-FACS מטוהרתאי T ולטעון את מזרק 1 מ&quot;ל. כהכנה להזרקה, להחליף 18-1 ½ מחט מד עם 27 ½ מחט מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף 6-8 עכברי נמען NOD.SCID נשיים בן שבוע למנורת חימום עד שהם מפגינים טיפוח התנהגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן עכברי נמען בעוצר ולנגב הזנב שלהם עם 70% (V / V) אתנול לחיטוי אזור ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1-2 x 10 תאים ממוינים / עכבר 6 FACS (בעד 500 PBS μl) לאחד מורידי הזנב לרוחב. </li></ol> אל תדחף את הבוכנה. אם המחט ממוקמת כראוי בווריד, ההזרקה תתקיים כמעט ללא התנגדות. 4. ניטור עכברים נמען ליפרגליקמיה וT1D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מחמישה ימים לאחר ההעברה לתא T, עכברי נמען NOD.SCID מנוטרים יומיים לרמת סוכר גבוה בשתן באמצעות רצועות מגיב (באייר Diastix) על פי הוראות היצרן. עכברים עם שתי ברציפות אוריןקריאות סוכר E&gt; 250 מ&quot;ג / ד&quot;ל נחשבות סוכרתית. </li></ol>

<ol>
	<li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+of+a+non-obese,+diabetic+strain+of+mice.">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li><li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+etiology,+immunology,+and+therapeutic+strategies.">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li><li>Delovitch, T. L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonobese+diabetic+mouse+as+a+model+of+autoimmune+diabetes:+immune+dysregulation+gets+the+NOD.">The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD.</a> Immunity. 7, 727-738 (1997).</li><li>Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+autoimmune+diabetes+mellitus+with+splenocytes+from+nonobese+diabetic+(NOD)+mice.">Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice.</a> Diabetes. 35, 855-860 (1986).</li><li>Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syngeneic+transfer+of+autoimmune+diabetes+from+diabetic+NOD+mice+to+healthy+neonates.+Requirement+for+both+L3T4++and+Lyt-2++T+cells.">Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells.</a> J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).</li><li>Haskins, K., McDuffie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+diabetes+in+young+NOD+mice+with+a+CD4++islet-specific+T+cell+clone.">Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone.</a> Science. 249, 1433-1436 (1990).</li><li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid/scid+mice.+Relative+contributions+of+CD4++and+CD8++T-cells+from+diabetic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy-1a+donors.">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors.</a> Diabetes. 42, 44-55 (1993).</li><li>Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+autoimmune+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse.</a> Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).</li><li>Serreze, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8++cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice.">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li><li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+maintenance,+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines/clones+from+the+nonobese+diabetic+mouse.">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li><li>Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+apoptosis+in+T+cell-mediated+autoimmune+diabetes.">Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).</li><li>Amrani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-independent+beta-cell+destruction+by+diabetogenic+CD8(+)+T+lymphocytes+in+transgenic+nonobese+diabetic+mice.">Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).</li><li>Dobbs, C., Haskins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+T+cell+clone+and+of+T+cells+from+a+TCR+transgenic+mouse:+TCR+transgenic+T+cells+specific+for+self-antigen+are+atypical.">Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical.</a> J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).</li><li>Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphocyte+clone+specific+for+pancreatic+islet+antigen.">T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen.</a> Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).</li><li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis.">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogranin+A+is+an+autoantigen+in+type+1+diabetes.">Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes.</a> Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).</li><li>Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pinpointing+when+T+cell+costimulatory+receptor+CTLA-4+must+be+engaged+to+dampen+diabetogenic+T+cells.">Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes.">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).</li><li>Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-dependent+regulatory+circuits+in+immune+inflammation+highlighted+in+diabetes.">IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes.</a> J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).</li><li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD/LtSz-scid+mice.">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li><li>Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autoimmune+diabetes+locus+Idd9+regulates+development+of+type+1+diabetes+by+affecting+the+homing+of+islet-specific+T+cells.">The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells.</a> J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).</li><li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice.">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li><li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4++Foxp3++cells+in+BDC2.5NOD+mice.">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li><li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonobese+diabetic+scid+mouse:+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency.">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li></ol>

כל העכברים שוכנו בפן סטייט קולג&#39; למתקן נטול הפתוגן ספציפי רפואה (SPF) בהתאם להנחיות של הטיפול בבעלי החיים המוסדיים פן סטייט והשתמש בועדה. החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יכול להיגרם T1D בעכברי נמען ביעילות משתנה על ידי העברת מאמצת של תאים שלמים טחול או תת תאי T מעכברי NOD סוכרתיים או עכברים מהונדסים לTCRs נגזר משיבוטי תא T diabetogenic. אנו מדווחים בזאת שיטה לשחזור כדי לגרום T1D בעכברי נמען בתוך שבועיים ב -100% שכיחות ידי העברת CD62L + BDC2.5 CD4 מהונדס FACS המטוהר + T תאים לעכברים NOD.SCID. יתרונות ספציפיים של מודל העברת תא T BDC2.5 מתואר כאן כוללים האינדוקציה זמן הקצר מאוד של T1D השוואה לחודשים לסוכרת ספונטנית ועד למספר שבועות להעברת מחלת סוכרת על ידי תת תא T diabetogenic או שיבוטים תא T. בנוסף, בשל ההומוגניות שלהם, רק מספר קטן של מטוהר BDC2.5 תאי T מהונדס נדרשים להעביר T1D ביעילות ובעקביות גבוהות. בניגוד לשיטות אחרות תא T העברה, בהפעלה במבחנה של תאי T מהונדסים BDC2.5 לפני transfer אין צורך בפרוטוקול שלנו. יתרון נוסף של שיטת העברת תא T monospecific שלנו הוא שאסטרטגיות טיפוליות החדשניות להתערב בביות של תא T אנטיגן הספציפי לאיון לאיבר המטרה יכול להיחקר באופן סלקטיבי יותר מאשר עם פרוטוקולים אחרים שסוכרת העברה עם אוכלוסיות תאי T הטרוגניים. הגבלת פוטנציאל של השיטה שלנו היא שזה לא מתאים על מנת לקבוע את התרומה של CD4 + וCD8 + תת תאי T בפתוגנזה T1D משום סוג CD4 monospecific, diabetogenic + T תאים המשמשים להעברת מחלת סוכרת. בהעדר מכשיר FACS, BDC2.5 תאי T מהונדס עשויים להיות מבודדים על ידי עמודה לטיהור באמצעות PE-כותרתו אנטי TCR Vβ4 מב וחרוזים מגנטיים אנטי PE ואחריו מסוג CD4 + + CD62L חרוזים מגנטיים (Miltenyi). יצוין כי FACS-מטוהר, כמו גם עמודה מטוהרת-תאי T, יכלול אוכלוסייה קטנה של תאי T מסוג CD4 + הבאינו מבטא TCR המהונדס בשל הדרת allelic שלמה של גני אנדוגניים TCR 15. שבריר תא T המטוהר עשוי לכלול גם CD4 + CD25 + תאי Treg שעלולה לדכא את התפתחות T1D בנמענים. מאז כבר דיווחו שתי אוכלוסיות תאי T כדי להגדיל בBDC2.5 עכברים עם גיל, אנו ממליצים להשתמש BDC2.5 עכברים, כי הם לא יותר מאשר 6 שבועות 22,23. סוג CD4 + לחלופין ניתן לשלול CD25 + תאי Treg מBDC2.5 תאי T על ידי FACS-מיון או הפרדה עם סוג CD4 + CD25 + חרוזים מגנטיים (Miltenyi) בBDC2.5 עכברים מבוגרים. לחלופין, או בנוסף לניטור T1D על ידי מדידות סוכר בשתן, ניתן לקבוע רמות הגלוקוז בדם באופן מדויק יותר בעכברי נמען באמצעות Glucometer כף יד. צעדים קריטיים בתוך פרוטוקול זה כוללים את גיל BDC2.5 התורם ועכברי נמען NOD.SCID. שימוש BDC2.5 עכברים צעירים (6 שבועות) יבטיח כי הם נטולי סוכרת וכי התדירות של שניהם enתאי T שאינם מהונדסים dogenous ותאי Treg נמוכים, כפי שציין לעיל. כמו כן, חשוב להשתמש בעכברי NOD.SCID צעירים (&lt;12 שבועות) כעכברי נמען כי זן זה הוא נוטה לפתח thymomas שבאים לידי ביטוי לאחר 20 שבועות של גיל 24 ועלולים לבלבל את פיתוח T1D בעקבות העברת תא T מאמצת. יישומים עתידיים של השיטה המתוארת בחקירה כוללים מסוג CD4 T מנגנוני תא בתיווך של פתוגנזה T1D ואסטרטגיות חדשות כדי להתערב באופן סלקטיבי באינדוקצית מחלה, אשר אינה אפשרי בבני אדם.

עכבר NOD מפתחת סוכרת אוטואימונית באופן ספונטני וכבר בשימוש נרחב כמודל חיה ל1,2 T1D האנושי. פתוגנזה של T1D בעכברי NOD מאופיינת בחדירה, החל משעת 3-4 שבועות של גיל, של איי הלבלב לנגרהנס על ידי תאי דנדריטים ומקרופגים, ואחריו T ותאי B. שלב זה של הלא הרסני פרי insulitis מוביל להרס איטי, הדרגתי של תאי β בלבלב, ייצור אינסולין, וכתוצאה מהסוכרת גלויה על ידי 4-6 חודשים של גיל 3. העברת splenocytes 4,5, מסוג CD4 + 6,7 או CD8 + 8,9 תאי T מעכברי NOD סוכרתיים הוכחו לתווך סוכרת בעכברי NOD חיסון, מצביע על כך שתאי T איון-reactive לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה T1D. בהתאם לתנאי הניסוי, פיתחה סוכרת בעכברי נמען לאט, במשך מספר שבועות במחקרים אלה. באופן דומה, שיבוטים תא T שונים, שהופקו על ידי זמן רב ויקרהculturing של תאי T diabetogenic, דווח לתווך סוכרת מספר שבועות לאחר העברה לעכברים נמען 7,10. עם הזמינות של עכברים הטרנסגניים לבטא TCRs נגזר מסוג CD4-או שיבוטים תא T diabetogenic CD8 מוגבלים, מספר מעבדות שלאחר מכן הראה כי תאי T טחול מעכברים כאלה היו מסוגלים להעביר את הסוכרת לנמענים 11-13. באופן ספציפי, BDC2.5 עכברי NOD הם מהונדס לBDC2.5 TCR, שהוא ספציפי לchromogranin, חלבון בתאים בטא בלבלב 14-16. העברת בשלם או מופרדים תאי טחול בלתי פעילים מBDC2.5 עכברי גלוי סוכרת או סוכרת prediabetic הועברו לעכברים NOD ילוד או immunodeficient ביעילות משתנה 11,17-19 מבחנה המופעל או. אנו מתארים שיטה פשוטה שמנצלת מסוג CD4 + T מהונדס מטוהרים תאים מעכברי BDC2.5 טרום סוכרת לגרום T1D בעכברי נמען ביעילות וconsiste גבוהיםncy. מספר גדול של CD4 נאיבי, איון אנטיגן ספציפי + T תאים מבודדים מעכברים אלה על ידי מיון תא הקרינה המופעל (FACS) לסוג CD4 + CD62L + T תאים המבטאים את השרשרת המהונדס TCR Vβ4. מטוהרים תאי T מהונדסים מועברים לאחר מכן ללא הפעלה לעכברים NOD.SCID, אשר חוסר T תפקודי ותאי B ו-הם insulitis וסוכרת חופשי 20. את עכברי הנמען מנוטרים לריכוזים גבוהים של גלוקוז בשתן מעידים T1D, אשר מתפתח במהירות תוך שבועיים לאחר העברת תאי T. בניגוד לשיטות אחרות שיעביר תאי T diabetogenic עם ספציפיות הטרוגניים, הפרוטוקול שלנו משתמש FACS-ממוין CD4 + תאי T שכמעט אך ורק מבטאים את BDC2.5 TCR diabetogenic. בשל ההומוגניות שלהם, רק מספר קטן של תאי T שהועברו (~ 1x10 6 תאים / עכבר) נדרשים לפיתוח T1D מהיר בתוך 2 שבועות ב 100% פגיעה. יתרון נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא שirradiation של עכברי נמען אינו הכרחית כפי שהיא לכמה שיטות אחרות. הגבלת פוטנציאל של שיטה זו היא שהיא אינה מאפשרת חקירת התרומה של CD4 ו CD8 תת תאי T או תאי T CD8 במיוחד בסוכרת. הפרוטוקול המתואר יהיה שימושי לחקר התפתחות T1D מהיר, בתיווכו של נאיבי, מסוג CD4 + monospecific תאי T, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות להתערב בביות של תאי ה איון אנטיגן ספציפיים לאיבר המטרה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(Tcr&alpha;BDC 2.5, Tcr&beta;BDC 2.5)</td>
			<td>JAX</td>
			<td>004460</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J)</td>
			<td>JAX</td>
			<td>001303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
			<td>Themo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bayer Diastix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM2803</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical tweezers</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile small pair scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile large pair scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &mu;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &mu;m cell strainer cap tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlowTM sheath fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (APC) mAb</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005616</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TCR V&beta;4 (FITC) mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553365</td>
			<td>clone KT4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L (PE) mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553151</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat lamp</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-1&frac12; gauge needles (sterile)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27&frac12; gauge needles (sterile)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accelerated type 1 diabetes induction in mice by adoptive transfer of diabetogenic cd4+ t cells

סוכרתי עכבר nonobese (NOD) באופן ספונטני מתפתח סוכרת אוטואימונית לאחר 12 שבועות של גיל והוא מודל החיה נחקר רב ביותר מסוג אנושי סוכרת 1 (T1D). מחקרי תא העברה בעכברי נמען מוקרנים קבעו כי תאי T הם מרכזי בפתוגנזה T1D במודל זה. במסמך זה אנו מתארים שיטה פשוטה למהירות לגרום T1D ידי העברת מאמצת של מטוהרים, מסוג CD4 + T תאים ראשוניים מעכברי NOD טרום סוכרת מהונדסים לקולט איון הספציפי לתא T (TCR) BDC2.5 לעכברים נמען NOD.SCID. יתרונותיו העיקריים של טכניקה זו הם שבידוד והעברת מאמצת של תאי T diabetogenic יכולה להסתיים בתוך באותו היום, קרינה מהמקבלים אינה נדרשת, ושכיחות גבוהה של T1D הוא הושרה בתוך 2 שבועות לאחר העברת תאי T. כך, מחקרים של הפתוגנזה והתערבויות טיפוליות בT1D יכולים להמשיך בקצב מהיר יותר מאשר עם שיטות המסתמכות על אוכלוסיות תאי T הטרוגניים או שיבוטיםנגזר מעכברי NOD סוכרתיים.

התוצאות שלנו מראות את הבידוד של תאים מהונדסים המבטאים BDC2.5 CD62L, שהוא קריטי לתאי T לבית לאיברים משניים הלימפה, כגון בלוטות לימפה בלבלב. הממצאים שלנו עוד יותר להפגין את היכולת חזקה של אוכלוסיית תאי T monospecific זה כדי להעביר במהירות וביעילות T1D לעכברים נמען NOD.SCID. בידוד של CD4 + T תאי diabetogenic מBDC2.5 עכברים מוצג באיור 2. כ 5 10 x 7 תאים מטחול ובלוטות לימפה ונקווה התקבלו לכל עכבר תורם לפני מיון תא. בעקבות מעין זרימת cytometric, ~ 2.5 x 10 6 מסוג CD4 + T המהונדס נאיבי תאים (מסוג CD4 + + TCR Vβ4 CD62L +) התקבלו מכל עכבר תורם BDC2.5 על ידי שימוש באסטרטגית gating שצוינה. כצפוי העברת מאמצת, של מספר קטן של סוג CD4 + + TCR Vβ4 CD62L + תאים (~ 1 x 10 6 תאים / עכבר) מBDC2.5 עכברים תורמים מושרה T1D בכל מחדש NOD.SCID<html> cipients (שכיחות% 100) על ידי 11 יום, כפי שנקבע על ידי רמות גבוהות של גלוקוז בשתן (איור 3). לשם השוואה, העברת הטרוגנית CD3 + BDC2.5 תאי T נדרשים 3-5 תאים יותר לקפל לגרום T1D במקבלי NOD.SCID 80% ב -3 שבועות 21. נתונים אלה מראים כי העברת מאמצת של מספר קטן של FACS המטוהר BDC2.5 CD4 + תאים מהונדסים CD62L + T לעכברי NOD.SCID המושרה T1D יותר במהירות וביעילות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50389/50389fig1.jpg" /> איור 1. רצף של אירועים ניסיוניים. טחול ובלוטות לימפה נאספו מBDC2.5 עכברים. סוג CD4 + T המהונדס נאיבי תאים (מסוג CD4 + + TCR Vβ4 CD62L +) היה מבודד על ידי FACS. תאי T שמחדש תלויים PBS ומוזרק לוריד למקבלי NOD.SCID, אשר נכללו במעקב לאחר מכן לגלוקוז שתן הגבוה המציין T1D. NT &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50389/50389fig2.jpg" /> איור 2. אסטרטגית gating לסוג CD4 + מיון TCR Vβ4 + CD62L אנטי + טחול והלימפה תאי צומת נגזרים מBDC2.5 עכברים על ידי FACS. השעיה תא בודד של spleens אספו ובלוטות לימפה היה מוכתם בfluorescently שהכותרת אנטי CD4 (APC), -TCR Vβ4 (FITC), ומב אנטי CD62L (PE). עלילת הנקודה משמאל מראה את סוג CD4 + TCR Vβ4 + אוכלוסיית תא ששימש לשער התאים + CD62L, המוצגים בעלילת הנקודה הנכונה. תאים התאגרף מייצגים אחוזי אוכלוסיות תאים מגודרים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50389/50389fig3.jpg" /> איור 3. העברת מאמצת של CD4 + T תאי diabetogenic. FACS מבודד מסוג CD4 + TCR Vβ4 + + CD62L תאים מBDC2.5 עכברים הוזרקו דרך הווריד (1.3 x 10 6 תאים / עכבר) לעכברים נמען NOD.SCID (n = 5). עכברי werדואר במעקב במשך T1D על ידי מדידת ריכוזי הגלוקוז בשתן בנמענים. עכברים עם שתי קריאות רצופות של&gt; 250 מ&quot;ג / ד&quot;ל נחשבו סוכרתיים.

Watch this Scientific Journal Video about Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells at JoVE.com

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

אנו מספקים שיטת שחזור כדי לגרום לסוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים על ידי העברת המאמצת של CD4 איון אנטיגן ספציפי, העיקרי + T תאים.

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

accelerated-type-1-diabetes-induction-mice-adoptive-transfer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.6K Views.  Pennsylvania State University College of Medicine. אנו מספקים שיטת שחזור כדי לגרום לסוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים על ידי העברת המאמצת של CD4 איון אנטיגן ספציפי, העיקרי + T תאים.

Video: Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

הכנת CD4<sup&gt; +</sup&gt; T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

העברת סטיאוטטי המאמצת של תאים חיסוניים ציטוטוקסיות במודלים מאתר של האדם Orthotopic גליובלסטומה Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...