Die Autoren danken die Mitarbeitern der der Universitätsklinik Tierhaus (UTE) von Nantes für Tierhaltung und Pflege, die zelluläre und tissular imaging-zentrale Einrichtung der Universität Nantes (MicroPICell) für die Bildgebung und Zytometrie Anlage (Cytocell) von Nantes für ihre kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INSERM, CNRS Université de Nantes, Institut National du Cancer (Inka #PLBio2014-155), Ligue Nationale Contre le Cancer (AO interregionale 2017) und das Europäische Konsortium ERA-Net Transcan2 finanziert (Immunoglio). Das Team wird von der Fondation Pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118) finanziert. Diese Arbeit wurde im Rahmen des LabEX IGO realisiert und die IHU-Cesti-Programme, unterstützt von der nationalen Forschung Agentur Investissements Avenir über die Programme ANR-11-LABX-0016-01 und ANR-10-IBHU-005, bzw.. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Metropole und der Region Pays De La Loire unterstützt. Die Autoren danken für seine Hilfe bei der Korrektur des Manuskripts Chirine Rafia.

Die folgenden Verfahren mit tierischen Themen erfolgte nach institutionellen Richtlinien (Vereinbarung #00186.02; regionalen Ethik-Kommission der Pays De La Loire [Frankreich]). Menschlichen PBMCs wurden isoliert aus dem Blut von informierten gesunden Spendern (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankreich) gesammelt. Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
1. nicht-spezifische Erweiterung der zytotoxischen Effektor T-Lymphozyten
<ol><li>Bereiten und Feeder-Zellen bei 35 Gy zu bestrahlen. Die Stimulation von 2 x 105 - 4 x 105 Effektorzellen, Vorbereitung 10 x 106 PBMCs und 1 x 106 BLCLs von drei unterschiedliche, gesunden Spendern.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Feeder-Zellen und Effektorzellen in 15 mL RPMI ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten FCS, 2 mM L-Glutamin, (100 IE/mL), Penicillin und Streptomycin (0,1 µg/mL) und 300 IU/mL rekombinantes Il-2.</li>
	<li>PHA-L auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL hinzufügen, vorsichtig mischen und 150 µL Zellsuspension pro Bohrloch in 96-Well U-Boden Platten zu verteilen.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C und mit 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre.</li>
	<li>Täglich prüfen die Platte bis großzellige Form in den Kultur-Brunnen Klumpen (~ 7 Tage).</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in einer Kultur Kolben 1 x 106 Zellen/ml in frischem Nährmedium.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Anzahl der gesamten Zelle durch zählen (2 x pro Woche) und pflegen sie auf 1 x 106 Zellen/mL in frischem Nährmedium. Hinweis: Effektor Immunzellen soll für die therapeutische Verwaltung in einen Ruhezustand (in der Regel 3 Wochen nach anfänglichen Verstärkung Reiz) vorliegen. Die Reinheit und die Reaktivität dieser Effektor-Zellen sollten vor dem in-Vivo -Injektionen (z. B. in-vitro- Tests) überprüft werden.</li>
</ol>2. präoperative Effektor Zellen Vorbereitung
<ol><li>Nach der Überprüfung der Effektor-Zellzahl, sammeln Sie die Effektorzellen in ein 50-mL-Tube durch Zentrifugieren (300 X g für 5 min). Hinweis: Um den Verlust auszugleichen, bereiten Sie ein Übermaß an Zellen (z.B. 50 x 10-6).</li>
	<li>Sorgfältig entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 15 mL sterile PBS und Zentrifuge für 5 min bei 300 X g Wash durchzuführen.</li>
	<li>Sorgfältig und vollständig entfernen des Überstands und dann die Zelle Pellet in 1 mL sterile PBS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Die resuspendierte Zellen in einem 1,5 mL reaktionscup für Zentrifugation bei 300 X g für 5 min zu übertragen.</li>
	<li>Sorgfältig und vollständig entfernen des Überstands durch pipettieren langsam.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 8 µL steriler PBS per Mausklick. Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt.</li>
	<li>Messen Sie das Volumen der Zellsuspension mithilfe einer Mikropipette. Ggf. sterile PBS (20 x 106 Zellen in 15 µL PBS pro Dosis) hinzufügen und vorsichtig umrühren.</li>
	<li>Überprüfen Sie, mit einer Mikropipette, das ist das Endvolumen per Mausklick zwischen 15 und 20 μl (Imperativ < 20 µL).</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen auf Eis bis Stereotaktische Injektion. Hinweis: mehr als 3 h Zeitpunkte wurden nicht getestet.</li>
</ol>(3) Stereotaktische Injektion
<ol><li>
Geräte-Setup
	<ol>
<li>Montieren und einen kleinen Tieren stereotaktischen Rahmen entsprechend den Anweisungen des Herstellers für die Richtigkeit der intrakraniellen Injektionen (z.B., Spritze Größe, gewünschte Lautstärke und Geschwindigkeit der Injektion) zu kalibrieren. Hinweis: Eine langsame Infusionsrate wird (d.h.2-3 µL/min) empfohlen.</li>
		<li>Installieren Sie das Material unter einer mikrobiellen Sicherheitsschrank (MSC), um die Sterilität der Instrumente zu erhalten und die Mäusen zu schützen vor Infektionen. Hinweis: statt "Isothermen Blöcke" in einem Wasserbad bei 37 ° C. Dieses System schränkt die Unterkühlung von Mäusen während der Operation. Heizkissen, die für die Post-prozessualen Pflege notwendig sind, muss während die kontinuierliche Temperaturüberwachung verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Präoperative Vorbereitung der Tiere
	<ol>
<li>Eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (10 mg/mL) und Xylazin (0,1 mg/mL) 10 µL/g Körpergewicht von der Maus zu betäuben.</li>
		<li>Führen Sie eine Zehe kneiftest um die komplette Anästhesie und Analgesie des Tieres sicherzustellen. Hinweis: Jede Bewegung ist ein Hinweis auf nicht-tief Analgesie und in diesem Fall ein paar Minuten sind erforderlich, bevor der Vorgang zu wiederholen.</li>
		<li>Sobald die Maus richtig betäubt ist, mit einer Schere um das Fell aus der Operationsstelle (zwischen den beiden Ohren, bis die Nase) zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Präoperative Handy Vorbereitung
	<ol>
<li>Aufschwemmen Sie die Zellen mit einer Pipette sorgfältig (mehrmals) vor jeder Injektion einer beliebigen Zelle Verklumpen zu verhindern.</li>
		<li>Zeichnen Sie sorgfältig die erforderlichen Zellvolumen der Aufhängung (15-20 µL) in der 22-G-Microsyringe, die Aspiration von Luftblasen zu vermeiden. Hinweis: Dieser Zelle be-Schritt in der Microsyringe ist wichtig, Abweichungen in der injizierten Volumina zu minimieren. Laden Sie Zellen für jede einzelne Injektion zwischen Verfahren, jede Zelle Verklumpen zu verhindern und eine gerade Anzahl von Effektor Zellen Verwaltung in der Kohorte zu gewährleisten.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze in die angepasste Spritzenpumpe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verfahrenstechnische Betreuung
	<ol>
<li>Desinfizieren der Operationsstelle mit Tupfer getränkt in 5 % Povidon-Jod-Lösung mindestens 3 X.</li>
		<li>Legen Sie eine Schmier ophthalmologische Salbe in der Maus Augen zu verhindern jede Austrocknen der Hornhaut.</li>
		<li>Position der narkotisierten Maus auf der Stereotaktische Rahmen auf einem warmen Isothermen Block bedeckt mit einer sterilen Plastikfolie zu halten die Maus Temperatur während der Operation und die Sterblichkeit zu begrenzen. Hinweis: Der Maus Nase und Zähne sollten angemessen über die Zahn-Bar, um angemessene Atemfluss während des Verfahrens zu gewährleisten positioniert werden.</li>
		<li>Sobald die Maus über den Zahn Bar befindet, ziehen Sie das Ohr Bars fest unter der Maus Ohren um den Kopf zu immobilisieren. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht das Trommelfell beschädigen oder die Atmung beeinträchtigen.</li>
		<li>Machen Sie einen 1-2 cm Mittellinie sagittaler Hautschnitt mit einer sterilen Schere entlang der obere Teil des Schädels von Anterior Posterior des Schädels aussetzen.</li>
		<li>Identifizieren Sie den Schnittpunkt der sagittale und koronale Nähte (Bregma) als Wahrzeichen für die Stereotaktische Lokalisierung vor der Injektion (siehe Abbildung 1) zu dienen.</li>
		<li>Legen Sie die Microsyringe über diesen Punkt.</li>
		<li>Verschieben Sie die Microsyringe 2 mm rechts seitlichen und vorderen von der Bregma 0,5 mm.</li>
		<li>Mit einem Microdrill, machen Sie ein kleines Loch in den Schädel mit einem sterilen Bohrer an den vorgegebenen Koordinaten. Achten Sie darauf, um traumatische Verletzungen des Gehirns zu vermeiden oberflächlich bleiben. Hinweis: In diesem Protokoll wurden Immunzellen innerhalb einer etablierten Tumor (eine Woche nach Tumor Zelle Injektion) injiziert. Die Haut soll wiedereröffnet (Narbe) und die Injektion erfolgt an den gleichen Koordinaten verwendet für die Tumor-Zellen-Implantation (das Loch ist in der Regel bis zu 2 Wochen nach der Injektion noch vorhanden). Koordinaten wurden ausgewählt, für die Injektion Tumor und Effektor Zellen in das Gehirn Parenchym13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injektion von immun Effektorzellen
	<ol>
<li>Sorgfältig legen Sie die Microsyringe in das gebohrte Loch und bewegte sich langsam, die Nadel 3 mm nach unten in die Dura und dann rückwärts 0,5 mm bis zu einer endgültigen Tiefe von 2,5 mm vor der Injektion der Effektorzellen zu übermitteln.</li>
		<li>Führen Sie die Effektor-Zelle-Injektion bei 2-3 µL/min und überwachen Sie die Mäuse entlang der Einspritzzeit.</li>
		<li>Nach die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel heraus für nur 1 mm und bewahren Sie die Microsyringe für eine weitere Minute, bevor langsam zurückziehen vollständig Microsyringe, um eine Leckage aus der Infusionsstelle zu verhindern. Hinweis: Nach dem Entfernen des Tieres aus dem stereotaktischen Gerät, sofort reinigen Sie die einspritzausrüstung für zukünftige Experimente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nachbetreuung und Follow-up von Maus
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Tier aus der Stereotaktische Rahmen und sofort übernehmen Sie Povidon-Jod 5 % Lösung auf die Schnitt-Website und schließen Sie die Haut mit einer geeigneten chirurgischen Naht.</li>
		<li>2 % Lidocain Gel direkt auf die Wunde auftragen und 0,15 µg/g von Buprenorphin durch eine subkutane Injektion für Post-prozedurale Analgesie zu verwalten.</li>
		<li>Platz zurück gesetzt die narkotisierten Maus zu seinem Käfig oben ein Heizkissen auf 37 ° C, eine geeignete Maus Körpertemperatur aufrechtzuerhalten und eine Unterkühlung zu vermeiden. Hinweis: Separates Gehäuse ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Überwachen Sie die Maus, bis es vollständig aus der Narkose erholt ist und in einem Gehäuse Raum übertragen. Hinweis: Bisher ist dieses Protokoll gut unterstützt, wie einige unvorhersehbare Komplikationen (< 5 % der injizierten Mäusen) aufgetreten sind.</li>
		<li>Täglich überwachen Sie die Mäuse zu und einschläfern sie, wenn Anzeichen für abnehmende Gesundheit eingehalten werden (z.B., Buckliger Haltung, eingeschränkter Mobilität, Erschöpfung oder bedeutenden Gewichtsabnahme [≥ 15 %]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stupp, R., Roila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+ESMO+clinical+recommendations+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).</li><li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet?.">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet?.</a> Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).</li><li>Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+brain+tumors:+regression+of+experimental+gliomas+by+adenovirus-mediated+gene+transfer+in+vivo.">Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).</li><li>Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Cellular+Therapies+for+Glioblastoma+Multiforme.">Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme.</a> Cureus. 10 (3), e2305 (2018).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+Therapy+of+Glioblastoma+in+a+Mouse+Model+Using+Exosomes+Derived+From+Natural+Killer+Cells.">Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).</li><li>Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+hope+in+immunotherapy+for+malignant+gliomas:+adoptive+T+cell+transfer+therapy.">A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).</li><li>Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+cellular+immunotherapy+for+patients+with+glioblastoma.">Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma.</a> Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+administrations+of+allogeneic+human+Vgamma9Vdelta2+T+cells+efficiently+control+the+development+of+human+glioblastoma+brain+tumors.">Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors.</a> Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).</li><li>Dutoit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+glioblastoma+peptidome+to+discover+novel+tumour-associated+antigens+for+immunotherapy.">Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy.</a> Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).</li><li>Joalland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-21+Increases+the+Reactivity+of+Allogeneic+Human+Vgamma9Vdelta2+T+Cells+Against+Primary+Glioblastoma+Tumors.">IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors.</a> Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).</li><li>Clemenceau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+alphabeta+T+lymphocytes+can+express+FcgammaRIIIa+and+mediate+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).</li><li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas.">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).</li><li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+depletion+followed+by+intracerebral+CpG-ODN+injection+induce+brain+tumor+rejection.">Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection.</a> Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).</li><li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer.">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li><li>Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T+cell+therapy:+An+overview+of+obstacles+and+opportunities.">Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities.</a> Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).</li><li>Bryant, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+immunotherapeutic+potential+of+gammadelta+T-cells+in+patients+with+glioblastoma.">Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).</li><li>Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+of+allogeneic+innate+lymphocyte+therapy+for+glioma+patients+with+prior+cranial+irradiation.">The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).</li><li>Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+responses+of+the+central+nervous+system.">Innate and adaptive immune responses of the central nervous system.</a> Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+sustained+delivery+of+5-fluorouracil+from+biodegradable+microspheres+for+the+radiosensitization+of+glioblastoma:+a+pilot+study.">Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study.</a> Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).</li><li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+implantation+of+5-fluorouracil-releasing+microspheres+in+malignant+glioma.">Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma.</a> Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).</li><li>Salot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expansion+of+gamma+9+delta+2+T+lymphocytes:+Innacell+gamma+delta+cell+therapy+product.">Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product.</a> Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).</li><li>Bennouna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase-I+study+of+Innacell+gammadelta,+an+autologous+cell-therapy+product+highly+enriched+in+gamma9delta2+T+lymphocytes,+in+combination+with+IL-2,+in+patients+with+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Eine adoptive Übertragung von ausgewählten einheimischen oder veränderter immun Effektorzellen stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von Tumoren, wie z. B. infiltrative Gehirntumoren, kümmert sich der Begrenzung der Reaktivität gegen nicht-transformierten Zellen15effizient, 16,17,18. Das zentrale Nervensystem, das Gehirn umfasst, hat jedoch eine besondere Immunstatus, insbesondere auf Grund der Existenz der Blut - Hirn-Schranke und das Fehlen eines klassischen Lymphdrainage System19,20. Diese physiologischen Funktionen beeinflussen Gewebe Handel und systemischen Injektionen von Immunzellen beeinträchtigen könnte. Um diese Hindernisse zu überwinden, wurden Intraparenchymal Injektionen auf dem Prinzip untersucht, die Antitumor-Zellen eher lokal geliefert werden, eng auf die Tumor-Website für Mikrosphären, die pharmakologischen Verbindungen21, enthalten 22. auf der einen Seite könnte die begrenzte Verdünnung von Lymphozyten innerhalb der Orgel ihre Antitumor-Effizienz zu verbessern, aber es kann auch mechanisch oder Tumor Anpassung schädlich, wie tissular-Komprimierung, die sich entlang Gehirn entwickelt verstärken Tumorwachstum. Dies bedeutet, dass dieses Verfahren kleine Mengen an immuntherapeutischen Injektionen erfordert. Dieses Problem ist noch kritischer in experimentellen Tiermodellen in welche, die Gehirn Tumoren chirurgisch herausgeschnitten werden können nicht. Dieser Artikel beschreibt einen therapeutischen Ansatz für die Vorbereitung und die lokale Übermittlung von Gehirn Tumor-spezifische zelluläre Effektoren, basierend auf Stereotaktische Injection(s) von allogenen menschlichen T-Lymphozyten.
Diese Studie zeigt die Vorbereitung und der stereotaktischen Lieferung von allogenen menschlichen Vϒ9Vδ2 T-Lymphozyten in immungeschwächte NSG Mäuse mit menschlichen GBM Xenotransplantate. Die erste Phase dieses Protokolls beschreibt ein einfaches Verfahren zur Verstärkung der allogenen T-Lymphozyten von PBMCs von gesunden Spendern, unter Verwendung einer standard unspezifischen PHA-Feeder-IL2-Stimulation, die große Mengen von reinem Effektor T-Lymphozyten produziert, so dass Ihre therapeutische Nutzung23,24. Der zweite Teil dieser Artikel konzentriert sich auf die Vorbereitung der T-Lymphozyten Suspensionen auf den Tag der stereotaktischen Verwaltung ruht. Ein besonderes Augenmerk wurde auf diesen wichtigen Schritt, die eine hohe zellulare Dichte erfordert, die die Lebensfähigkeit und die Funktion der ausgewählten Effektor T-Lymphozyten nicht beeinflussen sollte. Schließlich zur in-Vivo -Experimente, die Vorbereitung der Effektor T-Lymphozyten und ihre Injektion in den Tumor-Kern ist mit ihrer Verbreitung, nicht nur innerhalb der Tumor aber auch in den umliegenden Hirngewebe, Hervorhebung ihrer besondere Fähigkeit zu patrouillieren und invasive Tumorzellen zu verfolgen. Wichtig ist, bleibt diese Vorbereitung und Injektion Methoden die Möglichkeit diese T-Lymphozyten innerhalb des Gehirns auf eine besondere Anerkennung der Gehirn-Tumor-Zellen aktiviert werden. Insgesamt diese überzeugendsten Eigenschaften speziell die Fähigkeit der T-Lymphozyten zu gewährleisten und effizient gezielt zu beseitigen tief infiltrative Gehirn-Tumor-Zellen sind ein Markenzeichen der GBM25. Der Hinweis eine besondere Vorsicht ist während der Injektion und die Entfernung von der Microsyringe getroffen werden, um jede Läsion des Gehirns zu minimieren oder Effektor Zellen leckt.
Dieser Artikel beschreibt zusammenfassend ein effizientes Verfahren für die Bereitstellung von großen Mengen von allogenen menschlichen Anti-Tumor-Lymphozyten, z. B. ruhenden menschliche Vϒ9Vδ2T Lymphozyten in der Nähe von Hirntumoren. Wichtig ist, wird dieses therapeutische Verfahren nicht mit negativen Auswirkungen auf die übertragenen T-Lymphozyten (z.B., Rentabilität, Reaktivität) oder auf das Hirngewebe begleitet. Neuere Studien, basierend auf murinen orthotopen Modelle der primären menschlichen GBM haben gezeigt, dass Vϒ9Vδ2T Lymphozyten Ziel effizient GBM-Zellen, einschließlich Tumorzellen, die tief das Gehirn Parenchym9,11infiltriert haben. Diese Elemente eröffnen Chancen für die Entwicklung neuartiger Adoptiv T-Lymphozyten Beförderungsverfahren, die angewendet werden könnten in erster Linie bei Mäusen mit orthotopen Hirntumoren und dann in klinischen Studien bei GBM-Patienten.

Glioblastom (WHO Grad IV Astrozytom), ist die häufigste und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen. Trotz der aggressiven Behandlungen, die Operation und Radio-Chemotherapie zu kombinieren, bleibt GBM eine extrem schlechte Prognose (mediane Überlebenszeit von 14,6 Monate und eine 2-Jahres-Mortalität > 73 %)1zugeordnet. Dies beweist, dass einige effiziente therapeutische Fortschritte in den letzten zehn Jahren2validiert worden sind. Unter den Kandidaten für die Gestaltung effektiver Therapiestrategien3,4,5werden Immuntherapien6 derzeit untersucht, um zu verfolgen und zu beseitigen sehr invasiv und Radio/Chemotherapie-resistenten tumor Zellen, für ihren wichtigen Beitrag zur schnellen und tödlichen Tumor Rezidiv7vermutet. Verschiedene mögliche immunologische Ziele wurden identifiziert und vorgeschlagenen für Immuntherapien, mit natürlichen oder modifizierten αβ oder ϒδ T-Lymphozyten wie GBM-spezifischen Tumorantigenen oder Stress-induzierte Moleküle8,9, 10. Die Möglichkeit, ausgewählte GBM-reaktive Immunzelle Effektoren verwalten stellt eine einzigartige Gelegenheit, erhöhte Mengen von Effektor Lymphozyten direkt in die Website der verbleibenden Bösartigkeit zu liefern. Um diese Strategie zu unterstützen, haben wir vor kurzem gezeigt, dass Modelle basierend auf immungeschwächte Mäuse orthotopen primären menschlichen GBM Xenotransplantate treu tragen die Entwicklung von Hirntumoren in GBM Patienten9,11rekapitulieren. Darüber hinaus wurden diese Modelle verwendet, um die starke Antitumor-Effizienz der adoptively übertragenen allogene menschlichen Vϒ9Vδ2T Lymphozyten zeigen.
Dieses Protokoll beschreibt die kritische experimentellen Schritte zur Erreichung Stereotaktische Immuntherapien von Hirntumoren, wie GBM, basierend auf die Adoptiveltern Übertragung der allogenen T-Lymphozyten. Der Artikel zeigt: (i) die Verstärkung der therapeutischen allogene immun Effektor T-Lymphozyten, wie menschliche Vϒ9Vδ2T Lymphozyten; (Ii) die Vorbereitung dieser Effektor T-Lymphozyten zur Injektion; (Iii) das Verfahren für die Stereotaktische Verwaltung innerhalb des Gehirns, in der Nähe des Tumors. Dieser Artikel enthält auch einen Einblick in das Verhalten von diese zellulären Effektoren nach Stereotaktische Injektion.
Der hier vorgestellte Therapieansatz basiert auf die Injektion von 20 x 106 Effektor Zellen pro Dosis für jedes Gehirn Tumor-tragenden immungeschwächte Maus. Ein erste in-vitro- Erweiterung Schritt ist erforderlich, große Mengen von Immunzellen produzieren. Daher unspezifische Zelle Erweiterungen werden mit Phytohemagglutinin (PHA-L) durchgeführt und allogene Feeder-Zellen bestrahlt: Blut-peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) von gesunden Spendern und Epstein-Barr-Virus EBV-transformierten B-Lymphoblastoid Zelle Linien (BLCLs), abgeleitet von PBMCs durch in-vitro- Infektion mit EBV-haltigen Kultur überstand von der Marmoset B95-8-Zell-Linie, im Beisein von 1 µg/mL Cyclosporin-A.
GBM-reaktive Effektor Immunzellen verglichen und von in-vitro- Assays9ausgewählt. Diese Effektorzellen werden aktiviert und verstärkt mit standard-Protokolle, nach ihrer Natur (z.B., menschliche Vγ9Vδ2 T-Lymphozyten-9 oder menschliche Anti-Herpes-Virus αβ T-Lymphozyten12) mit einer Mindestreinheit von > 80 %, wie routinemäßig von durchflusszytometrischen Analyse überprüft. Die Zelle Erweiterung Verfahren unten gilt für verschiedene menschliche Lymphozyten-Teilmengen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PBMCs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:232px;">from 3 different healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BLCLs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>from 3 different donors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">FCS</td>
			<td style="width:136px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">IL-2</td>
			<td style="width:136px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;">proleukin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PHA-L</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Mouse adaptator for stereotaxic frame&#160;&#160;</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">51624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microsyringe pump injector&#160;</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoFil Syringe</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">NF34BV-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">NSG mice</td>
			<td style="width:136px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">NSGSSFE07S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Ketamine</td>
			<td style="width:136px;">Merial</td>
			<td style="width:119px;">Imalg&#232;ne 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylazine</td>
			<td style="width:136px;">Bayer</td>
			<td style="width:119px;">Rompur 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Scissors</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">201758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Forceps</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OmniDrill 115/230V</td>
			<td style="width:136px;">WPI</td>
			<td align="right">503598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Vicryl 4-0</td>
			<td style="width:136px;">Ethicon</td>
			<td>VCP397H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylocaine</td>
			<td style="width:136px;">Astrazeneca</td>
			<td>3634461</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic adoptive transfer of cytotoxic immune cells in murine models of orthotopic human glioblastoma multiforme xenografts

Glioblastoma Multiforme (GBM), der häufigsten und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen, ist in der Regel verbunden mit einer schlechten Prognose und knappen effiziente Therapien wurden in den letzten zehn Jahren vorgeschlagen. Unter den vielversprechenden Kandidaten für neue therapeutische Strategien zu entwerfen zelluläre Immuntherapien haben sehr invasive Beseitigung gezielt und Chemo-radioresistenten Tumorzellen, wahrscheinlich in eine schnelle und tödliche Rückfall dieses Krebses beteiligt. So Zwecke der allogenen GBM-reaktive Immunzelle Effektoren, wie menschliche Vϒ9Vδ2 T-Lymphozyten, in der Nähe des Tumors würde stellt eine einzigartige Gelegenheit, effizient zu liefern und hochkonzentrierten therapeutischer Wirkstoffe direkt in die Website des Gehirns Malignome. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine präklinischen Proof-of-Concept für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von diesen zellulären Immuntherapien, die Stereotaktische Injektion von allogenen menschlichen Lymphozyten innerhalb Intrabrain Tumor Betten abhängen.

Diese Studie beschreibt die Strategie der Adoptiveltern Übertragungen von zellulären immun Effektorzellen in das Gehirn von Tumor-tragenden Mäusen, basierend auf Stereotaktische Injektionen direkt in das tumorbett durchgeführt.
Um jedes Risiko von Hirn-Trauma, verbunden mit einem großen Injektionsvolumen zu minimieren, muss die Zellsuspension Effektor (20 x 106 Zellen in 15-20 µL PBS) konzentriert werden. Um zu überprüfen, ob dieser Zelle Konzentration Schritt die Lebensfähigkeit der Effektorzellen beeinflussen könnten, wurden diese Zellen nach dem beschriebenen Protokoll vorbereitet und in die Microsyringe geladen. Die Effektorzellen wurden sofort oder 10 min nach dem Laden sie in der Microsyringe gesammelt. Die Zellen waren voller Flecken mit Propidium Jodid (PI), einen fluoreszierenden DNA intercalating Agenten, die nicht permeationsfähigen Zellen Leben und analysierten durch Durchflusszytometrie an verschiedenen Zeitpunkten (0, 24 und 72 Stunden). Die Ergebnisse zeigen, dass die Vorbereitung und das Laden in der Microsyringe nicht deutlich die Lebensfähigkeit der Effektorzellen für mindestens 24 Stunden (Abbildung 2A und 2 b) beeinträchtigen. 72 Stunden wurde eine leichte, aber nicht signifikante Erhöhung der PIpositive Zellen (14 % im Vergleich zu 11 % entladenen Zellen) beobachtet. In ähnlicher Weise wurde die Antitumor-Reaktivität der Effektorzellen, die vorbereitet und gepflegt auf Eis für 3 Stunden wurden analysiert. Effektorzellen wurden mit Gehirn-Tumor-Zellen für 4 Stunden in Anwesenheit einer Anti-CD107a-MAB cocultured. Die Hochregulation der Aktivierung Markierung CD107a, ähnlich wie der Wert, der bei der Kontrolle zeigt, dass die Reaktivität der Effektorzellen nicht die Vorbereitung und das Laden in den Microsyringe (Abbildung 2 betroffen ist).
Um festzustellen, ob Effektorzellen überleben und bewegen sich in der Anwesenheit von nach ihrer Implantation Intra-Tumor, 20 x 106 Effektor wurden Zellen in der Tumor-Website von Mäusen mit einem Gehirntumor (Glioblastom-111) injiziert. Eine Woche später wurden die Gehirne, feste, geschnitten und gefärbt für Safran Hämatoxylin und Eosin Färbung (HES) und Anti-Human-CD3-mAb (IHC) gesammelt. HES Färbung identifiziert die Struktur von Hirntumoren (Abbildung 3, Links). Die CD3 Färbung identifiziert und lokalisiert die Effektor-immun-T-Lymphozyten (hier menschliche Vϒ9Vδ2 T-Zellen) (Abbildung 3, Rechts). Interessanterweise wurden Effektor-T-Lymphozyten rund um den Tumor (Abbildung 3, rechten oberen Bereich), in der Tumor-Kern (Abbildung 3, mittleren rechten Bereich), sondern auch in der kontralateralen Hemisphäre (Abbildung 3, erkannt unteren rechten Bereich). Darüber hinaus wurde die Funktion des menschlichen T-Lymphozyten isoliert aus dem Gehirn der Maus 48 Stunden nach der Injektion (4 x 106 αβ-T-Zellen), die 2 % der Gehirnzellen darstellen, analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass gesammelte Gehirn injiziert Effektor allogenen αβ T Zellen erweitern und vermehren sich auf eine unspezifische PHA-Feeder Zellen Aktivierung durchgeführt in Anwesenheit von IL-2 (Abbildung 4).
Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass Effektorzellen T vorbereitet und nach diesen Verfahren verwaltet stundenlang im Gehirn überleben und können innerhalb des Tumors und gesunden Hirngewebe patrouillieren. Diese Verfahren wurden für die Beurteilung der Antitumor-Effizienz der therapeutischen Stereotaktische Verwaltungen der allogenen menschliche ruhenden Vϒ9Vδ2 T-Zellen steuern die Entwicklung der menschlichen GBM Gehirn Tumoren9,11verwendet. Diese Studien belegen, dass Injektionen von allogenen menschlichen Effektor T-Lymphozyten in das tumorbett verbessert das Überleben von Mäusen mit Hirntumoren Interessanterweise überleben Mäuse nicht nachweisbare Tumorzellen, was darauf hindeutet, eine komplette Tumor Ablehnung führen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig1.jpg"> Abbildung 1 : Überblick über die wichtigsten anatomischen Landmarken auf den Maus-Schädel. Dazu zählen sagittale (rote Linie) und koronalen (blaue Linie) Nähte und deren Schnittmenge (Bregma) verwendet, der Injektionsstelle zu orientieren. Die Maßstabsleiste wird angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57870/57870fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig2.jpg"> Abbildung 2 : Überleben und Aktivierung der Effektor T-Lymphozyten vorbereitet. Effektorzellen (hier ruhenden menschlichen peripheren Vϒ9Vδ2 T-Zellen) wurden verstärkt und nach dem beschriebenen Verfahren vorbereitet. Färbung von Lymphozyten mit Propidium Jodid (PI), eine DNA verschuppen fluoreszierende Substanz, die nicht permeationsfähigen Leben Zellen und funktionelle Aktivierung ist wurden durchgeführt. (A) dieses Panel zeigt ein repräsentatives Grundstück nach vorne (FSC-H) im Vergleich zu Seite (SSC-H) streuen Anspritzung von Effektor Lymphozyten (Panel Links). Das Histogramm zeigt die PI Färbung des gated Kontrolle Lymphozyten (Rechts). Der Anteil derpositiven Lymphozyten PI wird angezeigt. (B) dieses Panel zeigt den prozentualen Anteil der Toten Lymphozyten (PIpositiv) sofort gesammelt (hellblaue Linie) oder nach 10 min (dunkelblaue Linie) in der Microsyringe, gemessen an den angegebenen Zeitpunkten. Als Kontrolle dienten entladene bereite Zellen (graue Linie). (n = 3; mittlere ± SD; ns = nicht signifikante.) (C) CD107a Oberfläche Mobilisierung, indem Durchflusszytometrie auf beiden Vδ2positive Kontrollzellen (unvorbereitet gemessen wurde) oder Lymphozyten gepflegt auf Eis (vorbereitete + 3 h) nach einer Coculture mit Zielzellen primäre Gehirn Tumor vorbereitet. Der Anteil der Lymphozyten wird in jedem Quadranten durchflusszytometrischen angegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57870/57870fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig3.jpg"> Abbildung 3 : Erkennung und Lokalisierung von Effektor T-Lymphozyten in das Gehirn des Tumor-tragenden Mäusen. Eine Woche nach Glioblastom brain Tumor Implantation, Effektor Immunzellen (hier ruhenden menschlichen peripheren Vϒ9Vδ2 T-Zellen) wurden in den Gehirnen der Mäuse injiziert. Eine Woche nach der Immuntherapie Behandlung wurden die Gehirne gesammelt, fixiert und geschnitten. Gehirn-Abschnitte wurden für immunhistochemische Analyse (Hämatoxylin Eosin und Safran [HES] Färbung) gefärbt (linken) oder gebeizt mit Anti-Human-CD3-Antikörper (Rechts). Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängigen Experimenten. Die Maßstabsleiste wird angezeigt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57870/57870fig4.jpg"> Abbildung 4 : Aktivierung von Effektor T-Lymphozyten gesammelt aus dem Gehirn der behandelten Mäuse. Ruhende menschlichen T-Lymphozyten (hier: 4 x 106 menschlichen αβ T-Lymphozyten) wurden in den Gehirnen der NSG Mäuse injiziert. Nach 48 Stunden wurden die Gehirne gesammelt und getrennt. Der Anteil des menschlichen Gehirns infiltrieren T-Lymphozyten wurde mittels Durchflusszytometrie mit einem Anti-Human-CD3-Antikörper (Bodenplatte) gemessen. Die gesammelten Zellen wurden (10 Zellen/na) in 96-Well U-Boden Platten und stimuliert (PHA-Feeder-Zellen und Il-2) für 20 Tage (16 Zyklen zu verdoppeln) ausgesät. Hinweis an Tag 10, 13,3 x 106 von menschlichen T-Lymphozyten stammen (Rechts).

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Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

stereotactic-adoptive-transfer-cytotoxic-immune-cells-murine-models

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Serie: Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.