We are indebted to Xuefei Yang, Sabine Both, Lin Chen and Kaitian Wang for coordinating the fieldwork and establishing the BEF-China experiment. We are also grateful to the whole BEF-China research group for their general support. BEF-China is mainly funded by the German Research Foundation (DFG FOR 891/1 and 2) and funding for this particular project was provided by the German Research Foundation to H.B. (DFG BR 1698/9-2). We are also thankful for the travel grants and summer schools financed by the Sino-German Centre for Research Promotion in Beijing (GZ 524, 592, 698, 699 and 785). In addition we would like to thank David Eichenberg, Michael Staab, Katja Grotius, Silvana Tornack, Lin Chen, and Shouren Zhang for their support in the field and in the lab.

1. stomatäre Leitfähigkeit <ol><li> Messungen der stomatäre Leitfähigkeit HINWEIS: Die benutzte eine einfache Art von stationären Porometer (Decagon SC1) Autoren. Die Porometer-Design hat den Vorteil der geringen Größe, intuitive manuelle Bedienung und hohe Zuverlässigkeit. Bei der Messung stomatäre Leitfähigkeit im Bereich, stellen Sie sicher, um den Abstand zwischen der gemessenen Individuen für eine wiederholte Messzyklus zu minimieren, die effizienteste möglich sein. </li><li> Wählen Blättern von verschiedenen Arten und Individuen nach einer reproduzierbaren Musters (gleiche Höhe, gleiche Exposition derselben Position innerhalb der Anlage, wenn möglich nur von dem gleichen Knoten und nur von einer Kategorie, Sonne und Schatten Blätter, etc.). <ol><li> Nur Maßnahme Blätter in gesunden, nicht beschädigt ist und voll entwickelten Zustand. Markieren die Blätter an den Personen (beispielsweise durch Kabelbinder oder Farbband), um sicherzustellen, dass die wiederholten Messungen werden auf dem gleichen Blatt gemacht. HINWEIS: Measurements der stomatäre Leitfähigkeit sollte nur auf Blattoberfläche vorgenommen werden, während die Vermeidung der Mittelrippe und starke Blattadern. </li><li> Starten Sie Messungen in den frühen Morgenstunden vor Sonnenaufgang unter fünf vor zehn Wiederholungsmessungen bis Stomata Leitwerte zeigt einen deutlichen Rückgang am Mittag. HINWEIS: Eine tägliche Verlauf der Messungen gute Daten für die Analyse der Beziehungen zwischen VPD und stomatäre Leitfähigkeit zu liefern. </li></ol></li><li> Vpd Messungen <ol><li> Mit jedem g S-Messung, Aufzeichnung Temperatur und relative Feuchtigkeit vorzugsweise mit tragbaren Logger, um die Bedingungen an der Position des gleichen Blatt direkt zu messen. Für die Berechnung der Dampfdruck Defizit verwenden Sie die August-Roche Magnus Formel 15. </li></ol></li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq1.jpg" width="300" /> E s = Sättigungswasserdampfdruck [hPa] <ol start="4"><li> Modell g S - VPD Antwort <ol><li> Jetzt Grundstück Arten weise alle g S Daten gegen VPD, die Kombination aller täglichen Kurse der einzelnen Blätter in einer Analyse pro Spezies. Entpacken Sie die für die Suche nach dem maximalen Wert aus den stomatäre Leitfähigkeit Daten beobachtet Maximalwert. So skalieren Sie das Modell für Arten weise Vergleichbarkeit, teilen die beobachteten Werte durch die für diese Spezies (g S / g SMAX) beobachtete Maximalwert. </li><li> Für jede Art, die zurückbilden Logits von g S (g S / g SMAX) bis VPD und dem quadratischen Term der VPD Verwendung eines verallgemeinerten linearen Modell mit einer binomischen Fehlerverteilung (a, b und c Regressionsparameter): </li></ol></li></ol><img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq2.jpg" width="300" /><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" wreite = &quot;700&quot; /&gt; Abbildung 1. Beispiel der aufgetragenen Werte und des angepassten Modells für g S -. VPD stomatäre Leitfähigkeit als Funktion der Dampfdruckdefizit für die Gattung Liquidambar formosana. Leere Punkte stellen die beobachteten Werte. (A) Maximale stomatäre Leitfähigkeit wurde die VPD bei maximaler stomatäre Leitfähigkeit und meine stomatäre Leitfähigkeit von der absoluten daher nicht skaliert stomatäre Leitfähigkeit (g S) Daten extrahiert. (B) Scaled stomatäre Leitfähigkeit Daten (g S / g SMAX) wurden aufgetragen, um die relativen Parameter zu extrahieren (wie gefüllte Punkte dargestellt) 20. Re-print mit Genehmigung aus 20. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig2highres.jpg" width = &quot;400&quot; /&gt; Abbildung 2. Alle Einbaumodelle für alle Arten. Modell Graphen für die stomatäre Leitfähigkeit Daten VPD Regression für alle Tierarten. Immergrünen Arten sind durch schwarze Linien, Laubbaumarten durch rote Linien 20 dargestellt. Re-Print mit Genehmigung aus 20. HINWEIS: Mit den Logits statt Regression g S direkt an VPD, führt zu dem Punkt, dass Höchstwerte modelliert weiß g SMAX nicht überschreitet und g S gegen 0 bei hohen VPD. <ol start="5"><li> Auszug Parameter der Spaltöffnungsregelung für jede Art <ol><li> Berechnen absolute modellierten g SMAX-Werte (MaxFit in 1B). Um dies zu tun, die Berechnung der VPD bei maximaler stomatäre Leitfähigkeit von der Einstellung der ersten Ableitung 1.4.2 auf Null, die VPD gsMaxFit = -b / 2a gibt. Legen VPD gsMaxFit in die Formel von 1.4.2 und anzuheben, um die Macht des E um MaxFit erhalten. Berechnen Sie die mean aller Leitfähigkeitsmessungen pro Art (siehe 1A). HINWEIS: Verwenden Sie Statistiksoftware R (http://www.r-project.org). </li><li> (1) stomatäre Leitfähigkeit und VPD am Maximum des Modells (MaxFit) und (2) VPD: Um relative Werte, von der skalierten Modells (g S / g SMAX), extrahieren stomatäre Leitfähigkeit und VPD Werte für die folgenden zwei Punkte berechnen an dem zweiten Wendepunkt der Kurve (siehe 1B). Multiplizieren Sie diese Werte von g SMAX um absolute g S-Werte für diese Punkte zu erhalten. Siehe Abbildung 2 für eine vollständige Überlagerung der einzelnen Modelle aller 39 Arten analysiert. </li></ol></li></ol> 2. Messungen der Stomata Traits <ol><li> Proben nehmen vorzugsweise genau den gleichen Blättern, die für die Messungen der Leitfähigkeit Stomata verwendet wurden. Wenn dies nicht möglich ist, gelten die gleichen Selektionsverfahren, das angewendet wurde, um die Blätter zu wählenfür die Spaltöffnungsleitfähigkeitsmessungen, vorzugsweise auf den gleichen Individuen. </li><li> Eine dünne Schicht aus farblosem, schnell trocknend Nagellack (Test verschiedener Marken, einige sind besser geeignet als andere), um einer frischen Probe. Werden die Proben nicht sofort verarbeitet werden, speichern sie in 70% igem Alkohol. Nach der Nagellack ausgetrocknet ist, vorsichtig schälen den Eindruck von dem Blatt und gehen für die mikroskopische Analyse, wie bei einem normalen Blattprobe. Hinweis: Im Fall von Blättern mit hoher Dichte trichome einem vorhergehenden Schritt des Aufbringens Natriumhydroxid oder eine 1: 1-Lösung von Essigsäure und Sauerstoff Peroxid zu besseren Ergebnissen führen. </li><li> Lichtmikroskop analytics <ol><li> Schließen Sie eine Kamera an einem optischen Mikroskop in der Lage Vergrößerungen zwischen 40X zu 400X. Nachdem die Kamera mit dem Mikroskop verbunden ist, passen Sie die Bilder zur optischen Vergrößerung und Auflösung des Bildes, zum Beispiel genommen, mit Hilfe einer Skala. </li><li> Verwendung Open Source image Verarbeitungssoftware wie ImageJ 16 analysiert diese Bilder. <ol><li> Zeichnen Sie eine Form mit der Form-Werkzeug aus der Bildanalyse-Tool auf das Bild in einem Gebiet ohne Schmutz, Daumen druckt, Schadstellen oder großen Blattadern. Zählen Spaltöffnungen in diesem Bereich und in der Summe von mindestens 50000 &amp; mgr; m 2 pro Probe. </li><li> Messen Sie Stomata Schutzzelle Länge und Porenlänge. Berechnen Sie die Anzahl der Spaltöffnungen pro mm 2. Berechnen stomatal Index als das Verhältnis der Dichte der Stomata auf die Zellzahl pro mm 2 epidermale. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Bewertung der Nervatur Traits HINWEIS: Für die Bestimmung der Blattader Züge, ein modifiziertes ein Protokoll von Sack &amp; Scoffoni 17 eingesetzt wurde. <ol><li> Probenvorbereitung HINWEIS: Um die Sichtbarkeit der Blattadern zu optimieren, werden die Blätter zunächst gebleicht und anschließend mit Safranin und Malachitgrün gefärbt. <ol><li> Um die leav bleichenes, lassen Sie sie mindestens 72 Stunden in 50% Lösung von Entfärber (Test verschiedener Marken, wieder einige vielleicht besser funktionieren). Alternativ dazu 5% NaOH-Lösung oder 10% iger KOH-Lösung oder 25% H 2 O 2 -Lösung. </li><li> Die Lösung wird bis zu 30 ° C oder kombinieren Sie die verschiedenen Lösungen aus Schritt 3.1.1 für eine bessere Wirkung. Mehrmals gründlich in Wasser danach. Anpassung des Bleichverfahrens für den spezifischen Art abhängig von ihrer Blatteigenschaften. HINWEIS: Dickere Blätter müssen längere Lösung Badewanne und oder den aggressiveren Lösungen. Dünner und zarten Blätter können zu einer zufrieden Grad in weniger als 72 Stunden gebleicht werden. </li><li> Färben die Blätter legen Sie sie in 100% Ethanol. Färben sie für 2-30 min in 1% Safraninlösung. Zur Färbung zu verbessern, fügen Sie eine zusätzliche Behandlung mit 1% Malachitgrün-Lösung nur für einige Sekunden. Passen Sie das Protokoll zu jeder Art in Bezug auf Zeitpunkt und Intensität, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Spülen seVeral mals in Wasser danach. Wenn die Blätter tief gefärbt sind, kann es einige Zeit in Ethanol oder Entfärber helfen. </li></ol></li><li> Probenanalyse <ol><li> Scannen Sie die Blätter mit einer Hintergrundbeleuchtung-Scanner mit einer Auflösung von ca. 1200 dpi. Ordnen Sie die Scans auf die Auflösung des Bildes, zum Beispiel genommen, mit Hilfe einer Skala, um sicherzustellen, dass Pixellänge lassen sich auf absolute Länge Maßnahmen des gescannten Blattes zurückverfolgt werden. </li><li> Messen Fläche, Umfang, Länge und Breite der Blätter. Berechnen mehrerer Indizes, zB Länge / Breite und Umfang 2 / Fläche. Schneiden Sie ein 1 von 1 cm Rechteck aus der Mitte des Bildes. Messen Sie den Durchmesser der Venen von erster und zweiter Ordnung (beinhalten nicht die Hauptmittel Vene). Messen Sie die Länge aller Adern der erste Auftrag in diesem Quadrat (Venendichte). </li></ol></li></ol> 4. Bewertung der Andere Blatt Traits HINWEIS: Asses typischen Blatt Merkmale wie spezifischesBlattfläche (SLA), Blatttrockensubstanzgehalt (LDMC), Blattfläche, Elementgehalte, Blatt Gewohnheit, Blatt Fiederung, Blattverbindungstyp, der Rand des Blattes Typ usw. folgenden etablierten Protokollen 18,19. <ol><li> Beobachtungsblattmerkmale <ol><li> Beurteilen Blatt Fiederung, Blattverbindungstyp, der Rand des Blattes Art und das Vorhandensein von Nektarien extrafloralen 18,19 durch Beobachtung im Feld. </li></ol></li><li> Analytische Blattmerkmale <ol><li> Sammeln frischen Blattproben, vorzugsweise auf den gleichen Personen wie bei den anderen Messungen, zur Bestimmung der spezifischen Blattfläche (SLA), die Blattfläche und Blatttrockensubstanzgehalt (LDMC) 18,19. Nach 48 Stunden im Trockenschrank bei 80 ° C, gemessen Elementgehalte und Verhältnisse, vorzugsweise auf den gleichen Blättern. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Parameter der Stomata Regulierung durch die in dieser Arbeit vorgestellten Verfahren extrahiert streichen die Bedeutung der Stomata Merkmalen, wie Stomata Dichte und Stomata Index. Diese neuen Beziehungen zeigen das Potenzial der Verknüpfung von Parametern aus physiologischen Modelle zur morphologischen, anatomischen und chemischen Blatt traits 20. Im Vergleich zu anderen Methoden der vorliegende Ansatz hat den Vorteil der Erfassung eine einzigartige und eindeutige VPD Wert, bei dem stomatäre Leitfähigkeit auf die Hälfte des modellierten g s maximale herunterreguliert. Aller Schritte im Protokoll erläutert die kritischsten sind die Messungen der stomatäre Leitfähigkeit. Aufgrund der multifaktoriellen Regulierung der stomatäre Leitfähigkeit Umgebungswetterbedingungen haben einen starken Einfluss auf g S. Stomatäre Leitfähigkeit Messungen bei hohen relativen Luftfeuchte und niedrige Lichtintensität kann unzuverlässig 21-23 sein. In Bezug auf die morphologischen und Anatomical Züge sollte das Protokoll immer den in die Studie aufgenommen Zielarten angepasst werden. Insbesondere in der Vene Dichteanalyse sollte die Dauer des Bleichens und Färbung der Blätter variiert werden, abhängig von Blattstruktur und Zähigkeit. Potenzielle Einschränkungen der Methode sind Arten, für die Messungen der stomatäre Leitfähigkeit unmöglich oder kompliziert und anfällig aufgrund außergewöhnlicher Blattformen Irrtum. Dies kann Koniferen und Gräser mit sehr schmalen Blattspreiten sind. Unsere Ergebnisse bestätigen zum Teil die erste Hypothese einer Verbindung zwischen stomatäre Leitfähigkeit Parameter und Blattmerkmale des Blattes Wirtschaftswissenschaften Spektrum (LES), die sich auf mehrere andere Studien entspricht. Zum Beispiel Poorter und Bongers (2006) 24 berichtet, eine enge Verbindung zwischen g S und Charakterzüge von der LES, beispielsweise dargestellt, wobei g S Abnahme mit zunehmender Blatt Lebensdauer. Dementsprechend Schulze et al. (1994) 1 demonstbewertet klare Verbindungen zwischen Blattstickstoffgehalt und g SMAX. Ebenso Juhrbandt et al. (2004) 25 fanden signifikante Zusammenhänge zwischen g SMAX und Blattfläche und Blattstickstoffgehalt. Unsere zweite Hypothese deutliche Unterschiede in Bezug auf Blatt Gewohnheit, konnte nicht bestätigt werden. Die hohe Variation in der gemessenen Parameter und Eigenschaften innerhalb von immergrünen und Laubblatt Gewohnheit zeigen, dass Blatt Gewohnheit ist nicht eine gute Beschreibung des LES. Brodribb und Holbrook (2005) 26 diskutiert, dass Blatt Gewohnheit und Blatt physiologische Strategien können nicht zwangsläufig verbunden sein, da breiten Merkmalsvariation ist auf alle Arten von Blatt Gewohnheit verbreitet. Der Ansatz kann auf Eigenschaften und physiologische Eigenschaften von anderen als Blätter, beispielsweise um Merkmale zu Xylem Hydraulik bezogen Pflanzenorganen wie spezifische Xylem hydraulische Leitfähigkeit und Mikroskopie Holz traits 27 verlängert werden. Ähnlich anderenArten von Blattmerkmalen, wie aus der Mikroskopie wie Palisadenparenchym Struktur und epikutikulären Wachsschicht-Struktur ableiten könnte enthalten 28 werden. Zusammenfassend bestätigt diese Studie die enge Verbindung zwischen der LES und Stomata Regulierung. Darüber hinaus ist die hier vorgestellte Verfahren ergab Facetten stomatal Regulationsmuster, die nicht dem LES in Zusammenhang stehen. Besonders spezifische Blattmerkmale wie Stomata Größe, Dichte und Index sowie Venenlänge verdienen Zukunft Aufmerksamkeit in funktionellen Pflanzenstudien.

Um die funktionelle Verständnis zu fördern von Pflanzenblättern, haben viele neuere Studien haben versucht, morphologischen, anatomischen und chemischen Blatt Merkmale, die physiologischen Reaktionen, wie Blatt stomatäre Leitfähigkeit (g S) 1-4 beziehen. Zusätzlich zu Blatt Merkmale, stomatäre Leitfähigkeit stark von Umgebungsbedingungen, wie zum Beispiel photosynthetisch aktive Photonendichte, Lufttemperatur und vpd 5 beeinflusst. Verschiedene Wege vorgeschlagen worden, um zu modellieren gs - VPD Kurven 6-8, die im Wesentlichen auf lineare Regression der GS auf vpd 6 basieren. Im Gegensatz dazu ist die in dieser Studie präsentierten Modell bildet die Logits relativer stomatäre Leitfähigkeit (dh das Verhältnis von G S die maximale stomatäre Leitfähigkeit g SMAX) auf vpd und ist für die Nichtlinearität, indem vpd als quadratische Regressor term. Im Vergleich zu anderen Modellen ermöglicht das neue Modell zur Ableitung von Parametern, die beschreiben,das VPD, bei dem g S wird unter Wasserknappheit herunterreguliert. In ähnlicher Weise wird das VPD erhalten, bei dem g S maximal ist. Als solche physiologische Parameter kann erwartet werden, fest an Kohlenstoffassimilation 9,10 verbunden sein werden, eine enge Verbindung zwischen diesen Modellparametern und der Schlüsselblattmerkmale zur Nährstoff-und Ressourcenverteilung, wie in der LES reflektiert zu erwarten 3,11 werden. In der Folge sollte es auch eine enge Beziehung zwischen Strategien der Stomata Regelung mit LES Merkmale sein. Eine solche Beziehung ist insbesondere für Blatt Gewohnheit (grüngegenüber Laub) als Blatt Gewohnheit erwartet wird, sowohl mit der LES und Wassernutzungseffizienz 12,13 korreliert. Immergrünen Arten sind in der Regel langsamer zu wachsen, aber effizienter sind in Umgebungen nährstoffarm 14. Daher sollten Blatt Gewohnheit in unterschiedlichen Stomata Regulationsmuster, mit einer eher konservativen Wassernutzungsstrategie als Laubbaumarten zu übersetzen. CompAring einen großen Satz von Laubbaumarten in einem gemeinsamen Garten Situation wurden folgende Hypothesen getestet: 1) Modellparameter aus g S - VPD-Modelle sind mit Blattmerkmale an der Blatt Wirtschaftswissenschaften Spektrums verbunden. 2) Immergrüne Arten haben niedrigere Durchschnitts g S und g SMAX-Werte als Laubbaumarten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SC 1 Porometer</td>
			<td>Decagon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other porometer is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties to mark leaves</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Trotec</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 2 plus</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% NaOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% KOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% H2O2</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite green</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

relating stomatal conductance to leaf functional traits

Blatt funktionalen Merkmale sind wichtig, denn sie spiegeln die physiologischen Funktionen, wie zum Beispiel die Transpiration und Kohlenstoffassimilation. Insbesondere weisen morphologische Blattmerkmale das Potenzial, Pflanzen-Strategien in Bezug auf die Wassernutzungseffizienz, Wachstumsmuster und Nährstoffnutzung zusammenfassen. Das Blatt Wirtschaftswissenschaften Spektrum (LES) ist ein anerkannter Rahmen der funktionellen Pflanzenökologie und reflektiert einen Gradienten zunehmender spezifischen Blattfläche (SLA), Blatt Stickstoff, Phosphor und Kationengehalt, und abnehmender Blatttrockensubstanzgehalt (LDMC) und Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis ( CN). Die LES beschreibt verschiedene Strategien, die von der des kurzlebigen Blätter mit hoher Photosynthesekapazität pro Blattmasse, um langlebige Blätter mit geringer Masse-basierte Kohlenstoffassimilation Raten. Allerdings könnte Merkmale, die nicht in der LES enthalten sind zusätzliche Informationen über die Art &quot;Physiologie, wie diejenigen, die Stomata Steuerung in Verbindung stehen. Protokolle sind für eine breite Palette von Blatt functio vorgestelltnal Merkmale, einschließlich Merkmale des LES, aber auch Eigenschaften, die unabhängig von der LES sind. Insbesondere wird ein neues Verfahren eingeführt, das Regelverhalten der Pflanzen in stomatäre Leitfähigkeit zur Dampfdruckdefizit betrifft. Die resultierenden Parameter der Stomata Regelung kann dann auf den LES und andere Pflanzen funktionalen Merkmalen verglichen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass funktionelle Blatt Züge des LES waren ebenfalls gültig Prädiktoren für die Parameter der Stomata Regulierung. Zum Beispiel Blattkohlenstoffkonzentration war positiv mit dem Dampfdruckdefizit (VPD) an dem Wendepunkt und dem Maximum der Konduktanz-VPD Kurve. Jedoch Merkmale, die nicht in der LES enthaltenen zusätzlichen Informationen bei der Erläuterung Parameter der Spaltöffnungskontrolle: Die VPD am Wendepunkt der Leitfähigkeit-VPD Kurve niedriger für Arten mit höheren Spaltöffnungsdichte und höhere Stomata Index war. Insgesamt waren die Spaltöffnungen und Vene Züge stärkeren Prädiktoren zur Erläuterung Stomata Regulierung tHan-Züge in der LES verwendet.

Viele Parameter stomatäre Leitfähigkeit und Stomata Verordnung wurde festgestellt, morphologischen, anatomischen und chemischen Blatt Merkmale bezogen werden. Im Folgenden wird der Schwerpunkt auf die Links sein, an der Wendepunkt, der mit Spaltöffnungsdichte (p = 0,04) und Stomata-Index (p = 0,03) verkleinert und mit Blattkohlenstoffgehalt (p = 0,02 VPD, siehe Abbildung 3). Die Ergebnisse zeigen, dass mit abnehmender VPD am Wendepunkt gab es eine Abnahme der Spaltöffnungsdichte und Stomata Index. Im Gegensatz dazu kein Parameter des stomatäre Leitfähigkeit zeigte eine klare Beziehung zu Blatt Gewohnheit. Die hohe Variation innerhalb der beiden Gruppen von Blatt Gewohnheit zeigt, dass verschiedene Regulationsmechanismen existieren sowohl innerhalb der Gruppe von immergrünen und Laubblatt Gewohnheiten. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3. Ergebnis Zahl für the Verbindungen zwischen Muster stomatäre Leitfähigkeit Regulierung und Blattmerkmale Dampfdruckdefizit (VPD) am Wendepunkt des g S -. VPD-Kurve (VpdPoi) als Funktion der (A) Stomata Dichte, (B) Stomata Index und (C) Blattkohlenstoffgehalt 20. Re-print mit Genehmigung aus 20. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Entwirren, wie Physiologie und Morphologie verknüpft sind, ermöglicht ein tieferes Verständnis der mechanistischen Funktionieren der Anlage verlässt. Wir präsentieren sowohl ein Verfahren, um die Parameter der Spaltöffnungsregelung von stomatäre Leitfähigkeit Messungen und Korrelationen mit traditionellen funktionellen Blattmerkmale abzuleiten.

Bezug stomatäre Leitfähigkeit zu Blatt Funktionale Merkmale

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

relating-stomatal-conductance-to-leaf-functional-traits

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K Aufrufe.  Martin-Luther-University Halle-Wittenberg.  Entwirren, wie Physiologie und Morphologie verknüpft sind, ermöglicht ein tieferes Verständnis der mechanistischen Funktionieren der Anlage verlässt. Wir präsentieren sowohl ein Verfahren, um die Parameter der Spaltöffnungsregelung von stomatäre Leitfähigkeit Messungen und Korrelationen mit traditionellen funktionellen Blattmerkmale abzuleiten. 

Serie: Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Forschung

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

Measurement of Leaf hydraulische Leitfähigkeit und stomatäre Leitfähigkeit und ihre Antworten auf Bestrahlungsstärke und Dehydration Mit dem Evaporative Flux-Methode (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Ein ImageJ Plugin für Semi-automatisierte Blattform Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiac Druck-Volumen-Loop-Analyse mit Conductance-Katheter bei Mäusen

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

Fisch Sperma Bewertung mit Software und Kühlgeräte

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...