Der Autor möchte die Nutzung der Kinder-Forschungsinstitut Imaging Core für die konfokale Mikroskopie und Dr. Jian Zhang für den Vorschlag bestätigen die Abschnitte mit Agaroseperlen montieren. Diese Arbeit wurde vom NIH DC010387 finanziert.

1. Isolation und Fixierung der inneren Ohren <ol><li> Für die Analyse von zellulären Strukturierung im Corti-Organ, euthanize entsprechend inszeniert Embryonen oder Erwachsenen. </li><li> Sezieren die Ohrkapsel, mit dem häutigen Innenohr. In der Maus, kann dies leicht an Embryonen in embryonale (E) Tag 14,5 und älter, in denen E0.5 der Tag, an dem ein Vaginalpfropf wurde erkannt wird getan werden. Dissektion der Ohrkapsel wird zunächst durch Enthauptung und die Öffnung des Schädels an der Mittellinie erfolgen. Entfernen Gehirn an beiden Ohren (Abb. 1A) aussetzen. Inner Ohren können geschält werden, aus intakten mit einer Pinzette (zB Dumont Nr. 5, Abb.. 1B). Wenn Imaging-Corti-Organ, ist eine sorgfältige Entfernung aller neuronalen und des Bindegewebes mit der Ohrkapsel verbunden sind, nicht erforderlich. </li><li> Fix gesamte Innenohr durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd (PFA) unter leichtem Schütteln bei 4 ° C über Nacht in 1,8 ml mit Schraubverschluss NUNC Cryo-Röhrchen Fläschchen oder andere entsprechend großen Behälter. PFA-Lösung sollte frisch zubereitet werden in ddH 2 0, dann bei -20 ° C gelagert, bis sie benötigt. </li><li> Am nächsten Tag auswaschen Fixativ mit drei Änderungen 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Gewebe kann in sterile 1X PBS für Tage bis Monate gelagert werden, bis zur Verarbeitung bereit. Für erwachsene Gewebe, in 10% EDTA (0,27 M) entkalken bei 4 ° C für 5 Tage, gefolgt von Spülen und Lagerung in 1X PBS gefolgt. </li></ol> 2. Cutting Vibratom Abschnitte <ol><li> Bereiten Sie 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in 1X PBS. Add niedrigen Schmelzpunkt Agarose 1X PBS und Mikrowelle bis Agarose wird in Lösung. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht Blase über - nehmen Sie aus der Mikrowelle in regelmäßigen Abständen und wirbeln zu mischen. Keep-Lösung in einem 55 ° C Wasserbad bis zur Verwendung. </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Innenohr von 1X PBS-Lösung und die Position auf dem Boden einer Peel-A-Way Einbettform. Pipettieren entfernt überschüssiges 1X PBS aus der Form. Fill Form, um das Gewebe mit reichlich Flüssigkeit 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (Abb. 2A) zu decken. </li><li> Position des Innenohrs zum Schneiden in die entsprechende Ebene. Ich habe gute Querschnitte des Corti-Organ durch Angleichung der Stellung der Ohrkapsel, als ob es in situ in den Kopf nach links war und Schnitte in der Transversalebene erhalten. Für E14.5 Embryonen für Erwachsene, Position des Innenohrs, so dass es seitlich, mit den seitlichen halbkreisförmigen Kanal sichtbar (Abb. 2B) angesehen. Angle das Innenohr, so dass die Linie von der hinteren Seite der Ohrkapsel gebildet ungefähr in einem 45-Grad-Winkel von der beabsichtigten Schnittebene (Abb. 2A, B). Wenn die Ohrkapsel so angesehen wird, dass die dorsale Teil der Ohrkapsel an der Spitze ist, sollte der basalen Windung der Cochlea am unteren Rand (Pfeilspitze, Abb.. 2B) befinden und die vorderen halbkreisförmigen Kanal (asc) sollte werden an der Spitze (Abb. 2B). </li><li> Agarose wird bei RT innerhalb von 30 Minuten eingestellt. Transfer-Peel-Away Formen mit eingebetteten Gewebe bis 4 ° C bis zu seiner Sektion. Wenn Schnitte werden bis zum nächsten Tag gestellt werden, fügen 1X PBS, um die Agarose in der Form und speichern in eine Kiste mit feuchtem Küchenpapier in 1X PBS getränkt decken. </li><li> Lösen Sie den Kunststoff-Formenbau. Mit einer Rasierklinge herausgeschnitten einer Agarose-Box mit dem Innenohr Gewebe. Achten Sie darauf, dass die Schnittfläche gerade und parallel auf der gegenüberliegenden Seite des Blocks, die die Oberfläche, auf denen die Agaroseblock geklebt unten ist werden wird. Da die Agarose nicht infiltrieren nicht das Gewebe, nicht beschneiden zu viel Agarose aus aller Gewebe, so dass das Gewebe wird gut unterstützt. </li><li> Verwenden Sie Sekundenkleber, um den Block auf die Schnittfläche legen. </li><li> Sektion 40 bis 100 mu m Dicke durch Vibratom. Speichern Abschnitte in einem Gewebe-Kulturschale mit 1X PBS, 0,1% TritonX-100 gefüllt. Eine repräsentative Querschnitt durch die Cochlea-Spirale ist in Abb. dargestellt. 2C. </li><li> Verwenden einer Pinzette zu sezieren entfernt die Agarose aus dem Gewebe. Agarose wird nicht in das Gewebe eindringen, sondern nur an der äußeren Oberfläche des inneren Ohres stecken. </li><li> Wenn gewünscht, mit Pool Agarose-free, geschnitten Gewebe einer Pipette mit einem großen Loch Öffnung übermäßige Scherung des Gewebes zu verhindern. Oder 24-Well-Kulturschale - Wenn Durchführung mehrerer Antikörper Flecken auf mehreren verschiedenen Geweben, können Abschnitte in einem 16 organisiert werden. </li></ol> 3. Antikörper-Färbung Vibratom Abschnitte Fahren Sie mit dem Antikörper-Färbung. Prozess Abschnitte ganz-mount, frei schwebend in Lösung. Unten ist ein Beispiel Antikörper-Färbung Protokoll für den S100 Marker der Säule Zellen des Corti-Organ, sondern kann das Protokoll für jeden Antikörper verwendet werden. Alle Wäschen sind bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders vermerkt. <ol><li> In einer Multi-Well-Kulturschale, inkubieren frei schwebenden Abschnitte mit sanften Schaukeln in PBT (1X PBS, 1% Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100) für 30 Minuten. </li><li> Pipettieren aus alten Lösung und Block frei floating Abschnitte mit sanften Schaukeln in PBT + normalem Ziegenserum (50 ul NGS / 1 ml PBT) für 30 Minuten. </li><li> Pipettieren aus alten Lösung und fügen primärer Antikörper in PBT + NGS (1:200 Verdünnung der S100 in PBT + NGS) verdünnt. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Pipettieren aus primärer Antikörper-Lösung. 3x, 5 min. mit PBT, dann 4X, 30 min. mit PBT. </li><li> Block mit PBT + NGS, 30 min. </li><li> Inkubieren mit Fluoreszenz-konjugierten sekundären Antikörper (aufgewachsen in Ziege) in PBT + NGS verdünnt. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C, oder ein paar Stunden, RT, sanfte Schaukeln. </li><li> Pipettieren aus sekundären Antikörper-Lösung. 3x, 5 min., Dann 4X, 30 min. mit PBT. </li><li> Pipet off letzten PBT waschen und zu ersetzen mit den entsprechenden wässrigen Eindeckmedium mit einem nuklearen Gegenfärbung. </li></ol> 4. Montage Abschnitte über Rutschen und konfokale Mikroskopie Um zu verhindern, Zerkleinern der dicke Abschnitte mit dem Deckglas, bei der Montage einzelner Abschnitte, muss ein Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckglas eingefügt werden. Unten sind zwei alternative Methoden der Montage dicken Vibratom Abschnitte: <ol><li><ol type="a"><li> Ein Abstandhalter kann, indem ein Rand Vakuumfett in ein Quadrat um den Gewebeschnitt erstellt werden. So bei der Festlegung der Deckglas, werden die Kanten des Deckglases mit Vakuumfett abgedichtet werden. Drücken Sie auf die Ränder des Deckglases mit dem Daumen fest haften sie auf die Folie. Wenn das Vakuum Fett ist sauber und gleichmäßig vorhanden um alle Kanten des Deckglases, wird die Folie ausreichend für den Einsatz auf einer invertierten konfokalen Mikroskop abgedichtet werden. </li><li> Alternativ kann ein spacer erstellt unter Verwendung von Agarose Chromatographieharz bekannter Maschenweite (wie Affi-Gel Blue Gel, Bio-Rad) werden. Pipet 1 ul Harz auf den Objektträger in jeder der vier Ecken, wo das Deckglas platziert werden soll. Pipet einem Gewebeschnitt und Montage von Medien in der Mitte der vier Punkte des Harzes. Deckglas. Bei Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop, Deckglasränder auf den Objektträger mit Nagellack. </li></ol></li><li> Erhalten optische Schnitte des gefärbten Vibratom Scheiben mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Zur Quantifizierung verschiedener Zelltypen innerhalb des Corti-Organ, erhalten eine z-Stapel mit einer definierten Schrittweite (zwischen 1,5 und 3 um). Abschnitte sollten gegengefärbt mit einem nuklearen Farbstoff (Schritt 3,8). Bilder können auf jedem Computer-Bildschirm nach konfokalen Bild Sammlung untersucht werden. Die Zellen können gezählt manuell beobachten das Auftreten und Verschwinden der Kerne, wie Bilder der Reihe nach durch die z-Stapel untersucht werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Vertreter der konfokalen Z-Stapel durch eine Vibratom Abschnitt für S100-Protein, das in Säule und Deiters &#39;Zellen und gegengefärbt mit einem nuklearen Farbstoff (Abb. 3A-F) gefärbt. Jedes Panel ist die konfokale Abbildung bei 3 um-Schritte, mit Panel A die konfokale Abbildung erhalten am nächsten an der Oberfläche des Vibratom Abschnitt und Panel-F die konfokale Abbildung meisten intern in der Vibratom Abschnitt erhalten. Die Morphologie der Corti-Organ scheint minimal gestört. Insbesondere sind die cytoplasmatische Erweiterungen der Säule Zellen nicht gebrochen. Indem man das Auftauchen und Verschwinden der Säule Zellkernen durch die z-Stapel (Abb. 3A bis 3F), können sowohl innere und äußere Säule Zellzahl gezählt (siehe Nummerierung, 3A. - F) sein. Aufgrund der geringen Anzahl von jedem Zelltyp pro konfokale Abbildung, kann dieser Ansatz verwendet, um den meisten Zelltypen innerhalb des Corti-Organ zu zählen. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Intakt, 15-Wochen alten, eingehüllt erwachsene Innenohr in der Labyrinthkapsel. (A) Das Recht Ohrkapsel (in Klammern) eingeschlossen in den Schädel, betrachtet von einem Aussichtspunkt im Kopf, nach der Entfernung des Gehirns. Anterior ist auf der rechten Seite. (B) Intact, 15-Wochen alten Innenohr nach der Sektion aus dem Schädel. Seitliche Fläche des linken Innenohr ist sichtbar; medialen Fläche des rechten Innenohr sichtbar ist. Labels zeigen die Positionen der vorderen halbkreisförmigen Kanal (asc), Co (Cochlea) und ow (ovales Fenster). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. (A) insgesamt Innenohr von einem 15-Wochen alten Erwachsenen, in Agarose in der Mitte einer Peel-Away Form eingebettet. Beabsichtigte Schnittebene angezeigt. (B) Close-up Bild von einem 15-Wochen alten, ganze Innenohr vor dem Einbetten. Ein Teil der umgebenden Knochen wurde entfernt, so dass die häutige Labyrinth eines betrachteten könnte deutlicher seziert. Die seitlichen halbkreisförmigen Kanal (LSC), anterior halbkreisförmigen Kanal (asc) und Cochlea (co) sind zurückzuführen (weiß Kurven). Die basalen Windung der Cochlea (Pfeilspitze) und bestimmt Schnittebene (gestrichelte Linie) angegeben sind. (C) Repräsentative cross-Schnitt durch die Cochlea. In einem Querschnitt durch den Ductus cochlearis, das Corti-Organ (oC) boxed ist, ist die Stria vascularis (sv) Klammern und die Reissner-Membran (Rm) angezeigt wird. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Das Corti-Organ in einem Wildtyp-Maus auf P21. (AF) Sequential konfokalen Serie, in einem 3 um Schritt-Größe, durch eine S100-Antikörper-gefärbten Corti-Organ an der Säule Zellen und Deiters visualisieren &#39;Zellen. Grafen von inneren und äußeren Säulen Zellen von Anfang bis zum Ende der Serie sind nummeriert. Abkürzungen: IHC (inneren Haarzelle), AIHC (benachbarten inneren Haarzellen), OHC (äußere Haarzellen), PC (Säule Zelle), DC (Deiters &#39;Zelle).

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	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Medical College of Wisconsin IACUC gesetzt durchgeführt.

Das Verfahren der Vibratom Schnitte, durch Immunhistochemie und konfokale Bildgebung gefolgt ermöglicht die Visualisierung des Corti-Organ mit minimalen Gewebeschäden. Offensichtlich zeigen konfokale Bilder aus dem internen Regionen in der Vibratom Abschnitt entnommen ausgezeichnete Erhaltung der Zellmorphologie, die nur durch Fixierung Artefakte begrenzt ist. Konfokale Bilder der Nähe der beiden cut-Oberflächen eines Vibratom Abschnitt entnommen werden oft von den Bildern aus dem internen Regionen zu unterscheiden, obwohl gelegentliche zellulären Störungen, wie Pausen in der cytoplasmatischen Erweiterungen der Säule Zellen beobachtet (nicht dargestellt). Dieser Ansatz ist einfach, und die wichtigsten Ausrüstungsgegenstände - eine Vibratom Maschinen-und konfokalen Mikroskop - sind häufig Ausrüstungsgegenstände, die allgemein zugänglich sind, um die meisten Forscher. Darüber hinaus kann dieser Ansatz für alle Antikörper, der spezifische Färbung in der Corti-Organ Shows verwendet werden. In der Tat ist die primäre Einschränkung dieses Ansatzes die Spezifität der Antikörper und Modifikationen bis 3 dieses Protokolls Schritt kann es notwendig sein, um sicherzustellen, dass ein bestimmter Antikörper wird in spezifische Färbung ergeben. Zusammenfassend beschreibe ich ein einfaches Verfahren, die verallgemeinerbar keine Antikörper und sorgt für maximale Erhaltung und Analyse der zellulären Organisation der Corti-Organ.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Leica VT1000S vibrierender Klinge Mikrotom </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Studentische Dumont Nr. 5 Pinzetten </td><td> Feine Science Tools </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Low Melting Point Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way Einbettform </td><td> Polysciences </td><td> 18986 oder 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> Ziegenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 Ziege anti-Kaninchen IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11036 </td><td> 1:1000-Verdünnung </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumfett </td><td> Fischer </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel Blue Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

Das Säugetier-Corti-Organ ist ein hoch geordneter zellulären Mosaik mechanosensorischen Haar und nichtsinnlichen Stützzellen (Besprochen in 1,2). Visualisierung von diesem zellulären Mosaik oft verlangt, dass das Corti-Organ im Querschnitt ist. Insbesondere kann die nichtsinnlichen Säule und Deiters &#39;Zellen, deren Kerne sind basal in Bezug auf die Haarzellen befinden, nicht sichtbar gemacht werden, ohne Querschliffe Corti-Organ. Allerdings ist die zarte Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, einschließlich der feinen zytoplasmatischen Prozesse der Säule und Deiters &#39;Zellen, schwer durch routinemäßige histologische Verfahren wie Paraffin und Kryo-Schnitte, die kompatibel mit Standard-immunhistochemische Färbetechniken sind zu bewahren. Hier beschreibe ich eine einfache und robuste Verfahren, bestehend aus Vibratom Schnitte der Cochlea, immunhistochemische Färbung dieser Vibratom Abschnitte in whole mount, durch konfokale Mikroskopie verfolgt. Dieses Verfahren wurde in großem Umfang für die immunhistochemische Analyse von mehreren Organen, einschließlich der Maus Gliedmaßenknospe, Zebrafisch Darm, Leber, Bauchspeicheldrüse und Herz (siehe 3-6 für ausgewählte Beispiele) verwendet. Darüber hinaus wurde dieses Verfahren erfolgreiche sowohl für Imaging und quantitificaton der Säule Zellzahl in der Mutante und Kontrollorgane von Corti in beiden Embryonen und erwachsenen Mäusen 7. Diese Methode ist jedoch derzeit nicht weit verbreitet, um die Säugetier-Corti-Organ zu untersuchen. Das Potenzial für dieses Verfahren, um beide bieten verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der erwachsenen Corti-Organ und erlauben die Quantifizierung der verschiedenen Zelltypen beschrieben.

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Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Ein einfaches Verfahren der Vibratom Schneiden des Corti-Organ, durch Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie folgt beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, und somit ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Zelltypen.

Vibratom Sectioning für Enhanced Erhaltung der Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten Säugetier-Rinde

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Eine Volumetrische Methode zur Quantifizierung der zerebralen Vasospasmus in einem Mausmodell der Subarachnoidalblutung

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...