We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen und Rechtsvorschriften der Europäischen Union über den Schutz von Tieren zu Versuchszwecken (Richtlinie 86/609 / EWG) und mit Empfehlungen von der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) vorgelegt verwendet. Sowohl C57BL / 6 - Mäuse und Fpr-RS3-i-Venus - Mäuse wurden in Gruppen beider Geschlechter bei Raumtemperatur auf einem 12 Stunden Licht / Dunkel - Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Für Experimente junge Erwachsene (6-20 Wochen) beiderlei Geschlechts wurden verwendet. Keine offensichtlichen geschlechtsabhängige Unterschiede beobachtet. 1. Herstellung der Lösung <ol><li> Bereiten extrazelluläre Lösung S 1: 4- (2-Hydroxy-ethyl) -piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) gepufferten extrazelluläre Lösung , enthaltend (in mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES; pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH); Osmolarität = 300 mOsm (mit Glucose eingestellt). </li><li> bereiten Sie extracellular Lösung S 2: Carbogen-oxygenierten (95% O 2, 5% CO 2) extrazelluläre Lösung (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7,3; Osmolarität = 300 mOsm (mit Glucose eingestellt). </li><li> Bereiten Sie 4% Nieder Geliertemperatur Agarose - Lösung (S 3) für die Gewebeeinbettung: 4% Nieder Geliertemperatur Agarose. Löse 2 g Tief Gelieren Agarose in 50 ml S 1 in einem 100 - ml - Glaslaborflasche zusammen mit einem Magnetrührer. Um die Agarose schmelzen, stellte die Flasche in einem Wasserbad (mit Deckel nicht dicht geschlossen) bei 70 ° C für ca. 20 Minuten oder bis die Lösung transparent wird unter Rühren. Abkühlen und halten geschmolzener Agarose in einem zweiten Wasserbad bei 42 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Bereiten intrazellulärem Lösung S 4: Pipettenlösung , enthaltend (in mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl 2 (freie Ca 2+ = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (eingestellt mit KOH); Osmolarität = 290 mOsm. </li><li> Modifizieren / anpassen Zusammensetzung S 1, S 2 und S 4 nach individuellen Versuchsplanung (zB pharmakologische Blocker zu isolieren bestimmte Arten von spannungsaktivierten Ströme). </li></ol> 2. Arbeitsbereich Vorbereitung <ol><li> Füllen Scheibe mit Sauerstoff mit S 2 mindestens 30 Minuten vor der Präparation, auf Eis für Temperatur und pH - Einstellung und oxygenate Lösung kontinuierlich Speicherkammer. </li><li> Füllen Reservoir für Scheibe Superfusions bei der Aufnahme - Setup mit S 2 und Sauerstoff kontinuierlich. </li><li> Vor der Präparation, füllen Vibratom Kammer mit S 2 und zerstoßenem Eis um die Kammer anordnen. Alternativ übertragen Ersatz eiskalt mit Sauerstoff angereicherte Lösung aus der Kammer in Vibratom Kammer mit Sauerstoff und kontinuierlich mit Sauerstoff zu halten. </li><li> Vereinbaren Sie chirurgische Instrumente und Verbrauchsmaterialien. </li><li> Legen Sie Eis Gelpack unter SezierenMikroskop, Deckel mit einem Papiertuch VNO Gewebe gefriert zu Boden der Schale zu verhindern. </li><li> Saubere Rasierklinge durch kurz in 70% Ethanol und destilliertem Wasser gespült und montieren zu Vibratom. Ersetzen Sie für jede Slicing-Sitzung. </li></ol> 3. VNO Dissection and Embedding <ol><li> Sacrifice Tier durch kurze Exposition zu CO 2 und enthaupten scharfe chirurgische Schere. Hinweis: Im Laufe der Zeit zu opfern, das Tier auf die Verwirklichung des VNO Kapsel auf Eis kritisch ist, minimieren die Zeit auf weniger als 2 min. Zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit des Gewebes, einbetten sowohl vollständig seziert VNOs in Agarose in weniger als 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Unterkiefer mit großen chirurgischen Schere. Geben Sie durch die Mundhöhle und schneiden Sie die Unterkiefer Knochen und Muskel von jeder Seite getrennt. </li><li> Platzieren Sie den restlichen Teil der Kopf auf den Kopf in der großen Petrischale. </li><li> Ziehen Sie die Haut des Oberkiefers und um die Nasenspitze mit mittlerer Pinzette entfernt einen besseren Zugang zu den zu gewinnenSchneidezähne. </li><li> Verwenden Sie Knochen Schere , um den größten Teil der Schneidezähne in der rostralen Richtung (Abbildung 1A) in einer ~ 45 ° Winkel wegzuschneiden. Dies wird die Entfernung des VNO Kapsel aus der Nasenhöhle zu erleichtern. Hinweis: Nehmen Sie an die Wurzel des Zahns nicht geschnitten Schäden an der Spitze der VNO Kapsel zu verhindern. </li><li> Besorgen Sie sich die starren oberen Gaumen an seinem rostralen Teil mit mittlerer Pinzette und sorgfältig schälen zurück in einem Stück in einem flachen Winkel (1B). Hinweis: Wiederholt spülen mit eiskaltem S 2. </li><li> Verwenden Sie Mikro-Feder Schere, um die Knochenfusion zwischen der Spitze des Vomers und den Kiefer zu schneiden. Legen Sie die Scherenspitzen mit dem gekrümmten Teil der Spitze nach außen weg von der VNO und sorgfältig sowohl den Knochen in kleinen Schritten auf schnitt der linken und rechten Seite lateral der VNO-Kapsel. </li><li> Um die VNO Kapsel zu entfernen, verwenden Mikro Feder Schere durch den Vomers am kaudalen Teil zu schneiden und vorsichtig heben Sie den Vomers aus dem nasal Hohlraum mit mittlerer Pinzette. Unmittelbar übertragen Sie die VNO auf eine kleine Petrischale unter einem Stereomikroskop auf einem Eis-Gel-Packung, wo die restlichen Schritte der Präparation wird ausgeführt. </li><li> Spülen Sie das VNO in einer kleinen Menge eiskaltem S 2 in das Gewebe ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Trennen Sie die knorpelige Kapseln, die die VNO Weichgewebe durch Greifen der Rückseite des Vomers mit mittlerer Zange enthalten. Positionieren Sie die Kapsel für eine dorsale Ansicht , so dass eine Spaltung zwischen den beiden VNOs sichtbar wird (Abbildung 1D i). </li><li> Verwenden Sie die Spitze der feinen Pinzette beide Knorpel VNO Kapseln vom zentralen Knochen zu trennen, während die Vomers am hinteren Teil festgenagelt zu halten. Hinweis: Verwenden einer Pinzette nur am Rand des Knorpels Kapsel und sehr vorsichtig sein, nicht durch den Knorpel zu durchdringen, wie die zarte ist Sinnesepithel leicht beschädigt werden. </li><li> Sobald die beiden VNOs getrennt sind, starten Sie den Knorpel Entfernen der Tannen Einkapselnt VNO. </li><li> Besorgen Sie sich die oberen Rand der Kapsel mit einer feinen Pinzette und spaltete die Knorpelwand weg, die zuvor mit dem Vomers (mediale Seite) befestigt war. </li><li> verbleibenden Knorpel drehen Sie den VNO mit seinen geschwungenen seitlichen Seite auf den Boden der Schale zu entfernen und den Knorpel sicher auf der einen Seite festzunageln Pinzette. bewegen vorsichtig die zweite feinen Pinzette von der Rückseite in einem sehr flachen Winkel zwischen Knorpel und VNO die Verbindung zwischen Gewebe und Knorpel zu lösen. </li><li> Langsam das VNO schälen aus dem Knorpel entfernt, indem sie es an seiner Schwanzspitze hält, eine Beschädigung des Sinnesepithel zu vermeiden. </li><li> Sobald die VNO aus der Kapsel gehebelt wird, stellen Sie sicher, alle verbleibenden kleinen Knorpelteile wie verbleibenden Knorpelstücke zu entfernen, wird das Gewebe aus den umliegenden Agarose während des Schneidprozesses lösen. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen eiskalten S 2 im ersten seziert VNO zu Gewebeschäden zu verhindern. Ein großes Blutgefäß an der lateralen Seite will werden sichtbar anzeigt , dass das Organ noch intakt ist und nicht grob beschädigt während der Präparation (2A ii). Im Falle wurde das Blutgefäß beschädigt, wird es dennoch sinnvoll sein, die VNO, solange die Gesamtmorphologie war nicht eindeutig beeinträchtigt weitermachen mit dem Schneiden. </li><li> Unmittelbar nach der zweiten VNO sezieren. </li><li> So betten die VNOs, füllen die beiden kleinen Petrischalen bis zum Rand mit geschmolzenem S 3 (gespeichert in einem Wasserbad bei 42 ° C; siehe 1.3). </li><li> Halten Sie die VNO auf den breiteren Schwanzende mit einer feinen Pinzette Beschädigung des Sinnesepithel zu vermeiden. </li><li> Tauchen Sie die VNO in der Agarose und bewegen Sie ihn horizontal hin und her mehrere Male den Film von extrazellulären Lösung sowie alle Luftblasen von der Oberfläche zu entfernen. </li><li> Positionieren Sie die VNO vertikal mit der Schwanzspitze den Boden der Schale zugewandt ist. Anstatt das VNO mit der Zange direkt Kneifen, justieren Orientierung durch die Zangenspitze in der Nähe proximi bewegenty zum VNO. Hinweis: Orientierung bei der Einbettung ist entscheidend, da es Schnittebene und die Zugänglichkeit zu sensorischen Neuronen während des Experiments bestimmt. </li><li> Legen Sie Gerichte auf Gel Eisbeutel und warten, bis Agarose erstarrt ist. Hinweis: VNO Orientierung nicht ändern, sobald die Agarose verfestigt hat begonnen, da dies das Gewebe aus dem umgebenden Agarose zu lösen. </li></ol> 4. Koronar VNO Gewebe Slicing <ol><li> Verwenden Sie kleine Spachtel Agaroseblock von der kleinen Schale in den Deckel einer großen Petrischale zu entfernen, drehen Sie die Agarose den Kopf, die Schwanzspitze des VNO verlässt nach oben. </li><li> Schneiden Sie den Block in eine pyramidale Form eines chirurgischen Skalpells (3-4 mm an der Spitze, 8-10 mm an der Unterseite) mit. Achten Sie darauf, nicht das eingebettete Gewebe zu beschädigen. </li><li> Verwenden Sie Superkleber der pyramidenförmigen Block auf der Mitte der Vibratom Probenplatte zu reparieren und warten ~ 1 min für den Kleber vollständig trocknen. </li><li> Übertragen Sie die Probenplatte zum Schneiden chamber und die zweite VNO vorzubereiten, entsprechend. Halteplatte mit der zweiten Probe bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Verwenden Sie ein vibrierender Klinge Mikrotom mit den folgenden Einstellungen: Dicke: 150-200 &amp; mgr; m; Geschwindigkeit: 3,5 au = 0,15 mm / sec; Frequenz: 7.5 au = 75 Hz. Übertragen Scheiben zu Sauerstoffanreicherungskammer bis zur Verwendung für Scheibe Morphologie unter dem Binokular kurz inspizieren. Scheiben können für mehrere Stunden gehalten werden. </li></ol> 5. Einzelzelle elektrophysiologischen Ableitungen <ol><li> Für Aufnahmen, verwenden Sie eine aufrechte Fest Bühne Mikroskop ausgestattet mit Wassertauchziele, Dodt oder Infrarot-Differential störenden Kontrast (IR-DIC) und Epi-Fluoreszenz sowie eine gekühlte CCD-Kamera. Zur Datenerfassung, verwenden Sie ein Patch-Clamp-Verstärker, Kopfstufe, AD / DA-Schnittstellenkarte und einem PC (einschließlich Aufnahme-Software). </li><li> Bereiten Sie einen Vorrat von 10-20 Patch-Pipetten (4-7 MOhm). Pull-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) usinga Mikropipette Abzieher und Feuerpolitur mit einem Mikroschmiede. Hinweis: Feuerpolieren der Pipettenspitzen von entscheidender Bedeutung ist, wenn die eher kleinen VSNs Patchen. Dadurch wird die Zellmembran Bersten zu verhindern helfen, wenn Unterdruck anwenden, um eine hohe Beständigkeit Dichtung zu erhalten. Nach der Pipettenöffnung Polieren sollte etwa 1 &amp; mgr; m sein. </li><li> Halten Sie Pipetten in eine Pipette Vorratsgefäß Schaden und Staubansammlung bis zur Verwendung zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie Perfusionssystem durch Lösungsbehälter füllen und Schläuche nach experimentellen Design. Hinweis: Entfernen Sie Luftblasen aus Schlauch vollständig, da sie stark mit elektrophysiologischen Ableitungen stören. </li><li> Passen Druck zu erreichen ~ 3 ml / min fließen. Hinweis: Hohe Drücke Bewegung des Gewebeschnitts verursachen sowie Beendigung der elektrophysiologischen Ableitungen. </li><li> Übertragen VNO Scheibe zu Abbildungskammer und befestigen Sie die Schnittposition Edelstahlanker mit Kabel mit 0,1 mm dicken synthetic Fasern (2B - C). Hinweis: Nicht die Gewebescheibe bedecken mit einer der Kunstfasergarne, sondern die Agarose die Scheibe umgibt. </li><li> Transfer Imaging - Kammer zur Einrichtung der Aufnahme und kontinuierlich superfuse Scheibe mit Sauerstoff angereichertem S 2 bei Raumtemperatur über eine Bad - Anwendung. </li><li> Stellen Sie die Saug-Kapillare an der Oberfläche der Lösung eine langsame Absaugung für ständigen Austausch von Bad Lösung zu schaffen. Stellen Sie die 8-in-1 Multi-barrel &quot;Perfusion Bleistift&quot; oben und in der Nähe der Nicht-sensorische Teil des VNO Scheibe, die das Blutgefäß (2C, 3A) 50 enthält. Es wird von Vorteil sein Perfusion Bleistift und Aufnahme Pipette zu ordnen aus entgegengesetzten Richtungen gegenüber der Scheibe zu sein. </li><li> Verbinden Referenzelektrode und Badlösung einen L-förmigen Agarbrücke Verwendung (gefüllt mit 150 mM KCl). </li><li> Füllen Sie Patch - Pipette mit Pipettenlösung S 4. </li><li> Montieren Sie die Pipette über das Silberchlorid beschichteten Patch-Elektrode mit der Kopfstufe verbunden, ohne dass die Beschichtung abgekratzt und befestigen fest. </li><li> Mit leichtem Überdruck (etwa 1 ml auf 10 ml Plastikspritze) mit dem Patch-Pipette, bevor Sie das Bad betreten. </li><li> Senken Sie die Pipette in das Bad Mikromanipulatoren mit weit genug , um das Ziel zu versenken , ohne auf sie (2D). </li><li> Monitor - Pipette Widerstand (R pip, zwischen 4-7 M &amp; Omega;) unter Verwendung von Elektro Software auf die Kopfstufe verbunden. Hinweis: Wenn R pip &lt;4 MOhm die Glasspitze gebrochen ist. Wenn R pip&gt; 10 M &amp; OHgr; ist die Spitze wahrscheinlich verstopft , und die Pipette ersetzt werden müssen. </li><li> Visualisieren Sie die VNO Scheibe mit einer CCD-Kamera mit Infrarot-optimierte differentiellen Interferenzkontrast (DIC) und identifizieren FPR-RS3-i-Venus-Zellen, die (oder ähnlich markierten Neuronen) unter Verwendung von Fluoreszenzbeleuchtungund eine entsprechende Filterwürfel. </li><li> Fokus und Ziel fluoreszierende oder nicht fluoreszierende Zellen in Abhängigkeit von experimentellen Design. </li><li> Um den Zellkörper nähern, verwenden Handräder für maximale Empfindlichkeit. Aufgrund der positiven Druck, eine kleine Delle in der Zelle soma Membran sichtbar wird, sobald die Pipettenspitze in der Nähe ist. </li><li> Lassen Sie positiven Druck und mit leichtem Unterdruck zu saugen in der Zellmembran, um eine hohe Widerstands Dichtung (1-20 G &amp; Omega;) zu gewinnen. Tragen Sie kurze und sanfte Saugwirkung die Zellmembran und stellen Sie die Gesamtzellkonfiguration zu stören. </li><li> Überwachen Sie den Zugriff Widerstand ständig während Experiment. Hinweis: Nur umfassen Neuronen zeigen kleine und stabile Zugangswiderstand (≤3% der R - Eingang; Änderung &lt;20% über den Verlauf des Experiments) in Analyse. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das VNO ist eine chemosensorischen Struktur, die Semiochemicals erkennt. Bis heute ist die Mehrheit der vomeronasal Rezeptoren werden deorphanized da nur wenige Rezeptor-Ligand-Paare wurden identifiziert. Unter denen, 58 V1rb2 beschrieben wurde spezifisch durch die männlichen Urin Pheromon 2-Heptanon 30, V2rp5 aktiviert zu werden durch das männliche spezifischen Pheromon ESP1 aktiviert werden 57 sowie V2r1b und V2rf2 SYFPEITHI 48 und SEIDLILGY von den MHC - Peptide aktiviert...

Die meisten Tiere verlassen sich stark auf ihre chemischen Sinne mit ihrer Umgebung interagieren. Der Geruchssinn spielt eine wesentliche Rolle für die Suche nach und das Essen der Bewertung, Räuber und Ortung geeigneten Paarungspartner zu vermeiden. Bei den meisten Säugetieren, besteht das olfaktorische System von mindestens vier anatomisch und funktionell unterschiedlichen peripheren Subsysteme: Haupt Riechepithel 1,2, das Grueneberg Ganglion 3,4, der Septalorgan von Masera 5,6 und das Vomeronasalorgan. Die VNO umfasst die periphere sensorische Struktur des akzessorischen olfaktorischen System (AOS), die bei der Aufdeckung von chemischen Signale eine große Rolle spielt , die 7-10 Informationen über Identität, Geschlecht, sozialen Rang und sexuellen Zustand vermitteln. Das VNO ist an der Basis der Nasenscheidewand direkt über dem Gaumen befindet. Bei Mäusen, ist es ein bilaterales blind endende Rohr in einer knorpeligen Kapsel eingeschlossen 13.11. Die Orgel besteht sowohl aus einem sichelförmigen medialen Sinnes epithelium, die die VSNs und eines nicht-sensorische Teil auf der lateralen Seite beherbergt. Zwischen beiden Epithelien liegt ein Schleim gefüllten Lumen , das 14 in die Nasenhöhle über die schmalen vomeronasal Kanal verbunden ist. Eine große seitliche Blutgefäß in dem nicht-sensorischen Gewebe stellt einen vaskulären Pumpmechanismus Eintritt von relativ großen, meist nicht flüchtigen Moleküle wie Peptide oder kleine Proteine ​​in die VNO Lumen durch Unterdruck 15,16 zu erleichtern. Die Bauteile des VNO sind bei der Geburt vorhanden und das Organ erreicht Erwachsenengröße kurz vor der Pubertät 17. Doch ob das Nagetier AOS bei Jugendlichen bereits funktionsfähig ist , ist noch Gegenstand von 18-20 zu diskutieren. VSNs beide zeichnen sich durch ihre epithelialen Lage und der Art des Rezeptors sie zum Ausdruck bringen. VSNs zeigen eine bipolare Morphologie mit einem unmyelinated Axon und einem einzigen apikalen Dendriten, die in Richtung des Lumens ragt und endet in einem mikrovillösen dendritischen Knopf. VSN axons fasciculate die vomeronasal Nerven zu bilden, die die Knorpelkapsel an der dorso-kaudalen Ende verlässt, steigt entlang der Scheidewand, übergibt die Siebbeinplatte und Projekte mit dem Zubehörriechkolben (AOB) 21,22. Die vomeronasal Sinnesepithel besteht aus zwei Schichten: die apikale Schicht näher an der luminalen Seite befindet und Häfen sowohl V1R- und alle, aber eine Art von FPR-rs-exprimierenden Neuronen. Diese Neuronen koexprimiert die G-Protein - α-Untereinheit G &amp; agr; i2 und Projekt an den vorderen Teil des AOB 23-25. Sensorischen Neuronen befindet sich in den mehr Basalschicht express V2Rs oder FPR-RS1 neben G &amp; agr; o und ihre Axone zu den hinteren Bereich des 26-28 AOB senden. Vomeronasal Neuronen werden durch ziemlich kleine Semiochemicals 29-33 (V1Rs) oder proteinöse Verbindungen 34-38 (V2Rs) , die sezerniert werden in verschiedene Körperflüssigkeiten, wie Urin, Speichel und Tränenflüssigkeit wahrscheinlich aktiviert 37,39-41 </sup&gt;. In situ - Experimente haben gezeigt , dass auch durch VSNs formylierte Peptide und verschiedene antimikrobielle / Entzündung-verknüpften Verbindungen 25,42 sind aktiviert. Darüber hinaus äußerte heterolog FPR-rs - Proteine ​​Agonisten Spektren mit FPR im Immunsystem in jedem Fall teilen, eine mögliche Rolle als Detektoren für Krankheit in Artgenossen oder verdorbene Lebensmittel Quellen angibt , 25 (siehe 43 Referenz). Fundamental zum Verständnis Rezeptor-Ligand-Beziehungen und nachgeschalteten Signalkaskaden in spezifischen VSN Populationen ist eine detaillierte Bewertung ihrer grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften in einer natürlichen Umgebung. In der Vergangenheit hat die Analyse von zellulären Signal stark von gentechnisch veränderten Tieren zugute , die eine definierte Population von Neuronen durch Koexpression ein fluoreszierendes Markerprotein 30,44-49 markieren. In diesem Protokoll eine transgene Mauslinie, die FPR-RS3 zusammen mit einem fluoreszierenden Marker (fPr-RS3-i-Venus) wird zum Ausdruck verwendet.Dieser Ansatz zeigt, wie eine solche genetisch veränderten Mausstamm zu verwenden, um durchführen elektro Analyse einer optisch erkennbaren Zellpopulation mit einzelnen Neurons Patch-Clamp-Aufnahmen in akuten koronaren VNO Gewebeschnitten. Ein Luftdruck getriebene Mehr barrel Perfusionssystem für Sinnesreize und pharmakologische Mittel ermöglicht eine schnelle, reversible und fokale neuronale Stimulation oder Hemmung während Aufnahmen. Ganzzellableitungen in Schnittpräparaten ermöglichen eine detaillierte Analyse der Eigenschaften, der spannungsaktivierte Leitwerte sowie Aktionspotential Entladungsmuster in der natürlichen Umgebung der Zelle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="846">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Chemicals</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agarose (low-gelling temperature)</td>
			<td style="width:133px;">PeqLab</td>
			<td style="width:116px;">35-2030</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ATP (Mg-ATP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">A9187</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">B9879</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">C1016</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">E3889</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glucose</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">G8270</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">GTP (Na-GTP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">51120</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">H3375</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">M8266</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">P9333</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">03564</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S7653</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S5761</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S8045</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Surgical tools and consumables</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Large petri dish, 90 mm</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">decapitation, dissection of VNO capsule</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Small petri dish, 35 mm</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sharp large surgical scissor</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">decapitation, removal of lower jaw</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Strong bone scissors</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting incisors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Medium forceps, Dumont tweezers #2</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">removing skin and palate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting out VNO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">dissecting VNO out of cartilaginous capsule</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Small stainless steel spatula</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">handling agarose block and tissue slices</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Surgical scalpel</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting agarose block into pyramidal shape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Name</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:275px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Amplifier</td>
			<td style="width:133px;">HEKA Elektronik</td>
			<td style="width:116px;">EPC-10</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td>
			<td style="width:133px;">Science Products</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">CCD-camera</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">DFC360FX</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">I3</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">EL6000</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hot plate magnetic stirrer</td>
			<td style="width:133px;">Snijders</td>
			<td style="width:116px;">34532</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Microforge&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Narishige</td>
			<td style="width:116px;">MF-830</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micromanipulator Device&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:116px;">SM-5</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micropipette puller, vertical two-step</td>
			<td style="width:133px;">Narishige</td>
			<td style="width:116px;">PC-10&#160;</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Microscope</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">CSM DM 6000 SP5</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)</td>
			<td style="width:133px;">Quest Scientific</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">HCX APO L20x/1.00 W</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Oscilloscope</td>
			<td style="width:133px;">Tektronik</td>
			<td style="width:116px;">TDS 1001B</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Osmometer&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Gonotec</td>
			<td style="width:116px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Perfusion system 8-in-1</td>
			<td style="width:133px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">pH Meter five easy</td>
			<td style="width:133px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Pipette storage jar</td>
			<td style="width:133px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:116px;">e212</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:116px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Razor blades</td>
			<td style="width:133px;">Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td style="width:116px;">Wilkinson Sword Classic</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:323px;">Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are e.g. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)</td>
			<td style="width:133px;">custom-made</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">S4E</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trigger interface&#160;</td>
			<td style="width:133px;">HEKA Elektronik</td>
			<td style="width:116px;">TIB-14 S</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Vibratome&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">VT 1000 S</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Memmert</td>
			<td style="width:116px;">WNB 45</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Um einen Einblick in die biophysikalischen und physiologischen Eigenschaften von definierten Zellpopulationen zu gewinnen, führen wir akuten koronaren Gewebeschnitten der Maus VNO (Abbildung 1 - 2). Nach der Dissektion Scheiben können in eiskaltem mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung (S 2) für mehrere Stunden gehalten werden. Bei der Aufnahme - Setup, ein ständiger Austausch mit frischem Sauerstoff angereicherten Lösung <s...

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In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.5K Aufrufe.  RWTH Aachen University. Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings. 

Serie: In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Akute erwachsenen Gehirn Slicing in physiologischen Temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...