Yazar agaroz boncuklar kullanarak bölümleri mount öneri konfokal mikroskopi ve Dr. Jian Zhang Çocuk Araştırma Enstitüsü Imaging Core kullanımı kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe DC010387 tarafından finanse edildi.

1. Iç kulakları izolasyon ve sabitleme <ol><li> Corti organı hücresel desenlendirme analizi için, euthanize uygun embriyolar veya yetişkin düzenledi. </li><li> Membranöz iç kulak içeren, otik kapsül parçalara ayır. Fare, bu embriyonik az (E) günlük 14.5 ve üstü, E0.5 vajinal fişi tespit edildiği gün embriyonlar üzerinde kolayca yapılabilir. Otik kapsül Diseksiyon orta hatta ve kafatasının açılması dekapitasyon ilk gerçekleştirilir. (Şekil 1A) her bir kulak maruz beyin çıkarın. İç kulakları sağlam kullanarak forseps (Dumont # 5, Şekil 1B gibi) kabuklu olabilir. Eğer görüntüleme Corti organı, otik kapsül ile ilişkili tüm nöronal ve bağ dokusu dikkatli çıkarılması gerekli değildir. </li><li> 4 nazik sallanan% 4 paraformaldehid daldırma (PFA) tarafından tüm iç kulakları Fix ° C 1.8 ml vidalı kapaklı Nunc Cryo-tüp şişeleri ya da diğer uygun büyüklükte konteyner geceleme. PFA çözüm, GKD 2 0 -20 ° C&#39;de saklanan kadar gerekli taze yapılmış olmalıdır. </li><li> Ertesi gün, üç değişiklik 1X fosfat fiksatif yıkayın tuzlu su (PBS) tamponlu. Işlenmek üzere hazır olana kadar Doku ay gün kadar steril 1X PBS içinde saklanabilir. Yetişkin doku, 4% 10 EDTA (0.27 M) kirecini ° 5 gün boyunca C, durulama ve 1X PBS depolama ile izledi. </li></ol> 2. Kesme vibratome bölümleri <ol><li> 1X PBS% 4 Düşük Erime Noktası agaroz hazırlayın. Agaroz çözüm gelene kadar düşük erime noktası agaroz 1X PBS ve mikrodalga ekleyin. Çözüm üzerinde baloncuk olmadığını özen - periyodik mikrodalga ve karıştırmak için girdap çıkarmak. Kullanıma hazır olana kadar 55 ° C su banyosunda çözüm tutun. </li><li> Forseps kullanarak 1X PBS çözüm ve altındaki bir Peel-A-Way gömme kalıp konumu, iç kulak çıkarın. Pipetleyin uzakta kalıp herhangi bir aşırı 1X PBS. Bol sıvı% 4 Düşük Erime Noktası agaroz (Şekil 2A) ile doku kapağı kalıp doldurun. </li><li> Uygun düzlemde kesit için iç kulak yerleştirin. Ben kafa in situ kalmıştı sanki otik kapsül konumunu AB&#39;ye yakınlaştırılması ve transvers düzlemde kesit Corti organı iyi kesitler elde edilmiştir. E14.5 embriyolar için görünür lateral yarı dairesel kanal (Şekil 2B), yanal görülüyor böylece yetişkin, konumu, iç kulak. Otik kapsül arka tarafında oluşan çizgi kesit (Şekil 2A, B) amaçlanan uçaktan 45 derecelik bir açıyla yaklaşık böylece iç kulak Açısı. Otik kapsül otik kapsül dorsal bölümünün üst kısmında yer alır, böylece görüntülendiğinde, koklea bazal kıvrımı alt (ok ucu, Şekil 2B) bulunan ve ön yarı dairesel kanal (Artan) olmalıdır üst (Şekil 2B). </li><li> Agaroz 30 dakika içinde RT koyacaktır. Transferi Peel-Away kalıpları ° C bölümüne hazır olana kadar 4 gömülü doku içeren. Kesit, bir sonraki güne kadar ertelendi olacaksa, 1X PBS 1X PBS batırılmış nemli kağıt havlu içeren bir kutu içinde kalıp ve mağaza agaroz kapsayacak şekilde ekleyin. </li><li> Plastik kalıp uzakta soyun. Bir jilet kullanarak, iç kulak dokusu içeren bir agaroz kutusu kesti. Düzlemine bölümünde agaroz blok aşağıya yapıştırılmış olduğu yüzey olacak blok karşı tarafında, düz ve paralel olmasını sağlamak için özen gösterin. Agaroz doku sızmak olmadığından, doku iyi desteklenmiş olacak, böylece, doku dört bir yanından gelen çok agaroz Döşeme yok. </li><li> Kesim yüzeyi blok eklemek superglue kullanın. </li><li> Vibratome 40 ila 100 mikron kalınlığında Bölüm. 1X PBS,% 0.1 TritonX-100 ile dolu bir doku kültürü çanak bölümleri kaydedin. Şekil koklear spiral aracılığıyla bir temsilci bölümünde gösterilmiştir. 2C. </li><li> Forseps doku agaroz incelemek için kullanın. Agaroz dokuya penetre olmaz, ama sadece iç kulakta dış yüzeyine yapışmış olacak. </li><li> İsterseniz, havuz, agaroz-kesitli doku doku aşırı kesme önlemek için büyük bir delik açılmasıyla pipetlemeyin kullanarak. Veya 24-iyi doku kültürü çanak çok farklı dokular üzerinde birden fazla antikor lekeleri performans, bölümleri, 16 organize edilebilir. </li></ol> 3. Antikor boyama vibratome bölümleri Antikor leke ile devam edin. Bütün montaj Süreç bölümleri, serbest yüzen bir çözüm. Aşağıda Corti organı ayağı hücrelerinin S100 işaretleyici için bir örnek antikor boyama protokolü, ancak protokol herhangi bir antikor için kullanılabilir. Tüm yıkar, aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında yapılır. <ol><li> 30 dakika boyunca çok iyi doku kültürü çanak, PBT nazik sallanan (1X PBS,% 1 sığır serum albumin,% 0.1 Triton X-100) ile serbest bölümler kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Eski çözüm ve blok serbest fl kapalı pipetleyin30 dakika, PBT + normal keçi serumu hafif sallanan (50 ul NGS / 1 ml PBT) bölümleri oating. </li><li> Eski çözüm kapalı pipetleyin ve PBT + NGS (PBT + NGS S100 1:200 dilüsyon) seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Gece 4 ° C&#39;de nazik sallanan. </li><li> Primer antikor çözümü kapalı pipetleyin. 5 dakika 3X yıkayın. PBT, 4X, 30 dakika. PBT ile. </li><li> PBT + NGS Blok, 30 dakika. </li><li> PBT + NGS sulandırılmış floresan konjuge sekonder antikoru (keçi yetiştirilen) ile inkübe edin. 4 gece boyunca inkübe ° C, ya da bir kaç saat, RT, nazik sallanan. </li><li> Sekonder antikor çözüm kapalı pipetleyin. , 5 dakika yıkayın 3X, 4X, 30 dakika. PBT ile. </li><li> Son PBT kapalı pipetleyin yıkayın ve bir nükleer counterstain içeren sulu uygun montaj orta ile değiştirin. </li></ol> 4. Slaytlar ve konfokal mikroskobi montaj bölümleri Lamel ile kalınlığında kesitler kırma önlemek için, ayrı ayrı bölümlerin monte ederken, bir spacer mikroskop slayt ve lamel arasında takılı olmalıdır. Aşağıda kalın vibratome bölümleri montaj iki alternatif yöntemler şunlardır: <ol><li><ol type="a"><li> Bir boşluk, bir vakum gres jant doku bölümü etrafında bir kare koyarak oluşturulabilir. Böylece, lamel koyan, lamel kenarlarında vakum gres ile kapatılmış olacak. Slayt üzerine sıkı bir şekilde uyması için başparmak ile lamel kenarlarını bastırın. Vakum gres lamel tüm kenarlarında düzgün ve yeknesak mevcut ise, slayt, ters bir konfokal mikroskop kullanım için yeteri kadar mühürlü olacaktır. </li><li> Alternatif olarak, bir spacer bilinen mesh boyutu agaroz kromatografisi reçine (Affi-Gel Blue Jel, Bio-Rad) kullanılarak oluşturulabilir. Pipetleyin 1 lamel alınacaktır dört bir köşesinden her mikroskop lamı üzerine reçine ul. Reçine dört nokta ortasına pipetleyin bir doku bölümü ve montaj medya. Lamel. Eğer ters bir konfokal mikroskop kullanılarak, oje kullanılarak mikroskop lamı üzerine lamel mühür. </li></ol></li><li> Konfokal mikroskopi kullanılarak boyandı vibratome dilim optik bölümleri alın. Corti organı içinde çeşitli hücre tipleri ölçmek için, tanımlanmış bir adım boyutu (1,5 ve 3 mikron arasında) z-yığını edinin. Bölüm 3.8) (adım nükleer bir boya ile karşı-lekeli olmalıdır. Görüntüler konfokal görüntü toplandıktan sonra herhangi bir bilgisayar ekranından kontrol edilebilir. Hücreler görüntüler z yığın içinde sırayla incelenir manuel olarak çekirdeklerin görünüm ve ortadan kalkması gözlemleyerek sayılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Ayağı ve Deiters hücreleri bulunan ve nükleer bir boya (Şekil 3A-F) ile zıt S100 protein, lekeli bir vibratome bölümü aracılığıyla bir temsilci konfokal z yığını. Her panel panel, 3 mikron adımları alınan konfokal görüntü konfokal görüntü vibratome bölümünde F vibratome bölüm içinde en içten elde konfokal görüntü ve panel yüzeyine yakın aldı. Corti organı morfolojisi minimal kesintiye görünür. Özellikle, ayağı hücrelerinin sitoplazmik uzantıları kırık değil. Z-yığını (Şekil 3A 3F ile) aracılığıyla ayağı hücre çekirdeğinin görünüm ve ortadan kalkması belirterek, hem iç ve dış ayağı hücre sayısı (- F numaralandırma, Şekil 3A) sayılabilir. Konfokal görüntü başına her hücre tipi sayısının az olması nedeniyle, bu yaklaşım içinde en fazla hücre tipleri Corti organı saymak için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 bozulmamış, 15 hafta, yetişkin iç kulakları otik kapsül kaplı. (A) sağ otik kapsül (köşeli ayraç), beyin çıkarıldıktan sonra, kafasının içinde bir noktadan bakıldığında, kafatası kaplı. Anterior hakkı. (B) Bozulmamış, 15 hafta eski iç kafatası diseksiyonu sonra kulakları. Sol iç kulak lateral yüzeyinde görünür; sağ iç kulak medial yüzeyi görünür. Etiketler ön yarı dairesel kanal (asc), eş (koklea) ve ow (oval pencere) yerleri gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 (A) Tüm Peel-Away kalıp merkezi agaroz gömülü 15 hafta eski bir yetişkin, iç kulak . Bölümünde amaçlanan düzlemde gösterilir. Gömülü önce 15 hafta, bütün iç kulak (B) Close-up görüntü. Membranöz labirent daha net bir izlenenler böylece çevresindeki kemiğin bir kısmı uzakta diseke edilmiştir. Yanal yarı dairesel kanal (LSC), ön yarı dairesel kanal (Artan) ve koklea (co) (beyaz eğrileri) izlenmektedir. Bazal açmak ve koklea (ok ucu) bölümü (kesikli çizgi) amaçlanan düzlemde gösterilir. (C) Temsilcisi Cross-koklea yoluyla bölümü. Koklear kanal aracılığıyla bir kesit, Corti organı (oC) kutulu, stria vascularis (sv), parantez içine alınmış olan ve Reissner membran (Rm) gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 P21 at yabani tip fare Corti organı. Bir ayağı hücreleri ve Deiters görselleştirmek için Corti S100 antikor lekeli organ üzerinden 3 mikron adım boyutu, &#39;hücrelerinde (AF) Sıralı konfokal serisi. Serinin sonuna kadar başından itibaren iç ve dış ayağı hücreleri sayar numaralı. Kısaltmalar: İHK (iç saç hücresi), aIHC (komşu iç saç hücresi), OHC (dış saç hücresi), Bilgisayar (ayağı hücre), DC (Deiters &#39;hücre).

<ol>
	<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li><li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision.">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li><li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development.">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li><li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish.">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li><li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish.">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li><li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty2,+a+mouse+deafness+gene,+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling.">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li></ol>

Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, Wisconsin IACUC Tıp Koleji tarafından belirlenen kurallara ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Immünhistokimya ve konfokal görüntüleme ile takip vibratome kesit, prosedür, minimal doku hasarı ile Corti organı görselleştirme sağlar. Açıkçası, vibratome bölümünde iç bölgelerinden alınan konfokal görüntüler sadece fiksasyon eserler ile sınırlıdır hücresel morfoloji mükemmel koruma göstermektedir. Ara sıra ayağı hücrelerinin sitoplazmik uzantıları sonları gibi hücresel kesintileri, (gösterilmemiştir) gözlemlenmesine rağmen yakın bir vibratome bölümü iki kesim yüzeyleri alınan Konfokal resimler, genellikle iç bölgelerden gelen görüntülerden ayırt edilemez. Bu yaklaşım, basit, ve en önemli ekipman ürün - vibratome makine ve konfokal mikroskop - genellikle, çoğu araştırmacı için ulaşılabilir ortak ekipman öğelerdir. Buna ek olarak, bu yaklaşım Corti organı spesifik boyanması gösteren herhangi bir antikor için kullanılabilir. Gerçekten de, bu yaklaşımın temel sınırlama antikor özgüllüğü ve bu protokolün 3. adıma değişiklikler belirli bir antikor spesifik boyanması sonucu olduğundan emin olmak için gerekli olabilir. Özet olarak, basit bir yöntemle, herhangi bir antikor genellenememektedir ve Corti organı hücresel organizasyonun maksimum korunması ve analiz sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Leica Blade Mikrotom Titreşimli VT1000S </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 lazer tarama konfokal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Öğrenci Dumont # 5 Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Düşük Erime Noktası Agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way gömme kalıp </td><td> Polysciences </td><td> 18.986 veya 18646A </td><td></td></tr><tr><td> sığır serum albumini </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> Keçi Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 keçi anti-tavşan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11.036 </td><td> 1:1000 dilüsyon </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> vakum gres </td><td> Balıkçı </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel Mavi Jel </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning for enhanced preservation of the cytoarchitecture of the mammalian organ of corti

Corti memeli organı mechanosensory saç ve nonsensory destekleyici hücrelerin yüksek sipariş hücresel bir mozaik (1,2 gözden) bu hücresel mozaik Görselleştirme Corti organı genellikle kesitli olmasını gerektirir. Özellikle, çekirdekleri dorsalde saç hücreleri ile ilgili bulunmaktadır nonsensory ayağı ve Deiters hücreleri, Corti organı kesit alma görüntülendi olamaz. Ancak, sütun ve Deiters hücreleri ince sitoplazmik süreçleri de dahil olmak üzere, memeli Corti organı hassas hücre mimarisini, standart immünohistokimyasal boyama teknikleri ile uyumlu, parafin ve cryo-kesit gibi rutin histolojik prosedürleri korumak için zordur. İşte ben konfokal mikroskobu ile takip koklea, tüm montaj bu vibratome bölümlerde immünohistokimyasal kesit vibratome oluşan basit ve sağlam bir prosedür açıklanmaktadır. Bu prosedür, fare bacak tomurcuk, zebrafish bağırsak, karaciğer, pankreas, ve kalp (seçilen örnekler için bkz: 3-6) de dahil olmak üzere birçok organı, immunhistochemical analizi için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Buna ek olarak, bu yordamı Corti embriyo ve yetişkin farelerin 7 hem de mutant ve kontrol organları ayağı hücre sayısı hem de görüntüleme ve quantitificaton sucessful. Bu yöntem, ancak, şu anda yaygın olarak Corti memeli organı incelemek için kullanılan değildir. Corti yetişkin organ ince hücre mimarisini gelişmiş koruma sağlamak ve çeşitli hücre tipleri ölçümü için izin hem de bu işlem için potansiyel açıklanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti at JoVE.com

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.

Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.2K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin. Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.

Video: Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Memeli MSS Optik Sinir transeksiyonu sonra Deneysel İşlemler Yöntemleri

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Nörobilim

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Görselleştirme düzleştirilmiş memeli Cortices'deki kortikal modülleri

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Subaraknoid kanama, bir fare modeli serebral Vasospasm miktar hacimsel bir yöntemi

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...