Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.

Entzündliche Caspasen umfassen Caspase-1, -4, -5, -11 und -12 und gehören zur Untergruppe der Initiator-Caspasen. Caspase-1 ist erforderlich, um eine korrekte Regulation der Entzündungssignale zu gewährleisten und wird durch näherungsinduzierte Dimerisierung nach der Rekrutierung zu Inflammasomen aktiviert. Caspase-1 ist in der monozytären Zelllinie reichlich vorhanden und induziert die Reifung der entzündungsfördernden Zytokine Interleukin (IL)-1β und IL-18 zu aktiven sezernierten Molekülen. Die anderen entzündlichen Caspasen, Caspase-4 und -5 (und ihre murine homologe Caspase-11) fördern die IL-1β-Freisetzung durch Induktion von Pyroptose. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) ist ein Werkzeug zur Messung der entzündlichen Caspase-induzierten Nähe als Auslesung der Caspase-Aktivierung. Die Caspase-1-, -4- oder -5-Prodomain, die die Region enthält, die an das Inflammasom bindet, ist mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des gelben fluoreszierenden Proteins Venus (Venus-N [VN] oder Venus-C [VC]) verschmolzen, die sich mit der Reform des fluoreszierenden Venuskomplexes verbinden, wenn die Caspasen induzierte Nähe erfahren. Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Reporter mittels Nukleofektion in primäre humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (MDM) eingeführt werden, die Zellen behandeln, um eine entzündliche Caspase-Aktivierung zu induzieren, und die Caspase-Aktivierung mittels Fluoreszenz und konfokaler Mikroskopie messen. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er verwendet werden kann, um die Komponenten, Anforderungen und Lokalisation des entzündlichen Caspase-Aktivierungskomplexes in lebenden Zellen zu identifizieren. Es müssen jedoch sorgfältige Kontrollen in Betracht gezogen werden, um die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen nicht zu beeinträchtigen. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse dynamischer Caspase-Interaktionen auf Inflammasomenebene sowie für die Abfrage der entzündlichen Signalkaskaden in lebenden MDM und Monozyten, die aus menschlichen Blutproben stammen.

Die Caspasen sind eine Familie von Cystein-Aspartat-Proteasen, die in Initiator-Caspasen und Scharfrichter-Caspases gruppiert werden können. Scharfrichter-Caspasen umfassen Caspase-3, -6 und -7. Sie kommen natürlicherweise in Zellen als Dimere vor und werden von den Initiator-Caspasen gespalten, um Apoptose¹ auszuführen. Initiator-Caspasen umfassen menschliche Caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 und -12. Sie werden als inaktive Zymogene (Pro-Caspasen) gefunden, die durch näherungsinduzierte Dimerisierung aktiviert und durch autoproteolytische Spaltung stabilisiert werden ^2,3. Die entzündlichen Caspasen sind eine Teilmenge der Initiator-Caspasen² und umfassen Caspase-1, -4, -5 und -12 beim Menschen sowie Caspase-1, -11 und -12 bei Maus ^4,5. Sie spielen keine apoptotische Rolle, sondern eine zentrale Rolle bei Entzündungen. Sie vermitteln die proteolytische Verarbeitung und Sekretion von Pro-Interleukin (IL)-1β und Pro-IL-18^6,7, den ersten Zytokinen, die als Reaktion auf^pathogene Eindringlinge ^8,9 freigesetzt werden. Caspase-1 wird bei der Rekrutierung für seine Aktivierungsplattform aktiviert; ein Proteinkomplex mit hohem Molekulargewicht, der als Inflammasom bezeichnet wird (Abbildung 1A)¹⁰. Die Dimerisierung von Caspase-4, -5 und -11 erfolgt unabhängig von diesen Plattformen durch einen nicht-kanonischen Inflammasom-Weg^11,12.

Kanonische Inflammasomen sind zytosolische multimere Proteinkomplexe, die aus einem Inflammasom-Sensorprotein, dem Adapterprotein ASC (Apoptose-assoziiertes Speck-ähnliches Protein, das eine CARD enthält) und dem Effektorprotein Caspase-1¹⁰ bestehen. Die am besten untersuchten kanonischen Inflammasomen sind die NOD-ähnliche Rezeptorfamilie, die eine Pyrindomäne (NLRP), NLRP1 und NLRP3 enthält, die NLR-Familie, die eine CARD (NLRC), NLRC4 enthält, und die fehlenden in Melanom 2 (AIM2). Sie enthalten jeweils eine Pyrindomäne, eine CARD oder beide Domänen. Die CARD-Domäne vermittelt die Interaktion zwischen CARD-haltigen Caspasen und ihren Upstream-Aktivatoren. Daher wird das Gerüstmolekül ASC, das aus einer N-terminalen Pyrindomäne (PYD) und einem C-terminalen CARD-Motiv 13,14 besteht, für die Rekrutierung von Caspase-1 zu den NLRP1 10-^, NLRP3 15- und AIM2 ^{16-Inflammasomen} benötigt.

Jedes Inflammasom ist nach seinem einzigartigen Sensorprotein benannt, das unterschiedliche entzündungsfördernde Reize erkennt (Abbildung 1B). Aktivatoren dieses Pfades werden als kanonische Reize bezeichnet. Inflammasomen dienen als Sensoren für mikrobielle Komponenten und Gewebestress und lösen durch Aktivierung der Entzündungskaspasen eine robuste Entzündungsreaktion aus¹⁷. Die Inflammasom-Assemblierung initiiert die Caspase-1-Aktivierung, um die Reifung und Sekretion ihrer Hauptsubstrate pro-IL-1β und pro-IL-18 zu vermitteln. Dieser Prozess erfolgt über einen zweistufigen Mechanismus. Erstens reguliert ein Priming-Stimulus die Expression bestimmter Inflammasom-Proteine und Pro-IL-1β durch Aktivierung des NF-κB-Signalwegs. Zweitens induziert ein intrazellulärer (kanonischer) Reiz die Inflammasom-Assemblierung und Rekrutierung von Prochasase-1 ^6,7.

Caspase-4 und Caspase-5 sind die menschlichen Orthologe der murinen Caspase-11¹¹. Sie werden inflammasomenunabhängig durch intrazelluläres Lipopolysaccharid (LPS), ein Molekül, das in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien^18,19,20 vorkommt, und durch extrazelluläres Häm, ein Produkt der Hämolyse roter Blutkörperchen ^21, aktiviert. Es wurde vorgeschlagen, dass LPS direkt an das CARD-Motiv dieser Proteine bindet und ihre Oligomerisierung induziert²⁰. Die Aktivierung von Caspase-4 oder Caspase-5 fördert die IL-1β-Freisetzung, indem sie eine entzündliche Form des Zelltods namens Pyroptose durch Spaltung des porenbildenden Proteins Gasdermin D (GSDMD) ^18,19 induziert^. Darüber hinaus induziert der Ausfluss von Kaliumionen, die aus Caspase-4 und GSDMD-vermitteltem pyroptotischem Tod resultieren, die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms und die anschließende Aktivierung von Caspase-1^22,23. Daher gelten Caspase-4, -5 und -11 als intrazelluläre Sensoren für LPS, die in der Lage sind, Pyroptose und Caspase-1-Aktivierung als Reaktion auf spezifische Reize^11,24 zu induzieren.

Abbildung 1: Entzündliche Caspasen und Caspase-bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC) Assay. (A) Diagramm des Caspase-BiFC-Systems, bei dem zwei Caspase-1-Prodomänen (C1-pro), die mit jedem nicht-fluoreszierenden Fragment der Venus (Venus-C oder Venus-N) verbunden sind, für die NLRP3-Aktivierungsplattform rekrutiert werden, wodurch die Venus gezwungen wird, sich zu verformen und zu fluoreszieren. Dieser Komplex erscheint als grüner Fleck unter dem Mikroskop und dient als Auslese für entzündliche Caspase-induzierte Nähe, die der erste Schritt bei der Aktivierung der Initiator-Caspase ist. (B) Schematische Darstellung der Domänenorganisation von Inflammasom-Komponenten und entzündlichen Caspasen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Messung der Aktivierung spezifischer Initiatorkaspasen ist schwierig, und es gibt nicht viele Methoden, um dies durch bildgebende Ansätze zu tun. Die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) von Caspase kann verwendet werden, um die entzündliche Caspase-Aktivierung direkt in lebenden Zellen sichtbar zu machen (Abbildung 1A)²⁵. Diese Technik wurde kürzlich für den Einsatz in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) ^angepasst21. Caspase BiFC misst den ersten Schritt in der entzündlichen Caspase-Aktivierung, induzierte Nähe, um die Dimerisierung zu erleichtern. Es wird die Expression von Plasmiden verwendet, die für die CARD-haltige Caspase-Prodomain kodieren, die mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des photostablen gelben fluoreszierenden Proteins Venus (Venus-C [VC]) und Venus-N [VN] verschmolzen sind. Wenn die beiden Caspase-Prodomänen für ihre Aktivierungsplattform rekrutiert werden oder induzierte Nähe erfahren, werden die beiden Venushälften in die Nähe gebracht und gezwungen, sich umzuformen und zu fluoreszieren (siehe Abbildung 1A,B). Dies bietet eine Echtzeit-Anzeige der spezifischen entzündlichen Caspase-Aktivierung.

Humanes MDM exprimiert reichlich Inflammasom-Gene und Mustererkennungsrezeptoren, die Gefahrensignale und pathogene Produkte identifizieren. Dies bietet einen idealen Zelltyp für die Abfrage von entzündlichen Caspasebahnen. Darüber hinaus können sie aus peripherem Blut und sogar aus Patientenproben gewonnen werden, um die entzündliche Caspase-Aktivierung in einem bestimmten Krankheitszustand zu beurteilen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die BiFC-Caspase-Reporter mit Nukleofektion, einer auf Elektroporation basierenden Transfektionsmethode, in MDM eingeführt werden, wie die Zellen behandelt werden, um eine entzündliche Caspase-Aktivierung zu induzieren, und wie die aktiven Caspase-Komplexe mit mikroskopischen Ansätzen sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus kann diese Methodik angepasst werden, um die molekulare Zusammensetzung dieser Komplexe, die subzelluläre Lokalisation, die Kinetik und die Größe dieser hochgeordneten Strukturen^{zu bestimmen 25,26,27}.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung des Baylor College of Medicine für die Manipulation menschlicher Proben. Blutproben werden gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien für menschliche Proben behandelt. Blutproben werden in einer regionalen Blutbank entnommen, wo sie mit Citratphosphatdextrose (CPD) -Lösung entnommen werden. Blut, das mit anderen Antikoagulanzien wie Natriumheparin, Lithiumheparin oder EDTA gesammelt wird, kann jedoch auch für dieses Protokoll^28,29 verwendet werden.

1. Isolierung menschlicher Monozyten und Differenzierung in Makrophagen

1. Erhalten Sie antikoaguliertes Blut von de-identifizierten gesunden Personen in einer regionalen Blutbank und isolieren Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs), wie unten angegeben.
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durch. Verwenden Sie nur sterile Schläuche und tragen Sie Handschuhe. Fügen Sie bei der Entsorgung 10% Bleichmittel zu allen blutbezogenen Produkten hinzu. Steriles PBS (1x) oder DPBS (ohne Ca²⁺ und Mg²⁺) kann austauschbar verwendet werden.
   1. Bereiten Sie den Verdünnungspuffer vor: Ergänzen Sie 1x steriles PBS mit 2% FBS und 0,5 mM EDTA.
   2. Bereiten Sie das Kulturmedium vor: Ergänzen Sie RPMI-1640 Medium mit FBS (10% (v / v)), Glutamax (2 mM) und Penicillin / Streptomycin (50 I.E./50 μg/ml)
   3. Vorkühlen Sie den laufenden Puffer (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   4. Vollblut mit zwei Volumina Verdünnungspuffer verdünnen. Übertragen Sie mit einer serologischen Pipette 15 ml des antikoagulierten Blutes auf ein 50-ml-Röhrchen, das 30 ml des Verdünnungspuffers enthält. Sanft durch Inversion mischen.
   5. Für jeweils 10 ml Vollblut oder 30 ml verdünntes Blut 15 ml des Dichtegradientenmediums zu einem leeren Röhrchen von 50 ml hinzufügen.
   6. Das Dichtegradientenmedium aus Schritt 1.1.5 wird mit einer serologischen Pipette von 25 ml langsam und stetig mit 30 ml verdünntem Blut beschichtet. Halten Sie die Spitze der Pipette in einem geneigten Winkel an der Wand des Rohrs und des Rohrs.
   7. Bringen Sie die Schläuche vorsichtig in eine Schwenkschaufelzentrifuge. Vermeiden Sie es, die beiden Phasen zu stören. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) für 25 Minuten mit Beschleunigung und Verzögerung auf den Mindestwert.
   8. Entfernen Sie vorsichtig die obere (klare) Plasmaschicht mit einer 10 ml Pipette und entsorgen Sie sie in einem Behälter mit Bleichmittel (10%).
   9. Sammeln Sie die Interphasenschicht (weiß) peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs, Abbildung 2) mit einer 10-ml-Pipette und übertragen Sie sie in eine frische 50-ml-Röhre. Kombinieren Sie die weiße Schicht aus verschiedenen Röhrchen desselben Spenders in einer 50-ml-Röhre bis zu 30 ml.
   10. Jedes Röhrchen mit dem Verdünnungspuffer aus Schritt 1.1.1 auf ein Gesamtvolumen von 50 ml bringen und 10 min bei 300 x g und 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer 10 ml Pipette und entsorgen Sie ihn in einem Behälter mit Bleichmittel (10%).
   11. Resuspendiert jedes Zellpellet in 1 ml des vorgekühlten Laufpuffers aus Schritt 1.1.3 mit einer p1000-Mikropipette. Kombinieren Sie Zellsuspensionen desselben Spenders in einer neuen 15-ml-Röhre. Bringen Sie das Volumen jeder Röhre auf 15 ml mit vorgekühltem Laufpuffer und mischen Sie gut durch Inversion.
   12. Nehmen Sie ein 20 μL Aliquot der Zellsuspension aus Schritt 1.1.11 und bereiten Sie eine 1:100-Verdünnung mit 1x sterilem PBS vor. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
   13. Die Zellsuspension aus Schritt 1.1.11 wird bei 300 x g und 4 °C für 10 min zentrifugiert und der Überstand mit einer 10 ml Pipette entfernt. Verwenden Sie bei Bedarf eine p200-Mikropipette, um den Überstand vollständig zu entfernen.
   14. Resuspendieren Sie die isolierten PBMCs in 80 μL vorgekühltem MACS-Laufpuffer für jeweils 1 x 10⁷ Zellen und addieren Sie bis zu einem Maximum von 800 μL des Puffers.
   15. Fügen Sie 20 μL anti-humane CD14-Mikrokügelchen pro 1 x 10⁷ Zellen oder bis zu 100 μL pro Blutprobe (~ 100 ml unverdünntes Blut) hinzu. Durch Inversion gut mischen und 20 min mit kontinuierlichem Mischen bei 4 °C auf einen Rohrrotator legen.
   16. Entnehmen Sie die Proben aus dem Röhrchenrotator, fügen Sie 10 ml vorgekühlten Laufpuffer zu jedem Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 x g (Beschleunigung = 5, Verzögerung = 5) und 4 °C für 10 min.
   17. Entfernen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette und resuspendieren Sie bis zu 1 x 10 8 Zellen in 500 μL vorgekühltem Laufpuffer (2 x 10⁸ / ml).
   18. Führen Sie die Isolierung von CD14-positiven Zellen durch Magnetzellensortierung mit einem manuellen oder automatisierten System (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
   19. Nehmen Sie ein 20 μL Aliquot der Zellsuspension aus Schritt 1.1.18 nach CD14-positiver Selektion und bereiten Sie eine 1:100-Verdünnung mit 1x sterilem PBS vor. Bestimmen Sie die Zellzahl, indem Sie die Zellen auf einem Hämozytometer zählen.
   20. Zentrifugieren Sie die CD14-positiven Zellen bei 300 x g und RT für 10 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette oder einem Vakuumsystem.
   21. Resuspendiert das Zellpellet aus Schritt 1.1.20 in vorgewärmtem Kulturmedium von Schritt 1.1.2 bis zu einer endgültigen Zelldichte von 1 x 10⁷ Zellen/ml.
2. Säen Sie die isolierten CD14-positiven Monozyten bei einer Zelldichte von 5 x 10⁶ Zellen.
   1. Auf einer 10 cm großen Gewebekulturschale werden 10 ml Kulturmedium aus Schritt 1.1.2 zugegeben, ergänzt durch 50 ng/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF).
   2. 0,5 ml der Zellsuspension aus Schritt 1.1.21 tropfenweise in das Kulturmedium geben und die Platte vorsichtig schwenken. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂) über Nacht.
   3. Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium mit einem Vakuumsystem, um Zellen zu entfernen, die sich nicht über Nacht angelagert haben. 10 ml frisches Kulturmedium ergänztes GM-CSF (50 ng/ml) zugeben und Zellen in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂) für 7 Tage inkubieren, um eine vollständige Differenzierung zu ermöglichen (siehe Abbildung 3A zum Auftreten von CD14+-Monozyten in verschiedenen Stadien der Differenzierung in GM-CSF ). Tauschen Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage aus und ergänzen Sie es jedes Mal mit frischem GM-CSF (50 ng/ml).

Abbildung 2: Schematische Übersicht über den experimentellen Workflow. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Herstellung von Elektroporationskomponenten

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für eine 10 μL-Neonspitze (Table of Materials) ausgelegt. Verwenden Sie für jede Transfektion 1-2 x 10⁵ Zellen. Es wird empfohlen, transfizierte Zellen auf einer 48-Well-Platte oder 8-Well-Kammerschale (10 μL-transfizierte Zellen pro Well) zu säen. 1x sterile DPBS (ohne Ca 2+ und Mg²⁺) können anstelle von PBS verwendet werden.

1. Bereiten Sie am Tag 7 antibiotikafreies Medium vor, indem Sie RPMI-1640-Medium mit FBS (10 % (v/v)) und Glutamax (2 mM) ergänzen.
2. Geben Sie serumfreies RPMI-1640-Medium, Trypsin-EDTA-Lösung (0,25%), 1x steriles PBS (ohne Ca 2+ und Mg²⁺) und komplettes Kulturmedium aus Schritt 1.1.2 in ein 37 °C warmes Wasserbad.
3. Bei Verwendung von Glasbodenschalen (für konfokale Mikroskopie) beschichten Sie das Geschirr mit Poly-D-Lysinhydrobromid.
   1. Eine 8 gut gekammerte Schale mit 200 μL Poly-D-Lysinhydrobromid (0,1 mg/ml in 1x sterilem PBS) bestreichen und 5 min bei RT inkubieren.
   2. Die Poly-D-Lysinlösung absaugen und das Glas einmal mit 1x sterilem PBS waschen. Aspirieren Sie die PBS und fahren Sie mit Schritt 2.4 fort.
4. Fügen Sie 200 μL antibiotikafreies Medium pro Vertiefung der 48-Well-Platte oder der 8-Well-Chambered-Schale hinzu und inkubieren Sie in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO₂) vor, bis Sie bereit sind, die transfizierten Zellen zu platten.

3. Vorbereitung von Zellen für die Elektroporation

HINWEIS: Die Ausbeute an MDM aus einer 10 cm Schale am Ende der 7-tägigen Differenzierungsperiode beträgt ca. 1,5 x 10⁶ Zellen. 1x sterile DPBS (ohne Ca 2+ und Mg²⁺) können anstelle von PBS verwendet werden. Dieses Protokoll wurde so optimiert, dass sich die meisten Makrophagen unter Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Integrität der Zellen von der Platte lösen. MDM lassen sich nur schwer von Zellkulturplatten lösen. Daher kann es notwendig sein, die Schritte 3.2 und 3.3 zweimal auszuführen, um die Zellen zu dissoziieren. Stellen Sie sicher, dass jede Inkubationszeit mit Trypsin-EDTA (0,25%) 5 Minuten nicht überschreitet.

1. Saugen Sie die Medien aus vollständig differenzierten Makrophagen auf 10 cm Geschirr und waschen Sie die Zellmonoschicht mit warmem, serumfreiem RPMI-1640-Medium. Stellen Sie sicher, dass Sie das Medium vollständig entfernen.
2. Die Zellen werden durch Zugabe von 2 ml warmer Trypsin-EDTA (0,25%) -Lösung pro 10 cm Schale geerntet und in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂) für 5 min inkubiert.
3. Vervollständigen Sie die Zellablösung, indem Sie die Trypsin-EDTA-Lösung (0,25%) vorsichtig über die gesamte Schalenfläche mit einer p1000-Mikropipette auf und ab pipettieren. Die Zellsuspension wird auf ein 15 ml konisches Röhrchen übertragen, das 5 ml warmes Vollkulturmedium aus Schritt 1.1.2 enthält.
4. Bringen Sie die Schale zu einem Hellfeldmikroskop und prüfen Sie in verschiedenen Sichtfeldern auf Zellablösung. Wenn noch eine beträchtliche Anzahl von Zellen angeschlossen ist, wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.3.
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 x g für 5 min bei RT.
6. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml 1x sterilem PBS, vorerwärmt auf 37 °C. Nehmen Sie ein 20 μL Aliquot, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer zu bestimmen.
7. Nehmen Sie 1-2 x 10⁵ Zellen pro beabsichtigter Transfektion und legen Sie sie in eine 15 ml Röhre. Mit vorgewärmtem 1x sterilem PBS auf ein Endvolumen von 15 ml bringen. Zentrifuge bei 250 x g für 5 min bei RT.
8. Das PBS absaugen und noch einmal für 1 min bei 250 x g zentrifugieren. Entfernen Sie alle PBS-Reste mit einer p200-Mikropipette aus dem Zellpellet.

4. Nukleofektion von Caspase-BiFC-Komponenten in humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls wird mit dem Neon Transfection System (Table of Materials) durchgeführt. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Transfekt von 1-2 x 10⁵ Zellen mit einer 10 μL Neonspitze (Table of Materials). Wenn Sie eine 100 μL Neonspitze verwenden, skalieren Sie entsprechend nach oben. Vermeiden Sie es, Zellen länger als 15 Minuten dem Respensionspuffer R auszusetzen, da dies die Zelllebensfähigkeit und die Transfektionseffizienz verringern kann.

1. Verdünnen Sie das Reporterplasmid (d. h. mCherry oder dsRedmito bei 100 ng / μL) in nukleasefreiem Wasser oder 0,5x TE-Puffer, um die transfizierten Zellen sichtbar zu machen.
2. Die Caspase-BiFC-Plasmide werden in nukleasefreiem Wasser oder 0,5x TE-Puffer auf eine geeignete Konzentration verdünnt, so dass das Gesamtvolumen der Plasmide 30 % des gesamten Transfektionsvolumens von 10 μL (d. h. 300 ng/μL C1 Pro-VC und 300 ng/μL C1 Pro-VN) nicht überschreitet.
3. Bereiten Sie ein steriles Mikroröhrchen von 1,5 ml pro beabsichtigter Transfektion vor und fügen Sie die entsprechende Menge an Reporterplasmid (d. h. 50 ng oder 0,5 μL) und Caspase-BiFC-Plasmiden (d. h. 300 ng oder 1 μL C1 Pro-VC und 300 ng oder 1 μL C1 Pro-VN-Fragment) hinzu. Bewahren Sie die Mikroröhrchen jederzeit in der Haube auf.
4. Legen Sie die Pipettenstation, das Gerät, die Spitzen, die Elektroporationsröhrchen und die Pipette in eine sterile Laminar-Flow-Haube.
   HINWEIS: Die Pipettenstation, das Gerät, die Spitzen, die Elektroporationsrohre und die Pipette sind im Neon-Transfektionssystem enthalten.
5. Schließen Sie den Hochspannungs- und Sensoranschluss an der Pipettenstation gemäß den Anweisungen des Herstellers an die hinteren Anschlüsse des Geräts an. Halten Sie die Pipettenstation in der Nähe des Geräts.
6. Schließen Sie das Netzkabel an den hinteren AC-Eingang an und schließen Sie das Gerät an die Steckdose an. Drücken Sie den Netzschalter, um das Gerät einzuschalten.
7. Geben Sie die Transfektionsparameter in den Startbildschirm ein, der angezeigt wird, wenn das Gerät eingeschaltet und entsprechend angeschlossen ist. Drücken Sie auf Spannung, geben Sie 1000 ein, und drücken Sie Fertig, um die Spannung auf 1000 V einzustellen. Drücken Sie auf Breite, geben Sie 40 ein, und drücken Sie Fertig, um die Impulsdauer auf 40 ms einzustellen. Drücken Sie abschließend auf # Impulse, geben Sie 2 ein und drücken Sie auf Fertig, um die Anzahl der elektrischen Impulse auf 2 einzustellen.
8. Nehmen Sie eines der Elektroporationsröhrchen (im Kit enthalten) und füllen Sie es mit 3 ml elektrolytischem Puffer E (für 10 μL Spitzen und im Kit enthalten) bei RT. Setzen Sie das Elektroporationsröhrchen in den Pipettenhalter an der Pipettenstation ein. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode an der Seite des Rohrs nach innen zeigt und dass ein Klickgeräusch zu hören ist, wenn der Schlauch eingeführt wird.
9. Nehmen Sie das Zellpellet aus Schritt 3.8 und fügen Sie 10 μL vorgewärmten Resuspension R-Puffer (im Kit enthalten) für jeweils 1-2 x 10⁵ Zellen hinzu. Mit einer p20-Mikropipette vorsichtig vermischen. 10 μL der Zellsuspension in jedes in Schritt 4.3 eingerichtete Röhrchen geben und vorsichtig mit einer p20-Mikropipette mischen.
10. Nehmen Sie die Pipette und setzen Sie eine Spitze ein, indem Sie den Druckknopf zum zweiten Anschlag drücken. Stellen Sie sicher, dass die Klemme den Montageschaft des Kolbens in der Spitze vollständig aufnimmt und dass keine Lücke im oberen Kopf der Pipette beobachtet wird.
11. Um die Probe abzusaugen, drücken Sie den Druckknopf an der Pipette bis zum ersten Stopp und tauchen Sie in das erste Röhrchen ein, das das Zell-Plasmid-DNA-Gemisch enthält. Saugen Sie die Mischung langsam in die Pipettenspitze ab.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen, da sie während der Elektroporation Lichtbögen verursachen können und, wenn sie vom Gerät erkannt werden, die Abgabe des elektrischen Impulses verhindern können. Wenn Luftblasen beobachtet werden, geben Sie den Inhalt in das Rohr ab und versuchen Sie erneut, abzusaugen.
12. Setzen Sie die Pipette mit der Probe sehr vorsichtig in den Pipettenhalter ein. Stellen Sie sicher, dass die Pipette klickt und richtig platziert ist.
13. Drücken Sie auf dem Touchscreen auf Start und warten Sie, bis die elektrischen Impulse gesendet werden. Eine Meldung auf dem Bildschirm zeigt den Abschluss an.
14. Entfernen Sie langsam die Pipette aus der Station und fügen Sie die transfizierte Zellsuspension sofort in die entsprechende Vertiefung mit vorgewärmtem antibiotikafreiem Medium aus Schritt 2.4 ein, indem Sie langsam den Druckknopf bis zum ersten Stopp drücken.
    HINWEIS: Diese Spitze kann bis zu dreimal für dasselbe Plasmid wiederverwendet werden; Andernfalls entsorgen Sie es in einen biogefährlichen Abfallbehälter, indem Sie die Drucktaste bis zum zweiten Stopp drücken.
15. Wiederholen Sie die Schritte 4.10-4.14 für jede Röhre, die ein Zell-Plasmid-DNA-Gemisch enthält.
16. Die Platte mit transfizierten Zellen vorsichtig schwingen und 1-3 h in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂) inkubieren.
17. Zu jeder Vertiefung werden 200 μL vorgewärmtes Kulturmedium (vollständiges Medium) aus Schritt 1.1.2 zugegeben. Die Schale erneut in den befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂) geben. Erlauben Sie mindestens 24 h für die Genexpression.
18. Am nächsten Tag untersuchen Sie die Zelllebensfähigkeit und Transfektionseffizienz mit einem Epifluoreszenzmikroskop.
    1. Schalten Sie das Epifluoreszenzmikroskop und die Fluoreszenzlichtquelle gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und stellen Sie die Kulturschale auf die Mikroskopstufe.
    2. Wählen Sie das 10-fache oder 20-fache Objektiv und den 568-nm-Filter (RFP).
    3. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu schätzen, drücken Sie die TL-Taste (Transmitted Light LED), um alle Zellen im ausgewählten Feld anzuzeigen. Während Sie in das Okular des Mikroskops schauen, drehen Sie den Fokusknopf, bis Zellen beobachtet werden, und überprüfen Sie die Zellbefestigung im ausgewählten Feld.
       HINWEIS: Vollständig angehängte Zellen stellen die lebensfähigen Zellen dar, während schwimmende Zellen nicht lebensfähige Zellen darstellen. Wenn die Konfluenz des Brunnens hoch ist, könnte das Vorhandensein von nicht gebundenen Zellen das Ergebnis einer Überschätzung der Zellzahl und nicht das Ergebnis einer geringen Lebensfähigkeit sein. Eine geringe Konfluenz, begleitet von einem hohen Gehalt an schwimmenden Zellen, bedeutet jedoch eine geringe Lebensfähigkeit, die sich aus Lichtbögen während der Elektroporation, Plasmidtoxizität oder Überexposition gegenüber Resuspension R-Puffer ergeben kann. Verwenden Sie keine Vertiefungen, die das letztere Verhalten aufweisen.
    4. Um die Transfektionseffizienz abzuschätzen, konzentrieren Sie sich wie oben beschrieben auf Zellen im ausgewählten Feld unter Durchlicht. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen im ausgewählten Feld. Wenn die Durchlicht-LED (TL ) ausgeschaltet ist, drücken Sie die LED-Taste (RL) für das reflektierte Licht , um sie einzuschalten.
    5. Konzentrieren Sie sich auf die Fluoreszenz des Reportergens (rote Blutkörperchen) und zählen Sie die Gesamtzahl der rot fluoreszierenden Zellen. Wiederholen Sie diese Schritte (4.18.4-4.18.5) für mindestens zwei weitere Felder pro Bohrloch.

5. Behandlung der transfizierten MDM- und Caspase-BiFC-Datenerfassung

HINWEIS: Wenn Sie planen, die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop abzubilden, wird eine Behandlung mit qVD-OPh (20 μM) für 1 h vor der Behandlung mit dem gewählten Reiz empfohlen, um einen caspaseabhängigen Zelltod (vorwiegend Apoptose) zu verhindern. Dies wird in der Bildgebung verwendet, um zu verhindern, dass Zellen aufgrund von Apoptose abheben, was es sehr schwierig macht, sie abzubilden, wenn sie sich aus der Fokusebene bewegen. Beachten Sie, dass die Caspase-Rekrutierung für die Aktivierungsplattform und die damit verbundene Caspase-BiFC nicht von der katalytischen Aktivität der Caspase abhängt und folglich die Caspase-Hemmung diesen Schritt nicht beeinflusst.

1. Behandeln Sie mit dem gewählten Reiz ca. 24 Stunden nach der Transfektion und inkubieren Sie so lange wie nötig für jedes Medikament.
   1. Es wird Bildgebungsmedium hergestellt, indem das Kulturmedium aus Schritt 1.1.2 mit Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) und 2-Mercaptoethanol (55 μM) ergänzt wird.
   2. Fügen Sie die gewünschte Reizkonzentration in das vorgewärmte Bildmedium ein und mischen Sie es vorsichtig.
   3. Entfernen Sie die Medien vorsichtig mit einer p1000-Mikropipette aus den Zellen und fügen Sie 500 μL der Stimuluslösung aus Schritt 5.1.2 seitlich der Vertiefung hinzu.
   4. Um unbehandelte Kontrollbrunnen zu betreiben, fügen Sie Bildgebungsmedium ohne den Stimulus hinzu.
   5. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂) so lange, wie für jede Behandlung angegeben.
2. Visualisieren Sie die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop.
   1. Schalten Sie das Mikroskop und die fluoreszierende Lichtquelle gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
   2. Wählen Sie das 10-fache oder 20-fache Objektiv und stellen Sie die Kulturschale auf die Mikroskopie.
   3. Suchen Sie mit dem Mikroskopokular nach Zellen unter dem 568-nm-Filter und konzentrieren Sie sich auf die Zellen, die den dsRedmito/mCherry-Reporter (rote Blutkörperchen) exprimieren.
   4. Zählen Sie alle roten Felder im Gesichtsfeld und notieren Sie die Zahl.
   5. Wechseln Sie im selben Gesichtsfeld zum Filter 488 oder 512 (GFP oder YFP), zählen Sie die Anzahl der roten Blutkörperchen, die ebenfalls grün sind (Venus-positiv oder BiFC-positiv) und notieren Sie die Anzahl.
   6. Zählen Sie mindestens 100 dsRedmito/mCherry-positive Zellen aus mindestens drei einzelnen Gesichtsfeldern.
   7. Berechnen Sie den Prozentsatz der Venus-positiven transfizierten Zellen pro Gesichtsfeld und durchschnittlich die resultierenden Prozentsätze für jede Behandlung (gut), um die Standardabweichung zu erhalten.
3. Abbildung der Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop
   HINWEIS: Um konfokale Bilder mit einem 20-fachen Objektiv oder einer größeren Vergrößerung zu erfassen, sollten die Zellen auf Glasschalen plattiert werden, es sei denn, das Mikroskop ist mit einem Long-Pass-Objektiv ausgestattet.
   1. Führen Sie die Schritte 5.2.1-5.2.3 aus. Wenn Sie ein konfokales Mikroskop mit dem 40x-, 60x- oder 63x-Ölobjektiv verwenden, geben Sie einen Tropfen Öl auf das Objektiv.
   2. Visualisieren Sie das Live-Bild der Zellen auf dem Computerbildschirm, wie es von der Kamera aufgenommen wurde. Verwenden Sie die Epifluoreszenzlichtquelle für fluoreszierende Bilder oder schalten Sie die Lichtquelle für konfokale Bilder auf die Laser um.
   3. Feinabstimmung des Fokus und der Position der Zellen mithilfe der Joystick-Steuerung und des Fokusrads.
   4. Stellen Sie die prozentuale Laserleistung und Belichtungszeit für die 512 nm oder 488 nm (YFP oder GFP) und 568 nm (RFP) Laser so ein, dass das Signal im Bild gut aussieht und keine Sättigung erreicht.
   5. Schalten Sie die Live-Aufnahme ein und untersuchen Sie das resultierende Bild. Stellen Sie sicher, dass für jeden Fluor in den Histogrammen des Displays für beide Kanäle ein deutlicher Peak zu sehen ist.
   6. Stellen Sie die Laserleistung und die Belichtungszeit nach Bedarf ein. Halten Sie diese Werte so niedrig wie möglich und können Sie gleichzeitig beide Fluoreszenzsignale (RFP und GFP/YFP) detektieren.
   7. Während Sie das Live-Bild der Zellen visualisieren, nehmen Sie mehrere repräsentative Bilder eines Feldes auf, das eine oder mehrere Zellen enthält, die den mCherry / dsRedmito-Reporter für jede Vertiefung der Platte exprimieren, und speichern Sie die Daten.

Das in Abbildung 2 gezeigte Schema gibt einen Überblick darüber, wie humanes MDM erhalten, transfekt und abgebildet werden kann. Nach der Inkubation der ausgewählten CD14+-Monozyten mit GM-CSF für 7 Tage ändert sich die Zellmorphologie im Laufe der Differenzierungsperiode (Abbildung 3A) von sphärischen Suspensionszellen zu spindeldürren und vollständig gebundenen (Tage 3 und 4), und schließlich zu mehr verteilten Zellen, wenn sie vollständig differenziert sind (Tag 7). Vollständig differenzierte Zellen werden dann von der Platte gelöst und mit den Caspase-BiFC-Paaren (VC und VN) zusammen mit dem Reporterplasmid (z. B. dsRedmito, einem Plasmid, das für ein rotfluoreszierendes Protein kodiert, das auf die Mitochondrien abzielt) transfiziert, das zur Markierung der transfizierten Zellen verwendet wird (Abbildung 3B) und zur Beurteilung der Effizienz der Transfektion nach 24 h verwendet wird. Abbildungen 3B-D zeigt ein Beispiel für BiFC-Ergebnisse unter Verwendung der caspase-1 pro BiFC-transfizierten Zellen, die 20 h lang mit Nigericin (5 μM) behandelt wurden, einem bekannten entzündungsfördernden Reiz, der die Montage des NLRP3-Inflammasoms^30,31 auslöst. Unbehandelte Zellen zeigen keine Venusfluoreszenz (Abbildung 3B), und in mit Nigericin behandelten Zellen erscheint Caspase-1 BiFC als einzelnes Punctum mit der typischen Form von ASC-Flecken 32,33,25 (Abbildung 3C). Abbildung 3D zeigt ein Beispiel für die Quantifizierung von Venus-positivem MDM. Der höchste Prozentsatz an Caspase-1 BiFC wird in der LPS + Nigericin-Behandlungsgruppe beobachtet (Abbildung 3D). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Aktivierung eines kanonischen Inflammasoms, bei dem sowohl ein Priming-Signal (LPS) als auch ein intrazelluläres Signal (Nigericin für die Aktivierung von Capase-1) erforderlich sind.

Abbildung 3: Differenzierung von CD14-Monozyten und Transfektion von humanem MDM. (A) Repräsentative Hellfeldbilder von CD14+-Monozyten aus peripherem Blut, die an den Tagen 1, 3, 4 und 7 der Differenzierung bei GM-CSF exponiert wurden (Skalenbalken, 100 μm). (B-C) Humanes MDM wurde mit Caspase-1 pro BiFC-Paaren und dem Transfektionsreporter dsRedmito (50 ng, rot) transfiziert. 24 h später wurden die Zellen mit und ohne LPS (100 ng/ml) für 3 h grundiert und 20 h lang mit Nigericin (5 μM) in Bildgebungsmedium behandelt. Es werden repräsentative konfokale Bilder von unbehandelten und mit Nigericin behandelten Zellen gezeigt (Maßstabsstab, 10 μm). Der BiFC ist grün dargestellt. (D) Zellen von (C) wurden auf den Prozentsatz der dsRedmito-positiven Zellen (rote, transfizierte Zellen) untersucht, die Venus-positiv (grün, Caspase-1 BiFC-Komplex) bei 20 h waren. Fehlerbalken stellen SD von mindestens zwei unabhängigen Zählungen pro Bohrloch dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ein Beispiel für die Plasmidtitration ist in Abbildung 4 dargestellt, wo zunehmende Mengen jedes BiFC-Plasmids transfiziert werden. Dies ermöglicht die Auswahl der optimalen Plasmiddosis, was zu einem spezifischen Signal und einem minimalen Hintergrund führt. Abbildung 4A zeigt die Ergebnisse von humanem MDM, das mit steigenden Konzentrationen der Caspase-1-, -4- und -5-Pro-BiFC-Paare (VC und VN) transfiziert wurde, die mit Häm behandelt wurden, einem stark entzündungsfördernden Molekül, das aus der Zerstörung roter Blutkörperchen resultiert³⁴. Der höchste Prozentsatz an Venus-positiven Zellen für Caspase-1-, -4- und -5-Pro-BiFC-Paare ergibt sich aus 400 ng, 500 ng bzw. 1000 ng transfiziertem Plasmid. Die Verwendung der höchsten Menge an Plasmid birgt jedoch auch das Risiko, den unspezifischen Hintergrund zu erhöhen (Abbildung 4B). Zum Beispiel führt die Transfektion von 1000 ng des Caspase-5 pro BiFC-Paares zu fast 40% unspezifischem Hintergrund. Daher wird die Verwendung der unteren 700 ng-Menge für dieses Plasmidpaar als optimal angesehen (Abbildung 4B). In Abbildung 4C sind repräsentative konfokale Bilder gezeigt, die mit einem 20-fachen Objektiv eines Zellfeldes von 24 h nach der Transfektion erhalten wurden. In diesem Bild kann man sehen, dass die unbehandelten transfizierten Zellen aufgrund des Aussehens der Mitochondrien (Mitochondrien in toten Zellen sind stark fragmentiert) und der Morphologie der Zellen (apoptotische Zellen werden geschrumpft) lebensfähig sind. Nach der Behandlung mit Häm erscheint der Caspase-1-Komplex als ein einzelnes grünes Punctum, das dem durch Nigericin in Abbildung 3C induzierten Punctum ähnelt, und sein Auftreten wurde von einer Zellschrumpfung begleitet.

Abbildung 4: Humanes MDM, transfiziert mit unterschiedlichen Mengen an entzündlichen Caspase pro BiFC-Paaren. (A) Titration von Caspase-1 pro; Caspase-4 Pro; oder caspase-5 pro BiFC Paare. Humanes MDM wurde mit den angegebenen Mengen der Caspase pro BiFC-Paare mit dsRedmito als Transfektionsreporter (50 ng) transfiziert und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium aus allen Vertiefungen entfernt und die Zellen mit und ohne Häm (50 μM) in 0,1% FBS-Medium behandelt. Nach 1 h wurde eine gleiche Menge an vollständigem Medium in alle Vertiefungen gegeben, um die FBS-Konzentration auf 5% zu rekonstruieren und zu verhindern, dass Häm die Zellen abtötet. Nach einer Gesamtbehandlung von 20 h wurden die Zellen auf den Prozentsatz der dsRedmito-positiven transfizierten Zellen untersucht, die Venus-positiv waren, bestimmt aus einem Minimum von 300 Zellen pro Well. Fehlerbalken stellen SD von mindestens drei unabhängigen Zählungen pro Bohrloch dar. (B) Humanes MDM wurde mit ausgewählten Mengen von Caspase-1 pro transfiziert; Caspase-4 Pro; oder caspase-5 pro BiFC-Paare, zusammen mit dsRedmito (50 ng) als Reporter für Transfektion. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit oder ohne Häm (50 μM) in 0,1% FBS behandelt. Nach 1 h wurde FBS zu 5% rekonstituiert, um extrazelluläres Häm zu hemmen. Die Zellen wurden auf den Prozentsatz der dsRedmito-positiven Zellen (rote, transfizierte Zellen) untersucht, die Venus-positiv waren (grüner, caspase BiFC-Komplex) bei 20 h aus einem Minimum von 300 Zellen pro Well. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Venus-positiven Zellen dargestellt. Fehlerbalken stellen SD von mindestens drei unabhängigen Zählungen pro Bohrloch dar. (C) Repräsentative konfokale Bilder, die mit einem 20-fachen Objektiv eines Zellfeldes 24 h nach der Transfektion aufgenommen und mit und ohne Häm gemäß (B) behandelt wurden. Rot: dsRedmito-positive Zellen; Grün: Venus-positive Zellen; Maßstabsstab, 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Makrophagen aus Monozyten, die aus menschlichen Blutproben isoliert wurden, und eine Methode, um die entzündlichen Caspase-BiFC-Reporter effizient in das menschliche MDM einzuführen, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen.

Dieses Protokoll nutzt die BiFC-Technik^35, um die entzündlichen Caspasen an der Caspase-Rekrutierungsdomäne (CARD) mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des gespaltenen fluoreszierenden Proteins Venus zu markieren. Entzündliche Caspasen kodieren eine katalytische Domäne, die aus einer großen (p20) und einer kleinen (p10) Untereinheit besteht, und einem konservierten Protein-Protein-Interaktionsmotiv, das an ihrem N-Terminus oder Prodomäne³⁶ als CARD bezeichnet wird (Abbildung 1B). Die Rekrutierung von entzündlichen Caspasen zu ihren Aktivierungsplattformen ist abhängig von einer intakten CARD. Für diesen Ansatz werden zwei Caspase-Prodomain-Konstrukte (kodiert das CARD-Motiv) erzeugt, die jeweils mit den nicht-fluoreszierenden Fragmenten des fotostabilen gelben Proteins Venus (Venus-C [VC]) und Venus-N [VN]) verknüpft sind, zusammen mit einem fluoreszierenden Transfektionsreporter, um die Visualisierung der Zellen vor oder in Abwesenheit der Aktivierung des Caspase-BiFC-Reporters zu ermöglichen. Fluoreszenz wird nur beobachtet, wenn wechselwirkende Proteine nahe genug kommen, um eine Dimerisierung und Aktivierung zu ermöglichen (siehe Abbildung 1A). Die Effizienz dieses Prozesses kann mit einer Standard-Epifluoreszenz oder einem konfokalen Mikroskop quantifiziert werden. In Kombination mit der Einzelzellbildgebung ermöglicht dieses Protokoll die Visualisierung asynchroner Ereignisse, die in Massenpopulationen möglicherweise nicht unterscheidbar sind, und kann je nach Auflösung der Bilder verwendet werden, um die Größe und Lokalisierung des BiFC-Komplexes zu bestimmen, der jeder Caspase zugeordnet ist.

Dieses Protokoll kann an eine Reihe von Proteinen angepasst werden, die durch Oligomerisierung aktiviert werden, und seine Anwendbarkeit ist nicht auf Mikroskopiemethoden beschränkt. Dieser Ansatz ermöglicht auch die Untersuchung der differentiellen Anforderungen an die Assemblierung von entzündlichen Caspasen. Zum Beispiel kann siRNA verwendet werden, um vorgelagerte Komponenten/Anforderungen für eine spezifische entzündliche Caspase-Aktivierung zu identifizieren. Die Caspase-BiFC-Sonden und der siRNA-Oligo (der verwendet wird, um ein Zielprotein zum Schweigen zu bringen) können gleichzeitig in MDM transfiziert werden. Dies kann potenzielle Proteinpartner oder wesentliche Komponenten jeder Aktivierungsplattform identifizieren. Zum Beispiel wurde ein siRNA-Oligo, der auf das ASC-Adaptermolekül abzielt, das für die Montage der NLRP1-, NLRP3- und AIM2-Inflammasomen benötigt wird, verwendet, um zu zeigen, dass die Häm-induzierte Aktivierung von Caspase-1 diese kanonischen Inflammasomen erfordert, während Caspase-4 und -5 nicht²¹ waren. Diese Methodik kann auch an die Zeitraffermikroskopie angepasst werden, so dass die Kinetik der entzündlichen Kaspaseaktivierung in einzelnen Zellen bestimmt werden kann. Mit einem solchen Ansatz kann man beurteilen, wann eine Caspase-Dimerisierung auftritt, indem man den Zeitpunkt des Auftretens des BiFC-Beginns relativ zu dem Zeitpunkt, zu dem die Zelle den Tod erleidet, genau erkennt, indem der Fluoreszenzverlust des Transfektionsreporters (mCherry) als Hinweis auf eine Zelllyse überwacht wird. Es gibt mehrere Möglichkeiten, Caspase-BiFC-Daten zu erfassen und zu analysieren. Die Wahl hängt von der zu beantwortenden Frage und der Art des verfügbaren Mikroskops und der verfügbaren Software ab. Zum Beispiel können Einzelzeitpunktdaten, die zur Bestimmung der Effizienz der Aktivierung sowie zur Zeitrafferanalyse verwendet werden, besonders effektiv sein, wenn eine von einer Mikroskopsoftware bereitgestellte automatische Erfassungsfunktion verfügbar ist. Dies ermöglicht eine objektive Bildgebung, da vorgegebene Positionen Arrays aus jedem Bohrloch einer Multi-Well-Platte erfasst werden. Bilder können sowohl durch visuelle Inspektion als auch durch die Verwendung automatisierter Bildgebungssoftware wie CellProfiler, ImageJ oder MATLAB quantifiziert werden, um die Genauigkeit und Objektivität zu erhöhen.

Die Untersuchung von Caspase-Signalwegen in Primärzellen ist unerlässlich, um die physiologischen Rollen dieser Proteine vollständig zu verstehen. Da Caspase-4 und Caspase-5 in Mäusen durch eine einzige Caspase-11 ersetzt werden, ist es außerdem wichtig, menschliche Zellen beurteilen zu können. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienzen und Toxizitäten, die mit vielen Abgabesystemen in Primärzellen verbunden sind, kann es jedoch schwierig sein, den Einsatz verfügbarer plasmidbasierter Reporter zu maximieren. Das Entzündungskaspase-BiFC-Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Transfektierung von MDM aus peripherem Blut von Patienten oder gesunden Probanden, wodurch die Anzahl der pro Transfektion erforderlichen Zellen reduziert wird. Dies ermöglicht es den Forschern, komplexere Experimente mit wertvollen Zellen wie Makrophagen durchzuführen, ohne die Zelllebensfähigkeit und die zellulären Eigenschaften zu beeinträchtigen. Die Möglichkeit, Patientenproben zu verwenden, bietet einen großen Vorteil, wenn es darum geht, die entzündliche Caspase-Aktivierung in bestimmten Krankheitszuständen beurteilen zu können. In der Tat könnte dieses Protokoll mit einigen kleineren Optimierungen leicht an andere murine oder menschliche Primärzellen angepasst werden.

Dieses Protokoll verwendet einen auf Elektroporation basierenden Ansatz zur Transfektion von MDM. Das Neon-System ist besonders vorteilhaft, da es keine IFN-γ-Antwort im MDM induziert, die die spezifische Immunantwort der Zellen^{stören könnte 37}. Dies ist ein kleines Elektroporationssystem, das ein Transfektionsvolumen von 10 μL mit einer hohen Zelldichte verwendet, um den effizienten Transfer exogener DNA auf eine große Anzahl von Zellen zu ermöglichen. Es erzeugt temporäre Poren in der Zellmembran, so dass Plasmide schnell passieren können, wodurch die späte Endozytose vermieden wird, die während der chemischen Transfektion auftritt und den Plasmidabbau auslösen kann. Dieses Protokoll verwendet eine Pufferformulierung auf organischer Säurebasis (Puffer R), die im Vergleich zu anderen Puffern mit Chloridionen³⁸ eine minimale Zelltoxizität einführt. Das geringe Volumen und das Design der Pipettenspitzenkammer tragen dazu bei, ein gleichmäßiges elektrisches Feld zu erzeugen, um physiologische Bedingungen aufrechtzuerhalten, was zu hohen Überlebensraten führt. Transfektionseffizienz und Zellüberleben hängen stark von der chemischen Zusammensetzung des Puffers, der Zelldichte, der Stärke des Pulses und der Plasmidkonzentration^{ab 39}. Daher ist es wichtig, diese Bedingungen für jeden Zelltyp und jedes eingeführte Plasmid zu optimieren. Im MDM lieferten niedrigere Spannungen mit längeren Pulsdauern Plasmide effizienter und hielten die Zellen lebensfähig und gesund. Folglich waren die für dieses Protokoll verwendeten Einstellungen 1000 V und 2 Impulse von 40 ms, was zu Transfektionseffizienzen zwischen 40-60% mit einer Zelllebensfähigkeit von mehr als 90% führte, basierend auf der Fähigkeit der Zellen, sich nach der Transfektion wieder an die Platte zu heften. Während dieses Protokoll für menschliches MDM optimiert ist, können die Spannungseinstellungen von 500 V bis 1700 V, die Erhöhung der Anzahl der Impulse von 1 auf 3 und das Testen der Länge von Impulsen im Bereich von 10 bis 40 ms die Transfektionseffizienz und die Zelllebensfähigkeit in zusätzlichen Zelltypen und experimentellen Umgebungen ausgleichen.

Es gibt mehrere wichtige Überlegungen für den optimalen Einsatz der BiFC-Technik. 1) Es ist wichtig, dass der Benutzer die optimale Menge jedes einzubringenden Caspaseplasmids bestimmt, da dies für verschiedene Proteine und Zelltypen variieren kann. Dies ist erforderlich, um eine maximale Sensitivität und Spezifität des Assays zu gewährleisten. Es wird empfohlen, eine Pilottitration der Caspase-BiFC-Plasmide (VC- und VN-Fragmente) zwischen 200 ng und 1000 ng durchzuführen, wie in den Abbildungen 4A-B dargestellt. Der optimale Bereich des eingeführten Plasmids unterscheidet sich für jede einzelne Caspase und muss daher individuell beurteilt werden. Wählen Sie eine Plasmidmenge, die das höchste spezifische Signal mit minimalem Hintergrund liefert. Idealerweise sollte der Hintergrundpegel weniger als 10% betragen, aber bis zu 20% können verwendet werden, wenn das spezifische Signal hoch ist. Es ist auch wichtig, raue Bedingungen und übermäßige Manipulation dieser Zellen während der Differenzierung, Transfektion und Behandlung zu vermeiden. Dies kann auch zu einer spontanen Aktivierung und hohen Hintergrundwerten der Caspase-Aktivierung führen, die die spezifischen Ergebnisse verschleiern können, da die Aktivierung von Immunzellen wie Monozyten oder Makrophagen ein natürlicher Prozess ist, bei dem sie entzündungsfördernde Funktionen erwerben^{können 40}. Bei der Verwendung von Patientenzellen kann es schwierig sein, eine inhärente Variation der Inflammasom-Aktivierung und des genetischen Hintergrunds zu kontrollieren, die sie für Reize und Veränderungen in ihrer lokalen Mikroumgebung sensibilisieren oder desensibilisieren kann. Zum Beispiel kann die Makrophagenfunktion bei immungeschwächten Personen oder Personen, die eine Infektion bekämpfen, beeinträchtigt werden, da diese Art von Zelle wichtige homöostatische Funktionen erfüllt und unter anderem an der Kontrolle von Entzündungen beteiligt ist. Diese genetischen und Umweltfaktoren müssen berücksichtigt werden, wenn festgestellt wird, ob ein hoher Hintergrund unspezifisch oder eine biologische Wirkung ist. Die Verwendung eng aufeinander abgestimmter gesunder Kontrollen (z. B. abgestimmt auf Geschlecht und Alter) kann helfen, die biologische Bedeutung eines hohen Hintergrundgehalts an Caspase BiFC zu beurteilen. 2) Es ist wichtig, dass die VC- und VN-Fragmente in gleichen Mengen eingeführt werden, da eine ungleiche Expression eines Venusfragments zu einer Rekrutierung auf der Plattform bei höheren Frequenzen führen und das volle fluoreszierende Signal maskieren könnte, was zu einem falsch negativen Ergebnis führt. Daher sollte die Integrität und Konzentration jedes einzelnen Plasmids vor jeder Transfektion validiert werden, um zu vermeiden, dass unterschiedliche Mengen der VC- und VN-Fragmente eingeführt werden. 3) Da dieser Ansatz auf der exogenen Expression der Caspase-Reporter basiert, sollten zusätzliche Kontrollen für die Spezifität einbezogen werden. Caspase-BiFC-Konstrukte, die Einzelpunktmutationen enthalten, die die Bindung zwischen der Caspase und ihrer Aktivierungsplattform oder das Stummschalten einer der Komponenten der Aktivierungsplattform unter Verwendung von siRNA stören, können verwendet werden, um zu bestätigen, dass das Fluoreszenzsignal auf eine spezifische Bindung der Caspase an das Inflammasom zurückzuführen ist. Dieses Kontrollexperiment sollte zu verminderten Spiegeln von Venus-positiven Zellen führen. 4) Die Expression der Caspase-BiFC-Konstrukte könnte nachgelagerte Ereignisse wie den Zelltod auslösen oder beeinflussen. Um dies zu umgehen, werden für die BiFC-Reporter nicht-enzymatische Versionen der Caspase empfohlen, wie die Caspase-Prodomäne oder die Full-Length-Caspase, bei der der katalytische Cysteinrest mutiert und inaktiviert wird. Um dies weiter zu kontrollieren, sollten nicht transfizierte behandelte und unbehandelte Kontrollbrunnen in das Experiment einbezogen werden und ein ähnliches Verhalten wie die transfizierten Vertiefungen zeigen. 5) Die endogene Caspase-Aktivität könnte sich möglicherweise auf die BiFC-Anzeige auswirken. Um dies zu kontrollieren, kann man den Caspase-Reporter in Zellen ausdrücken, die für die untersuchte Caspase mangelhaft sind, mit der Erwartung, dass die BiFC-Effizienz gleich wäre.

Einer der Hauptnachteile dieses Ansatzes besteht darin, dass er nicht die Caspaseaktivierung an sich misst, sondern den induzierten Annäherungsschritt, der für die Aktivierung erforderlich ist. Dies ist eine subtile, aber wichtige Unterscheidung. Die Prodomäne enthält nicht die katalytischen Domänen der Caspase, die tatsächlich dimerisieren. Daher wirken die Umfaltung und Fluoreszenz der Venusfragmente als Stellvertreter für die Caspase-Dimerisierung, da sie sich nur dann zurückbilden können, wenn die Caspasen nahe genug sind, um zu dimerisieren. Somit misst der BiFC gezielt die induzierte Nähe. Es ist möglich, dass posttranslationale Modifikationen in den katalytischen Domänen die Dimerisierung behindern könnten, ohne das BiFC-Signal zu beeinflussen. Zum Beispiel wird Caspase-2 auf seiner katalytischen Domäne phosphoryliert, was die Dimerisierung behindert, ohne die Rekrutierung von Caspase-2 auf seiner Aktivierungsplattform⁴¹ zu verhindern. Daher müssen Beobachtungen mit dem BiFC-Ansatz durch funktionelle Studien ergänzt werden, um zu bestätigen, dass die beobachtete Fluoreszenz repräsentativ für die Caspase-Aktivierung ist. Trotz dieses Nachteils kann die Messung der induzierten Nähe durch Caspase BiFC, wenn die hier diskutierten Kontrollen einbezogen werden, eine genaue Darstellung der spezifischen Caspase-Aktivierung liefern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Caspase BiFC ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse dynamischer Caspase-Interaktionen auf der Inflammasom-Ebene ist. Dieses Protokoll ermöglicht die Abfrage der entzündlichen Caspase-Signalkaskaden in lebenden Immunzellen. Dieser Ansatz bietet nicht nur eine Technik, um den ersten Schritt in der Caspase-Aktivierung spezifisch und genau zu messen, sondern hat durch die Anwendung auf primäre Immunzellen auch das Potenzial, Eigenschaften von entzündlichen Caspasen aufzudecken, die mit herkömmlichen Methoden nicht identifiziert werden konnten.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir danken den Mitgliedern des LBH-Labors in Vergangenheit und Gegenwart, die zur Entwicklung dieser Technik beigetragen haben. Dieses Lab wird unterstützt von NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Abbildung 2 wurde mit der Biorender-Software gezeichnet.