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* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Purine gehören zu den am häufigsten vorkommenden nicht-kanonischen Nukleotiden während Eukaryotische nukleare DNA-Replikation in das Genom integriert. Wenn nicht richtig entfernt, verursachen Purine DNA-Schäden und Mutagenese. Hier präsentieren wir Ihnen zwei experimentelle Ansätze, die verwendet werden, um die Fülle der Ribonukleotidreduktase Einbindung in DNA und seine mutagenen Wirkungen zu beurteilen.
Das Vorhandensein der Purine in Kern-DNA hat sich gezeigt, eine Quelle der genomischen Instabilität sein. Das Ausmaß der Ribonukleotidreduktase Aufnahme beurteilt werden kann, durch alkalische Hydrolyse und gel-Elektrophorese als RNA Hydrolyse in alkalischen Bedingungen sehr anfällig ist. Dies, in Kombination mit südlicher Fleckanalyse lässt sich bestimmen Sie den Speicherort und Litze in die der Purine aufgenommen wurden. Aber dieses Verfahren ist nur semi-quantitativen und möglicherweise nicht empfindlich genug, um kleine Änderungen in Ribonukleotidreduktase Inhalte zu erkennen, obwohl das Strang-spezifische Südlicher Fleck sondieren die Empfindlichkeit verbessert. Als Maß für eines der auffälligsten biologischen Folgen der Purine in DNA kann spontane Mutagenese mit einem vorwärts Mutation Assay analysiert werden. Mit entsprechenden Reporter-Gene, können seltene Mutationen, die den Verlust der Funktion ausgewählt und allgemeine und spezifische Mutationsraten gemessen werden, indem Daten aus Fluktuation Experimente mit DNA-Sequenzierung des reportergens. Die Fluktuation-Assay ist für eine Vielzahl von mutagenen Prozessen in spezifischen genetischen Hintergrund oder Wachstumsbedingungen zu untersuchen.
Während der eukaryotischen nukleare DNA-Replikation fließen Purine in das Genom von allen drei großen DNA Replicases, DNA-Polymerasen (Pols) α, ε und δ1,2. RNase H2-abhängige Ribonukleotidreduktase Exzision Reparatur (RER3) wird den Großteil dieser eingebetteten Purine entfernt.
Ribonukleotidreduktase in DNA ist anfällig gegenüber Hydrolyse, 2'-Hydroxylgruppe des Zucker-Verbindungsgruppe die angrenzenden Phosphodiester-Anleihe, Freigabe von einem Ende mit einer zyklischen Phosphat 2' - 3' und das andere mit einer 5'-OH-4angreifen kann. Alkalische Bedingungen können diese Reaktion erheblich beschleunigt. So verursacht die Hydrolyse von eingebetteten Purine während der Inkubation in eine Basislösung Fragmentierung der genomischen DNA, die durch alkalische Agarose Elektrophorese5visualisiert werden kann. Diese DNA kann auf eine Membran übertragen und sondiert durch südlicher Fleckanalyse mit Strang-spezifischen Sonden, die es die Identifizierung von alkaliempfindlichen Websites durch Purine aufgenommen in der im Entstehen begriffenen führenden ermöglichen- oder -Verzögerungsstrang DNA verursacht, bzw..
In Hefezellen RNase H2 Aktivität fehlt kann Abbau der Purine eingeleitet werden, wenn Topoisomerase ich (Top1) die DNA im eingebetteten Ribonukleotidreduktase6,7 Nicks. Jedoch wenn Top1 auf 3' der die Ribonukleotidreduktase zerspaltet, generiert das 5'-OH und 2' - 3' zyklischen Phosphat DNA-enden, die refraktär gegenüber Religation sind. Reparatur oder abweichende Verarbeitung diese'schmutzigen 'enden können, genomische Instabilität führen. Darüber hinaus tritt der Schnitt innerhalb von einer wiederholte DNA-Sequenz, kann die Reparatur-Prozess zu Löschung Mutationen führen. Dies ist besonders problematisch für Tandem wiederholt, wo kurze Deletionen (von zwischen zwei und fünf Basenpaaren) sind häufig in RNase H2-defizienten Zellen beobachtet. Die Top1-abhängige schädlichen Wirkungen bei fehlender Hefe RNase H2 Aktivität werden in eine DNA-Polymerase ε Mutante (pol2-M644G) promiscuous Ribonukleotidreduktase Aufnahme während der im Entstehen begriffenen führenden Strang-Synthese verstärkt.
Verarbeitung der Purine in DNA führt zu spontanen Mutationen und diese Mutagenese kann durch die Verwendung geeigneter Reporter-Gene und Auswahl für die begleitenden phänotypische Veränderung erkannt werden. Eine Fluktuation Test oder Luria und Delbrück Experiment ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um spontane Mutation mit wählbaren Reporter Gene8,9messen. In Hefe können die URA3 und CAN1 Gene als Reporter in einem vorwärts Mutation Assay verwendet werden, ermöglicht die Erkennung aller Arten der Mutation, die zum Verlust der Genfunktion. Die spontane Mutationsrate dürfte als der Median, die für mehrere parallele Kulturen begann aus einzelnen Kolonien ohne Mutationen in das Zielgen Reporter beobachtet. Eine Hefe RNase H2-defizienten Stamm wie rnh201Δ hat einen leicht erhöhten insgesamt spontane Mutationsrate, die weitgehend von einer erhöhten Inzidenz von 2-5 bp Löschungen im Tandem verursacht wird wiederholen Sequenzen. Also, um die mutagenen Wirkungen der Purine im Genom vollständig zu charakterisieren, spezifische Mutationsraten müssen ermittelt werden. In diesem Fall URA3 oder CAN1 Reporter-Gene können verstärkt und sequenziert, um festzustellen, die Typen und Standorte der Mutationen, und spezifische Mutationsraten errechnet werden. Kompilieren von Mutationen identifiziert in mehrere unabhängige URA3 oder CAN1 Mutanten kann dann verwendet werden, um eine Mutation-Spektrum zu erzeugen.
1. alkalische Hydrolyse und Strang-spezifische Südlicher Fleck (Abbildung 1)
2. Messung der Mutationsrate und Spezifität in S. Cerevisiae -Stämmen
Behandlung von genomischer DNA mit Alkali, gefolgt von alkalischen Gelelektrophorese erlaubt semiquantitativen Nachweis von DNA-Fragmentierung wegen der Fülle an stabil eingebaute Purine. Abbildung 2 zeigt die Gelbilder der Hefe genomischer DNA mit oder ohne KOH5behandelt. Die M644L Variante des Pol2, die katalytische Untereinheit der Polε, hat die Möglichkeit, Purine zu integrieren, während die M644G mutierten mehr Purine als WT-Polymerase enthält reduziert. Gemäß dem Protokoll kann alkalische Gel Strang-spezifische Südlicher Fleck Analyse weiter sondiert werden. Mit dem Wissen über die Lage der sondierten genomische Website im Verhältnis zu seinen benachbarten Ursprung können wir selektiv Sonde Purine in der im Entstehen begriffenen integriert führende oder rückständigen Stränge. Abbildung 3 zeigt die Südlicher Fleck Ergebnisse sondieren das URA3 Reportergen in zwei entgegengesetzte Richtungen in der Nähe eine frühe Entlassung Replikation Ursprungs, ARS30616eingefügt. Durch den Einsatz führender Strang-spezifischen Sonden, beobachten wir das DNA-Fragmentierung Muster verursacht durch Alkali-Spaltung bei Purine in der im Entstehen begriffenen führenden Strang DNA in einem WT-Stamm und Stämme, die mit dem Ausdruck der Varianten der Polymerasen α, δ und ε, die für promiskuitiv sind Ribonukleotidreduktase Ver-
Verwenden eine Fluktuation Experiment, messen wir die Mutationsraten Hefestämme, die Reporter-Gene enthalten. Abbildung 4 zeigt die Mutationsraten bei URA3 und CAN1 Loci Stämme WT Polymerase oder den pol2-M644G -Mutanten mit oder ohne funktionale RNase H2 zum Ausdruck bringen. Das Fehlen von RNase H2 bewirkt eine moderate Erhöhung insgesamt Mutationsraten in beiden Hintergründe. Näherer Betrachtung der Mutation Besonderheit zeigt jedoch, dass in Stämmen RNase H2 fehlt (Abbildung 5), gibt es eine starke Zunahme der Mutationsrate für kurze Deletionen, besonders im Tandem repeat Sequenzen. Abbildung 5A vergleicht die Mutation Spezifität in WT und Rnh201Δ Stämme und Abbildung 5 b zeigt die mutagenen Wirkung der weiter erhöhten Ribonukleotidreduktase Einbeziehung in der im Entstehen begriffenen führenden DNA-Strang von Pol ε.
Abbildung 1: Protokoll Schritte bei der Strang-spezifischen Nachweis von alkaliempfindlichen Websites verursacht durch Ribonukleotidreduktase Einbindung in Hefe genomischer DNA. Eine Übersicht über die verschiedenen großen Schritte in diesem Verfahren, beginnend mit Hefe genomische DNA isoliert und durch die endgültige südlicher Fleckanalyse ausgehend. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: ein repräsentatives Bild der Ergebnisse durch alkalische Agarose-Gelelektrophorese erhalten. Diese Zahl wurde von Nick McElhinny, S. A. Et Al. angepasst 5. Hefe genomischer DNA aus Stämmen der verschiedenen Genotypen mit KCl (Neutral) oder KOH (alkalisch) behandelt wurde und dann getrennt auf einem neutralen oder alkalischen Agarosegel. "WT" und "M644G" zeigen den Status des Pol ε. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Strand-spezifische Sondierung von einer alkalischen Agarose-Gel durch Southern Blot. Diese Zahl wurde angepasst von Williams, J. S. Et Al. 13. (A) die radioaktiven Sonden Tempern, der im Entstehen begriffenen führenden DNA-Strang innerhalb der URA3 -Reporter-gen, die in der Nähe von ARS306 in zwei entgegengesetzte Richtungen (OR1 und OR2) eingefügt wurden. (B) repräsentative Ergebnisse der südlichen Beflecken mit der im Entstehen begriffenen führenden Strang-spezifischen Sonden. Angezeigt werden die bohrenden Ergebnisse für den im Entstehen begriffenen führenden Strang in einem Stamm mit WT DNA-Polymerasen oder pol1-L868M, pol2-M644G oder pol3-L612M Variante Stämme mit oder ohne RNase H2. Die POL1, POL2, und POL3 Gene kodieren katalytische Untereinheiten des Pols α, ε und δ, beziehungsweise. Die Varianten sind mehr promiscuous Ribonukleotidreduktase Aufnahme5,12,17. (C) Quantifizierung des radioaktiven Signals durch Bruch des gesamten in jeder Bahn aus (B). Werte werden als Prozentsatz der Summe angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: spontane Mutationsraten in Hefestämme. Diese Zahl wurde von Nick McElhinny, S. A. Et Al. angepasst 5. URA3 und CAN1 Reporter-Gene wurden in den vorderen Mutation Assay verwendet, um die Mutationsraten der angegebenen Sorten messen. URA3 Reporter ist in "Lage 2" (OR2, Abbildung 3A). Das 95 %-Konfidenzintervall (CI) ist für jede Messung enthalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Mutation Spektren für das URA3-OR2 Reportergen. Diese Zahl wurde aus früheren Veröffentlichungen5,18,19,20angepasst. Die Position und Mutation Typ beobachtet in jeder unabhängige 5-FOA-resistenten Kolonie in der vorwärts-Mutation Assay ausgewählt werden dargestellt in der 804 bp URA3 kodierende Sequenz. Buchstaben bezeichnen Basis Substitutionen, offene Dreiecke zeigen einzelne base Löschungen, geschlossene Dreiecke zeigen einzelne base Einfügungen und durchgezogenen Linien zeigen kurze Deletionen. (A) Mutation Spektren in WT und rnh201Δ Stämme. Rote Etiketten über die Sequenz sind Mutationen in WT beobachtet, während blaue Etiketten unter der Sequenz in eine rnh201Δ Sorte beobachtet sind. (B) Mutation Spektren in pol2-M644G und pol2-M644G rnh201Δ Stämme. Rote Etiketten über die Sequenz sind Mutationen im pol2-M644G während blau unterhalb der Sequenz für pol2-M644G rnh201Δ -Stämme beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Hier beschreiben wir die Protokolle für zwei Sätze von Experimenten, die häufig verwendet werden, um Purine aufgenommen während der DNA-Replikation und die mutagene Wirkung von unrepariert Purine Semi-quantitativ zu analysieren. Obwohl diese Ansätze die Modell Eukaryote S. Cerevisiaebeinhalten, können diese Techniken leicht zu anderen Mikroben und noch höheren Eukaryoten angepasst werden.
Sondierung für unrepariert Purine in DNA mit Hilfe von alkalischen Agarose Elektrophorese gepaart mit Southern blotting liefert wichtige Informationen über die Anzahl der Purine vorhanden und der Strang, in dem sie aufgenommen wurden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Alkali-Empfindlichkeit auch durch andere DNA-Läsionen, wie z. B. eine abasic Site verursacht werden kann. Ein weiteres Mittel zur Erkennung von Purine in der DNA ist durch die Behandlung mit gereinigtem RNase H2 Enzym wie in Säugerzellen21. Unser Ansatz beinhaltet, zwar sondieren für alkaliempfindlichen Fundplätze im Entstehen begriffenen führenden im Vergleich hinkt Stränge an das URA3 Reportergen in unseren Experimenten seiner Analyse verwendet ist es möglich, die Sonden zu entwerfen, die an anderen Orten in der Reihenfolge Tempern wichtige Informationen bezüglich Ribonukleotidreduktase Dichte an anderen genomischen Standorten zu gewinnen. Südlicher Fleck Teil des Verfahrens dient auch als Referenz für andere generische DNA bohrenden Experimente.
Messung von Mutationsraten mit einer Schwankung weithin für die Analyse der verschiedenen Mutagene Ereignisse in Mikroorganismen und somit beschränkt sich nicht auf Analyse der mutagenen Folgen der Purine in DNA. Für dieses Experiment kann die Zahl der unabhängigen Kulturen die Genauigkeit der Messung erheblich verbessern. Unabhängigen Kolonien erhalten Sie durch eine Belastung von Interesse auf YPDA Medium Streifen oder durch die Analyse der unabhängigen Spore Kolonien durch tetrade Dissektion des Fleckes diploiden Hefe gewonnen. Im Idealfall die Verwendung von mehreren unabhängigen haploiden Hefestämme (zB., aus tetrade Dissektion) wird angeregt, die Auswirkungen von Stamm zu Stamm Variation zu minimieren. Dies ist besonders wichtig, wenn die spontane Mutationsrate hoch ist oder wenn die Belastung ein Mangels Wachstum hat. Eine weitere Methode, die eingesetzt werden kann, um spontan zu messen ist die Mutationsrate eine Mutation Ansammlung experimentieren22. In dieser Analyse Mutation Häufigkeit richtet sich nach umfangreichen Wachstum für die Zellen und kann verwendet werden, um für die Mutationsrate berechnen. Kopplung von einer Mutation Ansammlung Experiment mit tiefen Sequenzierungstechnologie nachgewiesen wurde ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mutationsrate und Spezifität für das Genom zu analysieren sein.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Wir bedanken uns bei allen aktuelle und ehemalige Kunkel Lab Mitgliedern für ihre Arbeit und Diskussionen im Zusammenhang mit Protokoll und die hier vorgestellte Daten wiederverwendet. Diese Arbeit wurde von Projekt-Z01-ES065070, T.A.K. aus der Division des intramuralen Forschung von den National Institutes of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
5-FOA | US Biological | F5050 | |
20 mL glass culture tube | Any brand | ||
Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
12-channel pipettes | Any brand | ||
Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
100% ethanol | |||
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
UV transilluminator | |||
Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
NaCl | Caledon | 7560-1 | |
Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) | |
SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
Geiger counter |
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