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The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Dextransulfat (DS) und Chitosan (CS) sind Polysaccharide mit mehreren substituierten negativ geladenen Sulfatgruppen (DS) oder positiv geladenen Amingruppen (deacetyliert CS). Wenn in einer wässrigen Lösung gemischt, die zwei Polysacchariden Polyelektrolytkomplexe durch elektrostatische Wechselwirkungen. Die resultierenden Komplexe können große Aggregate, die aus der wässrigen Lösung (Präzipitate)-Phase abgetrennt werden, oder kleine Teilchen, die in Wasser dispergierbare (Kolloide) sind zu bilden. Die spezifischen Bedingungen, die zu diesen Ergebnissen beigetragen haben, wurden ausführlich untersucht und wurden zusammengefasst und in einer aktuellen Bewertung 1 im Detail dargestellt. Unter diesen Bedingungen sind die entgegengesetzt geladenen Polymere müssen 1) deutlich unterschiedliche Molmasse zwei grundlegende Anforderungen für die Herstellung von in Wasser dispergierbaren Teilchen; und 2) in einem nicht-stöchiometrischen Verhältnis vermischt werden. Diese Bedingungen werden die ladungsneutrale komplexierten Polymersegmente durch Ladungs erzeugt erlaubenNeutralisation zu trennen und bilden den Kern des Teilchens, und das überschüssige Polymer an der Außenschale 1 bilden. Die in diesem Protokoll beschrieben Glykan Partikel zur pulmonalen Verabreichung von Nanometerdimensionen bestimmt und sind entworfen net werden negativ geladen, und. Die negative Oberflächenladung verringert die Wahrscheinlichkeit der zellulären Aufnahme der Teilchen 2,3. Partikel von Nanometerdimension erleichtern den Durchgang durch die distalen Atemwege. Um dieses Ziel zu erreichen, ist die Menge des DS in dieser Zubereitung von mehr als CS (Gewichtsverhältnis 3: 1); und hochmolekulare DS (Gewichtsmittel MW 500.000) und Niedermolekulare CS (MW-Bereich von 50 bis 190 kDa, 75-85% deacetylierte) verwendet.
SDF-1α ist ein Stammzelle Homing Faktor, der die Referenzfahrt-Funktion durch seine chemotaktische Aktivität ausübt. SDF-1α spielt eine wichtige Rolle in der Referenzfahrt und der Wartung von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark, und bei der Einstellung von progenitor Zellen peripheren Gewebe für Verletzungen Reparatur 4,5. SDF-1α hat eine Heparin-Bindungsstelle in der Proteinsequenz, die das Protein an Heparin / Heparansulfat, Dimere zu binden, aus Protease (CD26 / DPPIV) Inaktivierung geschützt werden, und mit Zielzellen in Wechselwirkung über Zelloberflächenrezeptoren ermöglicht 6-8. DS ähnliche strukturelle Eigenschaften wie Heparin / Heparansulfat; So kann die Bindung von SDF-1α DS wäre ähnlich der des natürlichen polymeren Liganden.
In dem folgenden Protokoll beschreiben wir die Herstellung von SDF-1α-DS-CS Nanopartikel. Die Verfahren stellen eine der Formulierungen, die bisher untersucht wurden, 9. Das Protokoll ist ursprünglich aus einer Untersuchung von VEGF-DS-CS-Nanopartikeln 10 angepasst. Eine kleine technische Herstellung beschrieben, die leicht mit den gleichen Stammlösungen und Herstellungsbedingungen skaliert werden kann. Nach der Herstellung werden die Teilchen b gekennzeichnety Prüfung ihrer Größe, Zetapotential, das Ausmaß der SDF-1α Einarbeitung in vitro Freigabezeit, und die Aktivität des einge SDF-1α.
1. Vorbereitung der SDF-1α Glycan Nanopartikel
Aufgrund der Zweck der in vivo-Abgabe, Sterilisieren alle Behälter, Pipetten und Spitzen in der Zubereitung verwendet.
2. Messung der Partikelgröße und Zetapotential
Die Teilchengröße und Zeta-Potential werden durch dynamische Lichtstreuung und Elektrophorese-Lichtstreuung, die jeweils analysiert, mit einer in der Materialliste angegeben Teilchenanalysator.
3. Quantifizierung von SDF-1α in den Teilchen
4. In-vitro-Freisetzungstest
5. Migration Assay
Dieser Test misst die chemotaktische Aktivität von SDF-1α. Wechselwirkung von SDF-1α mit seinem Rezeptor (CXCR4) auf der Zelloberfläche bewirkt Migration der Zelle in Richtung der SDF-1α Gradienten. In diesem Assay werden die Zellen in einen oberen und und SDF-1α-Lösung (die durch eine semipermeable Membran von einer unteren Vertiefung getrennt) in einer unteren Vertiefung geladen.
Die Größe und Zetapotential der vorbereiteten SDF-1α-DS-CS-Partikel mit einer Partikelanalysegerät bestimmt. Figur 1 zeigt die Analyse der Größenmessung. Aus den Ergebnissen von Kumulanten vier wiederholten Messungen erhalten wird, ist die mittlere hydrodynamische Durchmesser der SDF-1α-DS-CS Partikel 661 ± 8,2 (nm) und die Polydispersität beträgt 0,23 ± 0,02. Das Ergebnis der Zetapotentialmessung ist in Fig. 2 gezeigt Von den fünf wiederholten Messungen, das Zetapotential der SDF-1α-DS-CS Teilchen -24.8 ± 0.5 mV. Wie oben erwähnt, ist die Anwesenheit von 5% Mannitol in der SDF-1α-DS-CS Teilchensuspension wesentlich zur Verhinderung der Partikelaggregation während der Gefrier- und Auftau-Verfahren, Fig. 3 zeigt die Größenmessung der in Wasser suspendiert und bei gefrorenen Teilchen -80 ° C. Eine deutliche Aggregation Spitze sichtbar ist nach dem Auftauen.
Die amount von SDF-1α in der SDF-1α-DS-CS Teilchen wird durch SDS-Gelelektrophorese abgeschätzt. 4A zeigt ein Coomassieblau-gefärbtes SDS-Gel mit SDF-1α Standards DS-CS-Nanopartikel (Regulierungsteilchen ohne SDF-1α Einarbeitung , Strg NP) und SDF-1α-DS-CS-Nanopartikel (SDF-1α NP) Proben geladen. Eine Standardkurve wird aus der Dichteanalyse der SDF-1α Standardbänder (4B) ausgebildet sind. Berechnung aus der Standardkurve zeigt, dass das SDF-1α-Konzentration in der SDF-1α NP Probe beträgt 0,03 mg / ml (Mittelwert von Duplikat). Da das Verdünnen der Probe mit dem Probenpuffer (6 + 40) / 6 ist die ursprüngliche Probenkonzentration 0,23 mg / ml. Da das endgültige Volumen der Partikelpräparat 0,2 ml, insgesamt SDF-1α in der endgültigen Suspension von 0,046 mg. Unter Berücksichtigung der zugeführten Masse von SDF-1α in der Reaktionsmischung ist 0,08 mg, die Einschlusseffizienz von SDF-1α in den DS-CS-Teilchen beträgt 57%. Zettelosan wurde früher berichtet, mit Coomassie-Blau-Farbstoff. Die Färbung ist jedoch nicht in der in 4A gezeigten Gels signifikant. Es ist vielleicht zu der Menge an Chitosan (Teilchenmatrix) auf das Gel geladen bezogen. In jedem Fall ist eine vollständige Dissoziation und Abtrennung von SDF-1α aus der Partikelmatrix zur genauen Bestimmung der Menge des eingebrachten Proteins notwendig. Dieses Gel zeigt auch, dass SDF-1α ist nicht nachweisbar durch Erhitzen bei 100 ° C für 10 min abgebaut oder durch Wirbelprozess, da keine Banden zwischen SDF-1α-Protein-Bande, und die Farbstoff-Front vorhanden.
Die in vitro-Freisetzungsrate von SDF-1α aus den Nanopartikeln wird durch Inkubation der Partikel in 50% D-PBS bei 37 ° C für 7 Tage bestimmt. Bei 0 h, 3 h, 8 h, 24 h, 48 h und 7 Tagen werden Aliquote der Proben entnommen und sofort zentrifugiert. Das frei SDF-1α (im Überstand) von der partikelgebundenen SD abgetrenntF-1α (Pellet). Die Proben werden auf einem SDS-Gel laufen gelassen, und die Menge an SDF-1α in den Überständen und Pellets werden durch Coomassie-Färbung und Densitometrie-Analyse bestimmt. Ein typisches SDS-Gel der Analyse ist in Abbildung 5 dargestellt. Wie gezeigt, wird das Partikel gebunden SDF-1α minimal nach einer 7-tägigen Inkubation freigesetzt.
Die Aktivität des partikelgebundenen SDF-1α ist ein Migrationsassay (chemotaktischen Assay) gemessen wird, und im Vergleich zu der freien SDF-1α. In diesem Assay wird SDF-1α in den DS-CS Nanopartikel seriell mit Migrationspuffer verdünnt und mit Jurkat-Zellen für 2 Stunden inkubiert. Die migrierten Zellen mit einem Durchflusszytometer gezählt. Die Daten (mit SDF-1α-Konzentrationen von 0,05 bis 11 ng / ml) werden mit nicht-linearer Regression Fitting aufgetragen, und die EC 50 berechnet. Wie in 6 gezeigt, wird die Partikel-gebundenen SDF-1α induzierte das gleiche Ausmaß an Migration als die des freien SDF-1 ^5; bei allen Konzentrationen gemessen. Die EC 50 -Werte der freien und der Partikel-gebundenen Formen von SDF-1α sind 0,55 und 0,45 ng / ml.
Abbildung 1. Analyse Screenshot zeigt die dynamische Lichtstreuung Messung der Partikelgröße. Die beiden oberen Felder zeigen die Grundstücke der Autokorrelationsfunktion, G2 (τ) und Logarithmus [G2 (τ) -1] über die Zeit. Des Instruments digitalen Signalprozessor (Korrelator) drückt die detektierte Lichtintensität als Funktion der Verzögerungszeit (τ). Die Kurve zeigt, dass SDF-1α-DS-CS-Partikel verursacht einen exponentiellen Abfall der Intensität zwischen 0,2 bis 2 ms. Um die durchschnittliche Zerfallskonstante erhalten <Γ>
Abbildung 2. Analyse Screenshot zeigt elektrophoretischen LichtstreuungMessung von Partikel Zeta-Potential. Das obere Feld zeigt einen G2 (τ) über die Zeit Grundstück. Die allmählich abklingende oszillierende Funktion ist typischerweise in geladene Teilchen, die Elektrophorese und die Lichtstreuung unterzogen werden beobachtet. Die Funktion entspricht der Frequenzverschiebung (Doppler-Verschiebung) durch die sich bewegenden Teilchen im elektrischen Feld verursacht wird. Eine Fourier-Transformation der G2 (τ) gibt die in der Mitteltafel gezeigten Leistungsspektrum (Intensität gegen Frequenz Grundstück). Das Zentrum der Frequenzverschiebung Peak definiert die Beweglichkeit der Teilchen, aus denen das Zeta-Potential berechnet. Die berechnete Zetapotential wird an der Unterseite des Bildschirms angezeigt.
Abbildung 3. Teilchengrößenmessung von SDF-1 α-DS-CS-Teilchen nach dem Einfrieren und Auftauen in Wasser. In Abwesenheit von Mannit, bilden die Teilchen agKörnungen nach Einfrieren und Auftauen. Beachten Sie die Ausbildung einer zusätzlichen Intensitäts / size Peak und die Zunahme der Kumulanten Durchmesser und die Polydispersität im Vergleich zu der von 1.
Abbildung 4. Quantifizierung der SDF-1 α Einbau in DS-CS-Nanopartikeln. (A) Fotographie der Coomassie gefärbten SDS-Gel mit kosten SDF-1α Standards DS-CS-Nanopartikel (Strg NP) und SDF-1α-DS geladen CS-Nanopartikel (SDF-1α NP) Proben wie angegeben. Die SDF-1α Proteinbanden und das Gel läuft Farbstofffront sind gekennzeichnet. Die Strg NP Proben nicht mit Coomassie-Blau und der Chitosan-Bands (breit) sind vage sichtbar gefärbt. (B) Die Bänder werden mit einem Densitometer, aus dem der Standardkurve wird mit den freien SDF-1α Standards gebaut (durchschnittlich duplica analysiertte). Die Menge an SDF-1α in den Nanopartikeln gegen die Standardkurve, die einen Mittelwert von 0,3 & mgr; g / Vertiefung (10 ul) gibt, berechnet.
Abbildung 5. SDS-Gels, SDF-1-α in vitro Freisetzungszeitverlauf. Coomassie-gefärbten SDS-Gel zeigt die Menge an freigesetztem SDF-1α (in Überständen) und SDF-1α (Pellets) nach Inkubation von SDF-1α-DS -CS Nanopartikel bei 37 ° C für verschiedene Zeiträume. Mit freundlicher Genehmigung von 9 neu gedruckt.
Abbildung 6. Dosis-Antwort-Kurven von SDF-1 α (Kreise) und SDF-1α Nanopartikel (NP) (Quadrate) in einer Jurkat-Zellmigrationsassay. SDF-1α in sowohl freier als auch Nanopartikel zur gebundenenms zeigte die gleiche Tätigkeit mit EC 50 Werte von 0,55 und 0,45 ng / ml. Mit freundlicher Genehmigung von 9 neu gedruckt.
Wie oben erwähnt, werden die DS-CS Nanopartikeln durch Ladungsneutralisation zwischen Polyanion (DS) und Polykation (CS) Molekülen gebildet. Da die Ladungswechselwirkung während der Molekular Kollision leicht, die Konzentration der Polymerlösungen und die Rührgeschwindigkeit beim Vermischen von entscheidender Bedeutung für die Größe der resultierenden Teilchen. Ein genereller Trend ist, dass mehr DS und CS-Lösungen 15 und höhere Rührgeschwindigkeit Ergebnis in kleinere Partikel verdünnt.
Die Formulierung der SDF-1α Glykan Nanopartikel können variiert werden. Zum Beispiel können die Mengen und Verhältnisse der SDF-1α / DS / CS in diesem Protokoll verwendet werden 0,08 / 0,33 / 1 (mg / mg / mg) auf. Abhängig von der beabsichtigten Verwendung des SDF-1α Nanopartikel können diese Verhältnisse ändern. Wenn die Menge an SDF-1α zu der Mischung zugegeben 0,04 mg (0,04 / 0,33 / 1, mg / mg / mg) anstelle von 0,08 mg, wobei die Partikel kleiner sind, ~ 650 nm und die SDF-1α Einschlußeffizienz geringfügig größere, 70-80% 9. Wenn jedoch in vivo geliefert, eine größere Menge des Glycans Matrix pro SDF-1α vorliegen. Wenn eine kleinere Teilchengrße gewünscht wird, kann die Formulierung von SDF-1α Glykan Nanopartikeln weiter modifiziert werden. Eine Alternative ist, ein geringeres Molekulargewicht Chitosan verwenden, wie in Ref 15 gezeigt. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass Chitosan hat eine hohe Affinität für Endotoxin (negativ geladene Lipopolysaccharide); Somit ist ein Test der Endotoxingehalt oder potentiell eine Reinigung für die Verwendung von Chitosan-Produkte vor der in-vivo-Zufuhr notwendig. Die zweite Alternative ist die SDF-1α auf vorgeformte kleinen DS-CS-Nanopartikeln zu laden. Da letztere leichter in Teilchengröße und SDF-1α manipuliert werden soll, eine hohe Affinität für DS, Laden einer kleinen Menge an SDF-1α an den äußeren Mantel der DS-CS Teilchen in kleinere Teilchen führen.
Verglichen mit anderen Arten vonNanopartikel (zB PLGA 11, Polyanhydrid 12 oder Gelatine-Nanopartikel 13), haben die DS-CS-Nanopartikel bestimmte Vor- und Nachteile. Die wesentlichen Vorteile der DS-CS-Nanopartikeln sind: 1) die Partikel Zubereitung enthält organische Lösemittel oder kräftige Beschallung nicht um. Es ist daher für die Proteinfaktor Einarbeitung als schonende Zubereitung verringert die Wahrscheinlichkeit Proteininaktivierung; 2) die Matrix der Partikel hat eine ähnliche strukturelle Eigenschaft als extrazelluläre Matrix, die mit Gewebe-Umgebung kompatibel der Partikel macht und weniger toxischen und entzündlichen; und 3) Glycan partikelgebundenen SDF-1α ahmt einen natürlichen Bindungsbeziehung zwischen dem Protein und der extrazellulären Matrix, die die volle chemotaktische Aktivität von SDF-1α, nachdem sie in die Teilchen einge Glykan erläutert. Das vollaktive SDF-1α in der partikelgebundenen Form erlaubt es, als stationäre Referenzfaktor im Gewebe e dienennvironment. Die Beschränkungen der DS-CS Nanopartikel sind: 1) die Durchmesser der Teilchen im allgemeinen grßer als die oben genannten Teilchen; und 2) leicht in Salzlösungen, die nicht für die direkte Injektion in den Blutkreislauf sein kann zusammenbrechen.
Die Partikel-gebundenen SDF-1α gefunden wird minimal von den Nanopartikeln nach einem siebentägigen Inkubation freigesetzt werden. Dieses Phänomen ist auf die hohe Affinität von SDF-1α für Heparin, das auch dazu beiträgt, seine Funktion in vivo bezogen. Da Proteine mit Heparin-bindenden Domänen in der Regel unterschiedliche Affinitäten für Heparin, ihre Freisetzungsraten wahrscheinlich abweichen. Zum Beispiel wird in einem VEGF 165 -DS- CS Nanopartikel in einer ähnlichen Formulierung hergestellt wurde, wurden 44% der einge VEGF 165 in der ersten Stunde freigesetzt und 29% wurde in der nächsten 47 Stunden bei Inkubation bei 37 ° C 14 freigegeben. Daher ist die in vitro-Freisetzungsmuster für einen bestimmten protEin muss individuell getestet werden.
Der Zweck der Aufstellung von SDF-1α-DS-CS-Nanopartikeln ist die SDF-1α in Lunge und stellen Sie eine Stammzell-Referenzsignal in das Gewebe. Die Partikel können auch auf andere Gewebe für den gleichen Zweck geliefert werden, obwohl die spezifischen Nanopartikel Format nicht für festes Gewebe Injektion erforderlich. Die Tatsache, dass SDF-1α wird von DS in der Nanopartikelmatrix stabilisiert und minimal von den Partikeln freigesetzt unterstützt Stammzellenrekrutierungsprinzipien und das Teilchen wird erwartet, vorteilhaft für die Geweberegeneration zu sein.
Da die Protein-Glycan-Nanopartikel haben eine ähnliche Matrix zu der Zelloberfläche und der extrazellulären Matrix, Glycosaminoglycane, ist es möglich, dass die Partikel-Proteine eingearbeitet in diese Matrizen ausgetauscht werden (Die negativ geladenen extrazellulären Matrixmolekülen kann mit der Bindung des positiv konkurrieren geladenen Protein) in vivo . Dieser Austausch kann die Protein-Freisetzungskinetik zu verändern, und somit muss, nach der anfänglichen in vitro-Charakterisierung weiter untersucht werden.
The authors declare that they have no competing financial interests.
HL671795, HL048743 und HL108630: Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
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