Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Hier werden wir ausführlich eine Methode, um Kultur Zahnkeime im Unterkiefer Scheiben mit einem Gewebe-Chopper. Diese Methode ermöglicht einen einzigartigen Zugang zu den Zahn während der Entwicklung und bietet eine ausgezeichnete Gelegenheit für die Manipulation und Abstammung Verfolgung, nicht verfügbar mit traditionellen Kulturverfahren.

Explantatkultur ermöglicht die Manipulation der Entwicklung von Organen zu bestimmten Zeitpunkten und ist damit eine wichtige Methode für die Entwicklungsbiologe. Für viele Organe ist es schwierig, die Entwicklung Gewebe zugreifen Überwachung während der Ex-vivo-Kultur zu ermöglichen. Die Scheibe Kulturverfahren ermöglicht den Zugang zu Gewebe, so daß morphogenetische Bewegungen folgen und spezifischen Zellpopulationen zur Manipulation oder Linienverfolgung richtet sein.

In diesem Beitrag beschreiben wir eine Methode der Schnittkultur, die sehr erfolgreich für Kultur der Zahnkeime in einer Reihe von Arten war. Das Verfahren stellt eine hervorragende Anbindung an die Zahnkeime, die mit einer ähnlichen Rate wie in vivo zu beobachten, durch die andere Backe Gewebe umgeben zu entwickeln. Dies ermöglicht Gewebe Wechselwirkungen zwischen dem Zahn und dem umgebenden Gewebe zu überwachen. Obwohl dieses Papier konzentriert sich auf die Zahnkeime, kann das gleiche Protokoll verwendet werden, um die Entwicklung einer Reihe folgenvon anderen Organen, wie Speicheldrüsen, Meckel-Knorpel, Nasendrüsen, Zunge und Ohr.

Für eine Anzahl von Versuchen ist es wichtig, in der Lage, Gewebekultur ex vivo, um die Entwicklung zu verfolgen. Kultur entwickeln Gewebe Zugang zu bestimmten Perioden der Entwicklung und ermöglicht die Manipulation von Genen, die durch die Zugabe von Faktoren, zu dem Kulturmedium, oder beladenen Kügelchen und durch die Verwendung von ^{1-Transfektion} und Elektroporation. Für viele Experimente ist es wichtig, in der Lage, um das Gewebe zu visualisieren, wie es wächst, zum Beispiel, um das Schicksal der Linie markierten Zellen folgen, wie das Gewebe erfährt Morphogenese sein. Dies kann besonders problematisch für Gewebe, die tief innerhalb des Embryos entwickeln, die nicht offensichtlich sind, wenn ein Block von Gewebe aus dem Embryo kultiviert werden. Die Zähne sind gute Beispiele dafür, wie sie in den Unterkiefer, Oberkiefer-und Stirnnasen Prozess zu entwickeln. Wenn die ganze Unterkiefer ist kultiviert die oberflächlichen Strukturen des Zahnes können angezeigt, aber Veränderungen in der Morphologie kann nur analysiert werden, nachdem Schneiden von fixiertem Gewebe 2. Wir haben eine Live-Scheibe Kulturtechnik ermöglicht es uns, Zahnkeim Entwicklung zu folgen und den Zugang zu den verschiedenen Teilen des Zahnes während der Entwicklung angepasst. Die Technik Kulturen die Zahnkeimscheiben an der Gas-flüssig-Grenzfläche, mit einem modifizierten Verfahren Trowell ^3. Diese Scheibe Kulturen wurden direkt nach der Morphogenese des Zahns und damit Linie Verfolgung unterschiedliche Komponenten, wie beispielsweise die Schmelz Knoten und Zahnpapille und Follikel ^1,4-7 sehr nützlich. Die Technik ist nicht auf Maus-Embryonen beschränkt und hat erfolgreich die Kultur Live-Scheiben von Schwein und Schlange Zahngewebe ^8,9 verwendet. Zusätzlich zu dem Vorteil, dass die Zahnentwicklung sichtbar, weist die Scheibe Verfahren auch den Vorteil, dass die dünnen Scheiben von Gewebe haben Zugang zu Nährstoffen aus dem Medium und Luft aus dem Inkubator erhöht. Dies führt zu einem verbesserten Wachstum der Zahnkeime, die Entwicklung in vivo übereinstimmen, und zeigen INVASIonen von Endothelzellen in die Papille ^7. Im Gegensatz Zahnkeime ganz Kiefer Kulturen entwickeln langsamer als die in vivo und die Mitte der Kultur häufig nekrotische in Langzeitkulturen. In Schnittkultur entwickelt der Zahn innerhalb einer Scheibe des Kiefers, und seine Wechselwirkung mit dem umgebenden Knochen zu entwickeln und in anderen Geweben beobachtet werden. In unserem Verfahren wird das Gewebe unmittelbar nach Präparation ohne die Notwendigkeit, in einem Trägermedium ^10,11 einzubetten und keine Notwendigkeit für jedes System, das Gewebe an den Hackblock befestigen zerhackt. Das Verfahren ist daher nicht-invasive und schnell, so dass viele Unterkiefer in einer Sitzung geschnitten werden.

1. Aufbauen

1. Schärfen Sie die Dissektionsinstrumente (mit einem Schleifstein mit Mineralöl geschmiert) und zu sterilisieren, bevor für Organkultur verwenden mit einem 70% igem Ethanol Spray-und Trockenhitzesterilisation. Schärfen Sie die Dissektion Nadeln mittels Elektrolyse in 2 M Natriumhydroxid mit einem 12-V-Versorgung.
2. Vorbereitung der für die Präparation und Kultur von embryonalen Organen verwendete Kulturmedium, bestehend aus Erweiterte Dulbeccos Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) mit Glutamax 1% und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt.

2. Embryo Dissection

1. Cull eine zeitgesteuerte gepaart schwangere Frau, die einen Zeitplan ein Verfahren durch das Innenministerium oder anderen leitenden Gremium genehmigt. Präparieren Sie sich die Haut um die Unterbauch, und schnitt den Bauch mit einer Schere. Suchen Sie die beiden Uterushörner, die zusammen an der unteren Mittellinie zu verbinden.
2. Präparieren Sie sich die Gebärmutter und in ein Rohr mit Medium auf Eis gefüllt. When auf Eis, kann das Gewebe für mehrere Stunden stehen gelassen werden.
3. Entfernen der Gebärmutter und in einer Petrischale in Medium unter dem Mikroskop. Wo möglich Embryo Dissektionen sollten in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt, um eine Kontamination zu minimieren.
4. Präparieren Sie sich die Embryonen aus der Gebärmutter und befreien sie von ihrer extra Gewebe.
5. Enthaupten die Embryonen mit einem Wolfram-Nadel und übertragen Sie die Köpfe in ein frisches Gericht Medium.
6. Isolieren Sie die Unterkiefer von den Köpfen, indem eine Nadel in die Mundhöhle durchtrennt und in Richtung der Rückseite des Kopfes (1A und 1B). Isolierte Unterkiefer können vorübergehend in Medium auf Eis während der Wartezeit für das Hacken gespeichert werden.
7. Für ganze Unterkiefer Scheiben inszeniert E11.5-E15.5 sind ideal für Zahnkeim Kultur. Nach E15.5 die Entwicklungs Knochen im Unterkiefer ist zu hart für das Hacken. Zahnscheiben können immer noch gemacht werden, aber die Knochen (Dentale und Bildung Alveolarknochen) zuerst entfernt werden, indemDissektion vor ⁹ hacken. Entfernen Sie vorsichtig mit Knochen Wolfram Nadeln und Pinzette.

3. Embryo Slicing

1. Bereiten Sie die Unterkiefer von Gewebeschnitten mit einem Standard-Tabelle Gewebe Chopper (Abbildung 1C). Verwenden Sie eine frische Klinge nach etwa 200 Unterkiefer, und stellen Sie sicher, dass es bündig mit der Befestigungsscheibe, wenn er fällt.
2. Reinigen Sie die Befestigungsscheibe und die Klinge mit 70% Ethanol vor dem Gebrauch. Vorsicht ist bei der Verwendung der Maschine genommen werden, da die Klinge ist sehr scharf.
3. Gesetzt den Chopper bei einer Schnittdistanz von 200-400 &mgr; m nach dem Alter der Probe, und je nachdem, ob die gesamte Zahnkeim erforderlich. Stellen Sie die Klinge Kraft auf Maximum.
4. Die Übertragung eines Unterkiefers mit dem Kunststoffbefestigungsscheibe mit einer Pipette oder Pinzette. Ordnen Sie den Unterkiefer auf der Disc machen, dass die Orientierung ist immer noch klar. Die Entwicklungs Zunge kann als nützliche Orientierungspunkt für die Bestimmung Orientierung verwendet werden. Für Backenzähne Verwendung afRontal / Querorientierung (siehe Ebene der Hacken in Abbildung 1B), während für Schneidezähne verwenden einen sagittalen Schnitt durch den Unterkiefer, die unterschiedliche Ausrichtung dieser Zähne zu reflektieren, wie sie wachsen (siehe Ebene der Hacken in Abbildung 2A).
5. Entfernen Sie das überschüssige Medium aus der ganzen Verwendung von Filterpapier, um den Unterkiefer auf der Montagescheibe leicht trocknen das Gewebe.
6. Unmittelbar nach dem Trocknen, legen Sie die Disc auf der kreisförmigen Edelstahl-Tabelle der Chopper. Schalten Sie das Gerät ein und drücken Sie Start. Die Tabelle läuft automatisch von links nach rechts, während gleichzeitig die Schneide tragenden Arm der Klinge angehoben und fallen bis zu 200 Hübe / min.
7. Schalten Sie das Gerät, wenn das Gewebe vollständig geschnitten worden. Achten Sie darauf, die Klinge Arm in der erhöhten Position und entfernen Sie die CD. Stellen Sie keine Finger unter der Klinge Arm oder verlassen die Maschine unbeaufsichtigt hacken.
8. Nehmen Sie die Montagescheibe und sofort Medium to die Scheiben auf der Disc, um eine übermäßige Austrocknen zu verhindern. Sorgfältig verdrängen die geschnittenen Gewebes von der Unterseite der Scheibe unter Verwendung eines Wolfram-Nadel und dann Pipette in eine kleine Petrischale Medium (2A).
9. Trennen Sie die Scheiben mit einer Nadel und Gewebeschnitten, die das Gewebe von Interesse unter einem Stereomikroskop (1D, 1E, und 2B) und wählen Sie dann. Zeigen ausgewählten Scheiben in frische Kulturschalen mit Medium.

4. Slice-Kultur-

1. Vorbereitung zentralen Vertiefungen Organkulturschalen bereit Kultur durch Zugabe von etwa 2 ml autoklaviertem Wasser zu der äußeren Wanne, um Austrocknung zu vermeiden, und durch Positionieren eines Metallgitters in der Mitte der Schale (3A und 3B).
2. Bereiten Metallgitter von Schneidleisten ca. 4 cm x 1,5 cm aus Platten aus Edelstahlgewebe. Verwenden Sie einen Locher, um ein Loch in der Mitte machen und beugendie Seiten, um eine gestaffelte Ende zu schaffen. Das Gitter sollte auch über den zentralen Flach passen, parallel zum Boden der Schale (3A und 3B) liegen. Autoklavieren die Gitter vor dem Einsatz zu sterilisieren.
3. Schneiden Sie ein Stück transparenten Polyethylenterephthalat (PET)-Membran (Porengröße 0,4 um) groß genug, um das Loch im Gitter abzudecken. Setzen Sie den Schnitt Membran in die Schale mit dem ausgewählten Scheibe.
4. Legen Sie die Scheibe auf der Membran und dann heben Sie die Membran aus dem Medium, mit Scheibe in der Mitte abgeflacht.
5. Platzieren des Filters auf dem Gitter über dem kreisförmigen Loch in der Mitte, und fügen etwa 1 ml Kulturmedium zu dem Brunnen bis zur Ebene der Membran.
6. Manipulationen hinzuzufügen Proteine ​​oder niedermolekulare Inhibitoren zu dem Medium (zum Beispiel ^8).
7. Fotografieren Sie das Stück für einen Datensatz der Morphologie am Tag 0 der Kultur.
8. Die Schalen werden in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO _{2 bei 37 ° C in einem Inkubator.}
9. Fotografieren Sie die Kulturen in regelmäßigen Abständen auf durchschnittlich 7 Tage. Ändern Sie das Kulturmedium alle 48-72 Std. Für die Fotografie sehen Sie die Scheiben mit einer Lichtquelle von unten (2C-E).

5. Lineage Tracing

Wenn Linie Verfolgung erforderlich ist, können lipophile Farbstoffe wie Dil oder DiO in die Zahnkeim vor Schritt 4, Scheibe Kultur eingespritzt werden.

1. Ziehen Glaskapillare Nadeln mit einer Nadel Magnet.
2. Brechen Sie die Spitze der Nadel mit einer Pinzette und legen Spitze nach unten in die Farbstofflösung. Lassen Sie für ein paar Minuten, während der Farbstoff füllt die Spitze durch Kapillarwirkung.
3. Legen Sie die gefüllte Nadel in eine Halterung und befestigen Sie über Schläuche mit einem Injektor oder Mund Sauger.
4. Positionieren Sie die Spitze der Nadel in dem Kulturmedium berühren den Bereich der Scheibe durch gekennzeichnet werden. Druckluft beaufschlagen, um eine kleine Menge des Farbstoffs aus der Nadel ein verdrängenauf das Gewebe d.
5. Entfernen Sie die Nadel und überprüfen Sie für die Kennzeichnung unter Fluoreszenz.
6. Erfolgreich markierten Scheiben können auf Filter übertragen und kultiviert werden, wie in Schritt 4 beschrieben.

Um die Bewegung des ersten Backenzahnsäckchen zu verfolgen, wurden 250 &mgr; m Frontalschnitten durch einen Unterkiefer unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Zahnfollikel ist die Schicht des Bindegewebes, die die äußere Schmelzepithels (OEE) der Entwicklungs Zahn umgibt, und war zuvor gezeigt worden, um an der Bildung von Gewebe des Zahn ⁶ zu nehmen. Mandibles wurden bei E14.5, die Kappe Stadium der Zahnentwicklung seziert. In der Scheibe war der Umriss des Zahn Epithel klar, und die Kondensation Zahn Mesenchym könnte als ein dunkler Ring um den Zahn Epithel (4A) identifiziert werden. Dil wurde im Mesenchym neben dem äußeren Schmelz Epithel der Zahnscheibe auf der lingualen Seite (4A) eingespritzt. Nach der Markierung wurden die Scheiben für 4 Tage kultiviert und in Abständen fotografiert (Fig. 4B und 4C). In vivo würde die Zahnanlagen erreicht habendie Glocke der Bühne von E18.5 und eine deutliche Glockenstadium Form wurde in den Scheiben beobachtet, was auf eine ähnliche Entwicklung in diesem Zeitraum. Der Fleck des DiI gesehen wurde, in ein Band von Zellen, die sich um den äußeren Zahn Epithel der Zahn aufgewachsen (Fig. 4B und 4C) erstrecken.

Fig. 1 ist. Die Bildung von Live-Scheiben. (A) E14.5 Embryos. Gestrichelte Linien zeigen die mit einem Nadelschnittebenen zerlegt, beginnend mit dem unteren Schnitt für Enthauptung. (B) Dissected Unterkiefer. Die Zunge nach unten zeigt. Die Schnittebene für das Gewebe Chopper mit gestrichelten Linien dargestellt. (C) Tissue Chopper zeigt Klinge Arm (BA) und weiß Montagescheibe (MD) mit vorbereiteten Probe (Pfeil). (D) Vertreter Schnitt durch die Mol-Region. Pfeile zeigen auf Backenzahn Keime. (E) Hohe Leistungs Ansicht eines Molaren Slice. Der Zahnkeim Epithel ist mit schwarzen Flecken skizziert. Bilder mit Photoshop geschärft. T = Zunge, DB = Zahnbein, MC = Meckel-Knorpel. Maßstabsbalken in A = 3 mm. Maßstabsbalken in B & D = 1 mm. Maßstabsbalken in E = 500 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

2. Schneidezahn und Bodenkultur. (A) E12.5 Unterkiefer, die sagittal gehackt hat. Entwicklung Schneidezähne (umrissen weißen Flecken mit Stern) und Unterkieferspeicheldrüsen (mit schwarzen Flecken skizziert und Pfeil) können nur gemacht werden aus. (B) Gleiche Kiefer zeigt zentrale 4 Scheiben abgetrennt. Die Entwicklungsunterkieferspeicheldrüse cals eine Knospe durch verkürzte Mesenchym (Pfeilspitzen) in den zwei seitlichen Abschnitte (oben des Bildes) umgeben ein gesehen werden. Die Kondensations Mesenchym um die Drüse ist rot umrandet. Die Schneidezähne sind an der Epithelverdickung Stufe (Stern) in den beiden zentralen Scheiben (unten im Bild). (C) Sagittal-Schnitt durch einen Schneidezahn bei E14.0 an Tag 0. (D) Gleiche slice 1 Tag später. (E) Gleiche Scheibe nach 3 Tagen in Kultur. (CE) Pfeil zeigt auf Schneide-und Form Lippen-Hals-Schleife. Pfeilspitze zeigt auf die Entwicklung Kieferspeicheldrüse. In der Kultur der Zahnkeim erstreckt sich nach hinten, wie die Hals-Schleifen zu wachsen, während der Speicheldrüse weiter zu unterziehen Verzweigung Morphogenese und Lumenbildung. Bilder mit Photoshop geschärft. T = Zunge, MC = Meckel-Knorpel. Maßstabsbalken in A & B = 1 mm. Maßstabsbalken in C, D, E = 500 um. Klicken Sie hierfür eine größere Abbildung zu sehen.

3. Kultur-Methode. (A) Cultured Slice. Die Kultur sitzt auf einem transparenten Filter über ein Metallgitter über Medium suspendiert. Ein Loch in dem Gitter kann die Scheibe mit Licht von unten dargestellt werden. (B) Schematische Darstellung der Kultur-Methode.

4. DiI Markierung der Zahnfollikel. (AC) verschmolzen Licht-und Dunkelfeld-Bilder, die die Entwicklung Backenzahn Keim und Ort der Linie Dil-Label. (A) Tag 0. Der Zahnkeim (Pfeilspitze) ist an der Kappe Bühne. Dil markiert Zellen des Follikels an der lingualen Seite des Zahns. (B ) 1. Tag. (C) 4. Tag. Der Zahnkeim die Glocke Stadium erreicht hat und die DiI markierten Zellen gesehen werden, um in einem Bogen um den Entwicklungsaußen Schmelzepithels auszubreiten. Bilder in Photoshop nach dem Zusammenführen Schichten mit den Bildschirm-Modus geschärft worden. Epithel der Zahn skizziert mit schwarzen Flecken. DP = Zahnpapille innerhalb des inneren Schmelzepithels liegt. DF = Zahnfollikel, die um die Außen Schmelzepithels läuft. MC = Meckel-Knorpel. Maßstabsbalken in A, B, C = 500 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Diese Methode der Zahn Kultur hat den Vorteil, dass an der Zahnkeime zuzugreifen ist ausgezeichnet, was eine genaue Linienverfolgung und die Platzierung der Perlen im Epithel oder Mesenchym. Definierte Bereiche der Entwicklungszahnkeim kann deshalb gezielt angegangen werden. Während der Kultur der Veränderung der Morphologie der Zahnkeim verfolgt werden kann, und die Wirkung von Manipulationen schnell beurteilt.

Das Verfahren ist jedoch nur für kleine Zahnkeime, bevor eine wesentliche Bildung von harten Geweben, wie Dentin und Schmelz geeignet, da diese nicht genau geschnitten werden. Für Unterkiefer nach E15.5 ist es notwendig, die Knochen vor Hacken entfernen. Dies hat den Nachteil potentiell eine Beschädigung der Zahnkeime, die eng mit dem Knochen aus E16.5 zugeordnet ist. Wir haben erfolgreich zu postnatalen Tag 4 in Scheiben zerschnitten Zahnkeime auf, nach der die Zahn zu hart für den Zerhacker aufgrund der Ablagerung von Zahnschmelz schneiden. Die Scheibe methode funktioniert gut auf Zahnkeime aus E13.5, dh die Knospenstadium ^1,6. Vor diesem Zeitpunkt, wenn der Zahn ist an der Epithelverdickung Bühne, tun die Zahnkeime zu entwickeln, aber die Erfolgsquote reduziert und die Morphologie kann auf lange Sicht beeinträchtigt werden.

Ein wesentlicher Nachteil des Verfahrens ist, dass die Schneide tritt zufällig durch den Zahn. In einigen Scheiben eine ganze Zahnkeim wird innerhalb einer Scheibe gefunden werden, während in anderen die Chopper können den Zahnkeim durch die Mitte geschnitten. Dies bedeutet, dass es schwierig sein kann, eine große Anzahl von identischen Scheiben zu erhalten. Um dieses Problem zu bekämpfen, ist es möglich, eine Scheibe in der Mitte aufteilen und die rechte und die linke Seite als Versuchs-und Kontroll. Dafür ist jedoch der Unterkiefer sorgfältig auf der Lochscheibe angeordnet werden, um sicherzustellen, dass die Scheibe symmetrisch geschnitten. Für einige Experimente ist es ein Vorteil, dass die Zahnscheiben zerlegen, so dass die internen Strukturen, wie beispielsweise die SchmelzKnoten, für die Kennzeichnung Linie ⁴ erreicht werden. Der Zahnkeim scheint sehr robust und solche Halbzahnkeime sind in der Lage, in der Kultur gut entwickeln, wie zuvor in halbierten Backenzahn Keime ^12,13 gezeigt.

Als Alternative zur Kultur in Scheiben schneiden, können Zahnkeime aus dem Unterkiefer und isoliert ¹⁴ kultiviert seziert werden. Dadurch wird das Problem der schlechten Ernährung und Sauerstoffversorgung mit Kultivierung große Blöcke von Gewebe verbunden und führt zu einer guten Zahnentwicklung, sondern als Folge der Zahn entwickelt ohne Interaktion mit dem umgebenden Gewebe. Wenn große Mengen der umgebenden Mesenchym entfernt die Anzahl der Zahnkeime, die sich bilden können verändert werden, was die Bedeutung des umgebenden Bindegewebes bei normalen Zahnentwicklung ^15. Schnittkultur ist deshalb eine gute Methode zur Untersuchung der Interaktion von Gewebe, zum Beispiel, wie der Knochen-und Zahn bei der Bildung des Alveolarknochens zusammenwirken oder wie die saliDrüsen variieren interagieren mit der Zunge und Mund Epithel, etwas, das verloren geht, wenn diese Gewebe isoliert, kultiviert.

In diesem Dokument werden die Verwendung dieser Verfahren für die Kultivierung der Zahnkeime, aber das gleiche Verfahren ist auch für die Kultivierung Entwicklungsunterkieferspeicheldrüsen und sublinguale und nach der Entwicklung der Struktur, wie Meckel-Knorpel (Figur 2).

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Sarah A. Alfaqeeh wird durch Art Saud University College of Dentistry, Ministerium für Höhere Bildung, Königreich von Saudi-Arabien finanziert.