أسلوب الثقافة شريحة لوبعد تطور الجراثيم الأسنان في يزدرع الثقافة

نحن هنا بالتفصيل طريقة للجراثيم الأسنان الثقافة في شرائح الفك السفلي باستخدام المروحية الأنسجة. هذا الأسلوب يسمح بالوصول فريدة من نوعها في الأسنان خلال التنمية، وتوفير فرصة ممتازة للتلاعب والنسب تتبع، لا تتوفر باستخدام أساليب الثقافة التقليدية.

الثقافة ازدراع يسمح بالتالي التلاعب في تطوير الأجهزة في نقاط زمنية محددة وغير وسيلة هامة للعالم الأحياء التنموية. بالنسبة للعديد من الأجهزة فإنه من الصعب الوصول إلى الأنسجة النامية للسماح برصد خلال فيفو السابقين الثقافة. يسمح أسلوب ثقافة شريحة الوصول إلى الأنسجة بحيث الحركات التخلق يمكن اتباعها ويمكن أن تستهدف السكان خلية معينة للتلاعب أو تتبع النسب.

في هذه الورقة نحن تصف طريقة للثقافة شريحة التي كانت ناجحة جدا للثقافة الجراثيم الأسنان في مجموعة من الأنواع. يوفر أسلوب الوصول ممتازة لجراثيم الأسنان، والتي تنمي بمعدل مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي، وتحيط بها الأنسجة الفك الأخرى. وهذا يسمح التفاعلات الأنسجة بين الأسنان والأنسجة المحيطة بها ليتم رصدها. على الرغم من أن هذه الورقة تركز على الجراثيم الأسنان، نفس البروتوكول يمكن تطبيقها لمتابعة تطوير عددمن الأجهزة الأخرى، مثل الغدد اللعابية، والغضروف ميكل والغدد الأنفية، واللسان، والأذن.

لعدد من التجارب من المهم أن تكون قادرة على زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمتابعة التنمية. ثقافة تطوير الأنسجة يوفر الوصول في فترات محددة من التنمية ويتيح التلاعب في الجينات من خلال إضافة عوامل في مستنبت، أو على حبات تحميلها، واستخدام ترنسفكأيشن و electroporation ^1. بالنسبة للعديد من التجارب من المهم أن تكون قادرا على تصور الأنسجة لأنها تنمو، على سبيل المثال، لمتابعة مصير الخلايا النسب وصفت بأنها الأنسجة يخضع التشكل. هذا يمكن أن يكون مشكلة خاصة بالنسبة للأنسجة التي تنمي في أعماق الجنين، والتي ليست واضحة عندما كتلة من الأنسجة من الجنين هو مثقف. الأسنان هي أمثلة جيدة على ذلك، لأنها تضع ضمن عملية الأنف الفك السفلي، الفك العلوي والأمامي. عندما يتم زرعها في الفك السفلي كله الهياكل السطحية من الأسنان يمكن أن ينظر إليها ولكن التغييرات في مورفولوجية لا يمكن تحليلها بعد باجتزاء الأنسجة الثابتة 2. تكيفنا حية شريحة التقنية الثقافة مما يسمح لنا لمتابعة تطوير جرثومة الأسنان وتوفير سبل الوصول إلى أجزاء مختلفة من الأسنان خلال التنمية. ثقافات تقنية شرائح الجرثومية الأسنان في واجهة الغاز السائل، وذلك باستخدام طريقة تراويل تعديل ^3. وكانت هذه الثقافات شريحة مفيدة جدا في التشكل التالية مباشرة من الأسنان، والسماح تتبع نسب مكونات متميزة، مثل عقدة المينا والحليمة السنية وبصيلات ^1،4-7. تقنية لا يقتصر على أجنة الفئران وتمت بنجاح استخدمت لثقافة شرائح حية من الخنزير والثعبان الأسنان ^8،9 الأنسجة. بالإضافة إلى الاستفادة من القدرة على تصور نمو الأسنان، لديه طريقة شريحة أيضا ميزة أن شرائح رقيقة من الأنسجة وزيادة فرص الحصول على المواد الغذائية من المتوسط ​​والهواء من الحاضنة. هذه النتائج في تحسين نمو جراثيم الأسنان، والتي تتطابق التنمية في الجسم الحي، وتظهر invasأيون الخلايا البطانية في الحليمة ^7. في المقابل، جراثيم الأسنان في الفك السفلي كله الثقافات تطوير أبطأ من تلك الموجودة في الجسم الحي ومركز للثقافة في كثير من الأحيان نخرية في الثقافات على المدى الطويل. في ثقافة شريحة والأسنان يتطور داخل شريحة من الفك، وتفاعله مع وضع العظام والأنسجة الأخرى المحيطة يمكن رصدها. في المنهج في آن والمفروم الأنسجة مباشرة بعد تشريح مع عدم وجود الحاجة إلى تضمين في المتوسط ^​​10،11 الدعم، وهناك حاجة لأي نظام لإرفاق الأنسجة لتقطيع كتلة. هذه الطريقة بالتالي موسع وسريع، مما يتيح العديد من الفك السفلي إلى أن مقطوع في جلسة واحدة.

1. نصب

1. شحذ أدوات تشريح (باستخدام الحجر شحذ مشحم مع الزيوت المعدنية) وتعقيم قبل استخدامها للثقافة الجهاز باستخدام رذاذ الايثانول 70٪ والتعقيم الجاف للحرارة. شحذ الإبر تشريح باستخدام التحليل الكهربائي في 2 M هيدروكسيد الصوديوم باستخدام 12 فولت العرض.
2. تحضير مستنبت تستخدم لتشريح والثقافة من أجهزة الجنينية، التي تتألف من التعديل النسر متوسطة F12 متقدمة Dulbecco و(F12 DMEM) تستكمل مع 1٪ و 1٪ GlutaMAX البنسلين الستربتوميسين.

2. تشريح الجنين

1. اعدام على توقيت تزاوج الإناث الحوامل باستخدام طريقة جدول واحد كما وافقت عليها وزارة الداخلية أو هيئة إدارية أخرى. تشريح بعيدا الجلد حول أسفل البطن، وخفض فتح البطن باستخدام مقص. تحديد موقع قرني الرحم، والتي تربط معا فى انخفاض خط الوسط.
2. تشريح خارج الرحم ومكان في أنبوب مملوء المتوسطة على الجليد. عرجن على الجليد، والأنسجة يمكن أن تترك لعدة ساعات.
3. إزالة الرحم ووضعه في طبق بتري في المتوسط ​​تحت المجهر. حيث يجب أن يتم تنفيذ تشريح الجنين ممكن في غطاء تدفق الصفحي للحد من التلوث.
4. تشريح الأجنة من الرحم وتحريرهم من أنسجتها خارج الجنين.
5. قطع رأس الأجنة باستخدام إبرة التنغستن ونقل رؤساء في طبق جديدة من المتوسط.
6. عزل الفك السفلي من رؤساء عن طريق وضع إبرة في تجويف الفم وقطع طريق نحو الجزء الخلفي من الرأس (أرقام 1A و 1B). الفك السفلي المعزولة يمكن تخزينها مؤقتا في المتوسطة على الجليد في انتظار تقطيع.
7. لشرائح الفك السفلي كله مراحل E11.5-E15.5 هي مثالية للثقافة الجرثومية الأسنان. بعد E15.5 العظام النامية في الفك السفلي من الصعب للغاية بالنسبة لتقطيع. لا يزال من الممكن جعل شرائح الأسنان ولكن لا بد أولا من إزالة العظام (مضرس وتشكيل العظم السنخي) من خلالتشريح قبل تقطيع ^9. ازالة العظام بعناية باستخدام الإبر التنغستن والملقط.

3. الجنين التقطيع

1. تحضير شرائح الأنسجة الفك السفلي باستخدام معيار المروحية الأنسجة الجدول (الشكل 1C). استخدام شفرة جديدة بعد ما يقرب من 200 الفك السفلي، والتأكد من أنها تقع مطاردة مع القرص تصاعد عندما يسقط.
2. تنظيف القرص تصاعد وشفرة مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام. يجب توخي الحذر عند استخدام الجهاز، وشفرة حادة جدا.
3. تعيين المروحية على مسافة القطع بين 200-400 ميكرون وفقا لعمر من العينة، واعتمادا على ما إذا كان يتعين على جرثومة الأسنان كلها. تعيين قوة شفرة على الحد الأقصى.
4. نقل الفك السفلي إلى قرص تركيب البلاستيك باستخدام ماصة أو ملقط. ترتيب الفك السفلي على صنع قرص من أن التوجه لا تزال واضحة. اللسان النامية يمكن استخدامها بوصفها معلما مفيدة لتحديد التوجه. لاستخدام الأضراس بالعربيةrontal / التوجه عرضية (انظر الطائرة من تقطيع في الشكل 1B)، في حين أن استخدام القواطع شريحة السهمي من خلال الفك السفلي لتعكس التوجه مختلفة من هذه الأسنان لأنها تنمو (انظر الطائرة من تقطيع في الشكل 2A).
5. إزالة الزائدة المتوسطة من مختلف أنحاء الأنسجة باستخدام ورق الترشيح من أجل لتجف قليلا من الفك السفلي على القرص في تصاعد مستمر.
6. مباشرة بعد التجفيف، ضع القرص على التعميم الجدول الفولاذ المقاوم للصدأ من المروحية. تحويل الجهاز على وبداية الصحافة. تقطع الجدول تلقائيا من اليسار إلى اليمين بينما في نفس الوقت يتم رفع الذراع تقطيع تحمل شفرة وانخفض بسرعة تصل إلى 200 السكتات الدماغية / دقيقة.
7. إيقاف تشغيل الجهاز مرة واحدة الأنسجة وقد شرائح تماما. تأكد من الذراع شفرة هو في موقف أثار وإزالة القرص. لا تضع أصابعك تحت الذراع شفرة أو ترك الجهاز غير المراقب عند تقطيع.
8. أخذ قرص تركيب وإضافة المتوسطة ر فوراس شرائح على القرص من أجل منع جفاف المفرطة. طرد بعناية الأنسجة شرائح من الجزء السفلي من القرص باستخدام إبرة التنغستن ثم ماصة في طبق بتري صغيرة من المتوسطة (الشكل 2A).
9. فصل شرائح باستخدام إبرة ثم حدد شرائح الأنسجة التي تحتوي على الأنسجة من الاهتمام في ظل stereomicroscope (أرقام 1D، 1E، و2B). وضع شرائح مختارة في أطباق ثقافة جديدة مع المتوسط.

4. شريحة الثقافة

1. إعداد أطباق الثقافة الجهاز المركزي مستعد جيدا للثقافة من خلال إضافة حوالي 2 مل من الماء تعقيمها إلى البئر الخارجي لمنع الجفاف، وعن طريق وضع شبكة معدنية عبر مركز الطبق (أرقام 3A 3B و).
2. إعداد شبكات معدنية بقطع الشرائط حوالي 4 سم × 1.5 سم من ورقة من شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ. استخدام لكمة ثقب لجعل حفرة في وسط وثنيالجانبين لخلق نهاية متداخلة. الشبكة يجب أن تناسب شقة في وسط البئر، والكذب موازية لقاع الطبق (أرقام 3A 3B و). الأوتوكلاف شبكات لتعقيم قبل الاستخدام.
3. قطع قطعة من البولي ايثلين تيريفثاليت شفافة (PET) الغشاء (حجم المسام 0.4 ميكرون) كبيرة بما يكفي لتغطية ثقب في الشبكة. وضع غشاء قطع في طبق مع شريحة مختارة.
4. وضع شريحة على الجزء العلوي من الغشاء ثم رفع بعناية الغشاء من المتوسط، مع شريحة بالارض في المركز.
5. وضع مرشح على الشبكة خلال ثقب دائري في الوسط، وإضافة ما يقرب من 1 مل من مستنبت إلى البئر، وتصل إلى مستوى الغشاء.
6. لإضافة التلاعب البروتينات أو مثبطات جزيء صغير إلى متوسط ​​(على سبيل المثال ^8).
7. تصوير شريحة لسجل من التشكل في اليوم 0 من الثقافة.
8. ضع الأطباق في جو مرطب من 5٪ CO _{2 عند 37 درجة مئوية في حاضنة.}
9. تصوير الثقافات على فترات منتظمة لفي المتوسط ​​7 أيام. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 48-72 ساعة. للتصوير الفوتوغرافي عرض شرائح مع مصدر الضوء من تحت (أرقام 2C-E).

5. النسب للبحث عن المفقودين

إذا كان مطلوبا تتبع النسب، والأصباغ محبة للدهون مثل الجاذبة أو ديو يمكن حقنها في جرثومة الأسنان قبل الخطوة 4، ثقافة شريحة.

1. سحب الإبر الزجاج الشعرية باستخدام مجتذب الإبرة.
2. كسر رأس الإبرة باستخدام ملقط ووضع تلميح إلى أسفل داخل محلول الصبغة. يترك لبضع دقائق في حين أن صبغ يملأ غيض من قبل عمل شعري.
3. وضع إبرة شغل في حامل ونعلق عبر أنابيب إلى حاقن أو الفم الشافطة.
4. ضع رأس الإبرة في مستنبت لمس منطقة شريحة المقرر أن المسمى. تطبيق ضغط الهواء لتهجير كمية صغيرة من الصبغة من إبرةد على الأنسجة.
5. إزالة الإبرة وتحقق لوصفها تحت مضان.
6. يمكن نقل شرائح وصفت بنجاح إلى الفلاتر ومثقف كما هو موضح في الخطوة 4.

من أجل متابعة حركة أول جريب الأسنان المولي، تم اتخاذ 250 ميكرون شرائح الجبهي من خلال الفك السفلي باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه. الجراب السنى هو طبقة من اللحمة المتوسطة الذي يحيط ظهارة المينا الخارجي (OEE) من الأسنان النامية، وسبق أن أظهرت أن يشارك في تشكيل أنسجة دواعم ^6. تم تشريح الفك السفلي في E14.5، المرحلة قبعة التنمية الأسنان. في شريحة كانت الخطوط العريضة للظهارة الأسنان واضحة، ويمكن التعرف على اللحمة المتوسطة الأسنان التكثيف باعتباره حلقة قتامة حول (4A الشكل) ظهارة الأسنان. تم حقن الجاذبة في اللحمة المتوسطة بجانب ظهارة المينا الخارجي للشريحة الأسنان على الجانب اللساني (الشكل 4A). بعد وصفها كانت شرائح تربيتها لمدة 4 أيام، وتصويرها على فترات (أرقام 4B و 4C). في الجسم الحي قد وصل إلى جراثيم الأسنانولوحظ المرحلة الجرس من قبل E18.5، وجرس متميزة مرحلة الشكل في شرائح، مما يشير إلى تطور مماثل خلال هذه الفترة الزمنية. كان ينظر إلى بقعة من الجاذبة لتمتد إلى نطاق من الخلايا يمتد حول ظهارة الأسنان الخارجي مع نمو الأسنان (أرقام 4B و 4C).

الشكل 1. تشكيل شرائح حية. (A) E14.5 الجنين. تشير الخطوط المتقطعة الطائرات قطع مع إبرة تشريح، بدءا من انخفاض قطع لقطع الرأس. (B) تشريح الفك السفلي. يواجه اللسان أسفل. يتم عرض الطائرة من الباب للالمروحية الأنسجة باستخدام الخطوط المتقطعة. (C) الأنسجة المروحية تظهر الذراع شفرة (BA) وقرص تركيب الأبيض (MD) مع عينة استعداد (السهم). (D) من خلال شريحة الممثل الموليالمنطقة. تشير السهام للجراثيم الأسنان المولي. (E) بترف قوة شريحة المولي. ويرد الظهارة الجرثومية الأسنان مع بقع سوداء. شحذ الصور باستخدام فوتوشوب. T = اللسان، DB = مضرس العظام والغضاريف = MC ميكل. شريط النطاق في A = 3 مم. شريط النطاق في B & D = 1 مم. شريط النطاق في E = 500 ميكرومتر. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. القاطعة والثقافة الغدة. (A) E12.5 الفك الأسفل الذي تم المفروم sagittally. وضع القواطع (بقع بيضاء المبينة مع أستريكس) والغدد تحت الفك السفلي (المبين مع البقع السوداء وarrowed) يمكن أن يتم للتو. (ب) نفس الفك السفلي تظهر المركزية 4 شرائح ينفصلا. ووضع تحت الفك السفلي الغدة جعلى أن ينظر إليه باعتباره برعم محاط اللحمة المتوسطة مكثف (النصال) في اثنين من أكثر المقاطع الجانبية (أعلى الصورة). ويرد على اللحمة المتوسطة تكاثف حول الغدة باللون الأحمر. القواطع هي في مرحلة الظهارية سماكة (أستريكس) في اثنين من شرائح المركزية (أسفل الصورة). (C) شريحة سهمي من خلال القاطعة في E14.0 في اليوم 0. (D) في وقت لاحق من نفس شريحة 1 يوم. (E) نفس شريحة بعد 3 أيام في الثقافة. (CE) نقاط السهم لالقاطعة وتشكيل حلقة عنق الرحم شفوي. رأس السهم يشير إلى الغدة تحت الفك السفلي النامية. في ثقافة الجرثومية الأسنان تمتد إلى الوراء كما تنمو الحلقات عنق الرحم، في حين لا تزال الغدة اللعابية للخضوع المتفرعة التشكل وتشكيل التجويف. شحذ الصور باستخدام فوتوشوب. T = اللسان، الغضروف = MC ميكل. شريط النطاق في A & B = 1 مم. شريط النطاق في C، D، E = 500 ميكرومتر. اضغط هنالعرض أكبر شخصية.

الرقم 3. طريقة الثقافة. (A) شريحة مثقف. ثقافة يجلس على فلتر شفاف معلق فوق المتوسطة عبر الشبكة المعدنية. ثقب في الشبكة يسمح للشريحة أن تصور مع ضوء من الأسفل. (B) تخطيطي لطريقة الثقافة.

الشكل 4. وضع العلامات الجاذبة للجريب الأسنان. (AC) مدموجة الضوء وحقل مظلم الصور تظهر النامية المولي الجرثومية الأسنان وموقع العلامة النسب الجاذبة. (A) يوم 0. جرثومة الأسنان (رأس السهم) هو في مرحلة الغطاء. الجاذبة تسميات خلايا بصيلات الأسنان على الجانب اللساني للسن. (B ) يوم 1. (C) يوم 4. وصلت جرثومة الأسنان مرحلة الجرس وينظر إلى الخلايا الجاذبة المسمى لنشر في قوس حول تطوير ظهارة المينا الخارجي. وقد شحذ الصور في فوتوشوب بعد دمج الطبقات باستخدام وضع الشاشة. أوجز ظهارة الأسنان مع بقع سوداء. DP = الحليمة السنية الواقعة داخل خلايا المينا الداخلية. DF = جريب الأسنان، والذي يدور حول ظهارة المينا الخارجي. MC = غضروف ميكل. شريط النطاق في A، B، C = 500 ميكرومتر. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

هذا الأسلوب من الثقافة الأسنان لديه ميزة أن الوصول إلى الجرثومية الأسنان ممتازة، مما يتيح تتبع النسب دقيقة والتنسيب من الخرز داخل ظهارة أو اللحمة المتوسطة. وبالتالي، يمكن تعريف المناطق من الأسنان النامية الجرثومية أن تستهدف على وجه التحديد. خلال الثقافة التشكل المتغيرة للجرثومة الأسنان يمكن اتباعها، وتأثير التلاعب المقررة بسرعة.

الأسلوب، ومع ذلك، لا يصلح إلا للشباب الجراثيم الأسنان قبل تشكيل كبير من الأنسجة الصلبة مثل عاج والمينا، كما لا يمكن المفروم هذه بدقة. لالفك السفلي بعد E15.5 فمن الضروري إزالة العظام قبل تقطيع. هذه لها مساوئ التي قد تسبب تلفا في الأسنان الجرثومية، الذي يرتبط بشكل وثيق مع العظم من E16.5. لدينا شرائح بنجاح الجراثيم الأسنان تشريح حتى اليوم ما بعد الولادة 4، وبعد ذلك يصبح من الصعب جدا بالنسبة الأسنان المروحية لخفض بسبب ترسب المينا. شريحة مethod يعمل بشكل جيد على الجراثيم الأسنان من E13.5، أي مرحلة برعم ^1،6. قبل هذا الوقت نقطة، عندما الأسنان في مرحلة الظهارية سماكة، والجراثيم الأسنان القيام تطوير ولكن يتم خفض معدل النجاح ويمكن أن تتأثر التشكل على المدى الطويل.

واحد العيب الرئيسي مع الأسلوب هو أن تقطيع يحدث عشوائيا من خلال الأسنان. في بعض شرائح سيتم العثور على جرثومة الأسنان كله ضمن شريحة، بينما في حالات أخرى المروحية قد خفض الجرثومية الأسنان عن طريق الوسط. وهذا يعني أنه قد يكون من الصعب الحصول على أعداد كبيرة من شرائح متطابقة. لمكافحة هذه المشكلة، فمن الممكن لتقسيم شريحة أسفل الوسط واستخدام الجانبين اليمين واليسار كما التجريبية والضابطة. لهذا، ومع ذلك، فإن الفك السفلي يجب أن توضع بعناية على القرص تقطيع لضمان قطع شريحة متناظر. بالنسبة لبعض التجارب هو ميزة لدينا شرائح أن تشريح الأسنان بحيث الهياكل الداخلية، مثل الميناعقدة، ويمكن الوصول لوضع العلامات النسب ^4. يظهر الجرثومية الأسنان قوية جدا ومثل هذه الجراثيم الأسنان نصف قادرون على تطوير جيدا في الثقافة، كما هو موضح سابقا في الجراثيم إلى النصف الأسنان المولي ^12،13.

كبديل لشريحة والثقافة، وجراثيم الأسنان يمكن تشريح للخروج من الفك السفلي والمثقف في عزلة ^14. هذا يزيل مشكلة سوء التغذية والأوكسجين المرتبطة زراعة كتل كبيرة من الأنسجة ويؤدي إلى نمو الأسنان جيدا ولكن نتيجة تطور الأسنان دون التفاعل مع الأنسجة المحيطة بها. عندما تتم إزالة كميات كبيرة من اللحمة المتوسطة المحيطة عدد من الجراثيم التي تشكل الأسنان يمكن تغييرها، وتسليط الضوء على أهمية اللحمة المتوسطة المحيطة من أجل التنمية الأسنان العادية ^15. لذا ثقافة شريحة هي طريقة جيدة لدراسة تفاعلات الأنسجة، على سبيل المثال كيفية تفاعل العظام والأسنان في تشكيل العظم السنخي، أو كيف ساليتختلف الغدد التفاعل مع ظهارة الفم واللسان و، وهو الأمر الذي يتم فقدان هذه الأنسجة عندما يتم تربيتها في عزلة.

يسلط الضوء على هذه الورقة استخدام هذه الطريقة لزراعة الأسنان ولكن الجراثيم نفس الأسلوب هو أيضا ممتازة لزراعة الغدد تحت الفك السفلي والنامية تحت اللسان وبعد تطوير البنية مثل غضروف ميكل (الشكل 2).

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

ويتم تمويل سارة A. Alfaqeeh حسب نوع سعود كلية طب الأسنان، وزارة التعليم العالي، المملكة العربية السعودية.