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Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen abzuschätzen In vivo Maus Lunge.
Die endotheliale Glykokalyx ist eine Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden des Gefäßlumens. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer erheblichen endothelialen Oberflächenschicht (ESL), die zur Aufrechterhaltung der endothelialen Funktion beiträgt. Als die endotheliale Glykokalyx ist oft aberrante in vitro und ist während der normalen Gewebe Fixationstechniken verloren, benötigt Studie der ESL Verwendung von Intravitalmikroskopie. Um die beste Annäherung an die komplexen Physiologie des alveolären Mikrovaskulatur wird pulmonalen intravital Bildgebung ideal auf einem frei beweglichen Lungenkrebs durchgeführt. Diese Zubereitungen jedoch typischerweise unter umfangreichen Bewegungsartefakt. Wir zeigen, wie mit geschlossenem Brustkorb Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge verwendet werden, um Glykocalix Integrität mittels ESL Ausschluss von fluoreszenzmarkierten hochmolekularen Dextrane aus der endothelialen Oberfläche zu messen. Diese Nichtwiedereinziehung chirurgische Technik, die benötigtgleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenz-Bildgebung der Maus Lunge, ermöglicht Längs Beobachtung des subpleural Mikrovaskulatur ohne Beweise zu induzieren confounding Lungenschädigung.
Die endotheliale Glykokalyx ist ein extrazelluläres Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden der vaskulären Intima. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer Oberflächenschicht wesentlichen endothelialen (ESL), die eine Vielzahl von Funktionen einschließlich Endothelzellen Fluiddurchlässigkeit 1, Neutrophilen-Endothel reguliert Haftung 2 und die Mechanotransduktion von Fluid Scherbeanspruchung 3.
Historisch gesehen hat die Glykokalyx war underappreciated aufgrund seiner aberrance in kultivierten Zellpräparationen 4, 5 und seine Abbauprodukte während der üblichen Gewebefixierung und Verarbeitung 6. Der zunehmende Einsatz 7 von Intravitalmikroskopie (in vivo Mikroskopie, IVM) hat mit erhöhter wissenschaftliche Interesse an der Bedeutung der ESL auf vaskuläre Funktion bei Gesundheit und Krankheit zusammenfiel. Die ESL ist unsichtbar für Lichtmikroskopie und kann nicht einfach in beschriftbarvivo, da die Neigung der fluoreszierenden Glykokalyx-bindenden Lektine RBC Agglutination 8 und tödlichen Lungenembolien (unveröffentlichte Beobachtungen) verursachen. Mehrere indirekte Ansätze wurden daher entwickelt, um ESL Dicke (und durch Erweiterung, Glykokalyx Integrität) in unbewegten Gefäßbetten wie die cremasterica und mesenterialen microcirculations abzuleiten. Diese Techniken umfassen die Messung der Differenzen der zirkulierenden Mikropartikel Geschwindigkeit als eine Funktion des Abstands von der endothelialen Membran (Mikropartikel Bild velocimetry 9) sowie die Messung der Ausschluss von sperrigen, fluoreszenzmarkierten vaskulären Markern (zB Dextrane) von der endothelialen Oberfläche (Dextran Exklusionstechnik 10, 11). Von diesen Techniken ist nur Dextran Ausschluss fähig Schätzen ESL Dicke aus Messungen an einem einzigen Zeitpunkt hergestellt. Durch die gleichzeitige Messung vaskulärer Breiten mit Hellfeldmikroskopie (a Breite inclusive der "unsichtbaren" ESL) und Fluoreszenz-Mikroskopie eines vaskulären Tracer vom ESL ausgeschlossen, kann ESL Dicke wie die Hälfte der Differenz zwischen vaskulären Breiten 2 berechnet werden.
Die Verwendung von einem momentanen Maß für ESL Dicke für Studium des pulmonalen Glykocalix gut geeignet. Intravitalmikroskopie der Lunge ist eine Herausforderung, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Während jüngsten Fortschritte zur Immobilisierung Mauslungen ermöglichen in vivo 12, 13, bestehen Bedenken hinsichtlich der physiologischen Auswirkungen von Lungen Stasis. Lung Immobilität wird mit einer verminderten endothelialen Stickstoffmonoxid Signalisierung 14, ein Signalweg, der sowohl Neutrophilen Adhäsion 15 und Lungenschädigung 16 Auswirkungen verbunden. Weiterhin Immobilisierung eines Bereichs von Lungen freilegt umgebenden mobilen Alveolen zu schädigenden Scherkräften (sogenannte "Atelektrauma"), in Übereinstimmung mit den Konzepten der klassischen physiologischenalveolären Interdependenz 17.
Im Jahre 2008 entwickelte Arata Tabuchi, Wolfgang Kübler und Kollegen eine chirurgische Technik die es erlaubt Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge 18. Respiratorischen Artefakt aus diesem Verfahren kann durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Abbildungssystem, einschließlich gleichzeitige Messung von Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie negiert werden. In diesem Bericht ausführlich wir, wie momentane Dextran Ausschluss Bildgebung eingesetzt werden, um ESL Dicke im subpleural Mikrozirkulation einer frei beweglichen, in vivo Mauslunge messen. Diese Technik kann leicht modifiziert werden, um zu bestimmen Glykokalyx-Funktion Insbesondere die Fähigkeit eines intakten ESL auszuschließen zirkulierenden Elemente aus der endothelialen Oberfläche. Wir haben kürzlich diese Techniken verwendet werden, um die Bedeutung der pulmonalen ESL Integrität zur Entwicklung von akutem Lungenversagen während systemische entzündliche Erkrankungen wie Sepsis 2 zu bestimmen.
Ein. Vorbereitung der Surgical Tubing, Gefäßkathetern, Brust Wand Fenster
2. Maus Anesthesia
3. Tracheostomie
4. Katheterisierung
5. Intravital Maus Lung Microscopy Surgery (adaptiert aus Tabuchi et al. 18)
6. Die Messung der Lungenfunktion Endothelial Oberflächenschichtdicke
7. Alternative Messung der Lungenfunktion Endothelial Surface Layer Integrität
Die intakten Endothelzellen Oberflächenschicht Funktionen (teilweise) auszuschließen circulatten Elemente aus der endothelialen Oberfläche 2. ESL Integrität kann daher durch die Fähigkeit einer Umlaufelement (zB eine fluoreszierende Mikrokugel) für den Zugriff und die Interaktion mit Zelloberflächen-Adhäsionsmolekülen (wie ICAM-1) gemessen werden.
8. Sterbehilfe
Nach Abschluss des Verfahrens werden narkotisierten Mäusen durch Ausbluten über direkte Herzpunktion eingeschläfert. Sterbehilfe wird über bilaterale Pneumothoraces, nach denen Lungen geerntet und schockgefroren zur späteren Analyse bestätigt.
Der experimentelle Ansatz in den Schritten 1-6 beschrieben ermöglichen Erfassung von mehreren Frames gleichzeitiger DIC (Hellfeld) und fluoreszierende Bilder. Um ESL Dicke zu bestimmen, werden aufgenommene Bilder mit einer Blindbeobachter nach Beendigung des experimentellen Protokolls bewertet. Mit Hilfe eines in-Fokussierrahmen subpleural Mikrogefäßen (<20 Mikrometer Durchmesser) identifiziert; mindestens 3 Mikrogefäßen sind in der Regel auf einem einzigen Rahmen (Abbildung 10). Mit Bildanalyse-Software (NIS Elements, Nikon), sind vaskuläre Breiten gemessen (durch einen verblindeten Beobachter) durch Mittelung der Längen der drei senkrechten Abschnitte pro microvessel. Da die ESL unsichtbar ist DIC Bildgebung, überspannen DIC vaskulären endothelialen Breiten Membran Endothelmembran und sind daher einschliesslich ESL Dicke 9, 10. Im Gegensatz dazu wird FITC-Dextran (150 kDa) von der ESL ausgeschlossen. Folglich sind FITC vaskulären Breiten nicht übernehmen ESL Dicke. Annahme gleicher ESL dickeness an beiden Rändern des Schiffes kann die ESL Größe daher um die Hälfte der Differenz zwischen DIC und FITC-Dextran vaskulären Breiten festgelegt werden.
Mehrere potenzielle technische Fallstricke kann mit der Interpretation von experimentellen Ergebnissen stören. Die Anwesenheit von Blutungen in der Mikroskopie Feld verschleiern sowohl DIC und FITC Visualisierung des subpleuralen Mikrovaskulatur, daher darauf zu Hämostase (unter Verwendung Elektrokauter) während Fensteranordnung (5,9) erhalten. Darüber hinaus könnte die Lunge nicht reapproximate die thorakale Fenster nach der Rekrutierungsmanöver (5,14); zeigt dies für gewöhnlich unvollständige umlaufende Haftung der Membran um die Thorax-Fenster. Dies kann üblicherweise durch erneute Anwendung von Kleber um den Thorax Fenster korrigiert werden, gefolgt von einer Wiederholung Lungenrekrutierung manövrieren. Schließlich muß darauf geachtet werden, um ein versehentliches intravenöse Injektion von Luft in die Maus zu vermeiden. Luftembolie, wenn auch nicht tödlich, wird preferenti Verbündeter Reise in die nondependent Lunge, verhindert FITC-Dextran Perfusion des visualisiert (nondependent) subpleural Mikrovaskulatur.
Messung der ESL Breiten erfordert die Verwendung eines Bildes Splitter (BIETEN gleichzeitige DIC und Fluoreszenz-Imaging) sowie spezielle Mikroskopie Ziele. Diese Geräte Anforderungen können mit einigen Modifikationen an unserem Protokoll vermieden werden. Glycocalyx Integrität kann indirekt durch die Bestimmung ESL Ausschluss des zirkulierenden Mikrosphären aus dem Behälter Oberfläche gemessen werden. Die Anwesenheit von ESL Abbau, daher wird durch eine erhöhte mikrovaskuläre subpleuralen Abscheidung von Mikrokügelchen gegen Endotheloberfläche Adhäsionsmoleküle (wie ICAM-1) (Abbildung 11) ausgerichtet angedeutet.
Abbildung 1.
Abbildung 3.
Abbildung 4.
Abbildung 5.
Abbildung 6.
Abbildung 7.
Abbildung 9.
Abbildung 10. Messung der Maus pulmonalen ESL Dicke. (A) Repräsentative DIC und fluoreszierenden Bildern der Maus subpleuralen Mikrovaskulatur (Maßstab, 50 um) gleichzeitiges-eingefangen. Mikrogefäßzellen Breite wird gemessen mit dem Mittelwert von drei senkrechten linearen abfängt. ESL Dicke kann durch eine Hälfte der Differenz zwischen DIC (inklusive der ESL) und fluoreszierende (exklusive der ESL) bestimmt werdenMikrogefäßzellen Breiten. (b) DIC Messungen genau zu identifizieren subpleuralen Gefäßwand Grenzen, um nahezu identische DIC und GFP Gefäß Breitenmaße in endothelialen fluoreszierenden Tie2-GFP-Mäuse (Jackson Labs) durchgeführt demonstriert. Durchgezogene Linie stellt die Linie der Identität. (C) Die subpleuralen Mikrovaskulatur Längsrichtung verfolgt werden kann, wie durch den fortschreitenden Verlust der ESL Dicke vorkommenden nach intravenöser Lipopolysaccharid (LPS). N = 3 Mäusen nachgewiesen. * P <0,05 im Vergleich zur Zeit = 0 min von ANOVA.
Film 1. Glykokalyx Integrität kann durch die Bewertung für anti-ICAM-1 Mikrokugel Adhärenz im subpleuralen Mikrovaskulatur bestimmt werden. Hochgeschwindigkeits-Konfokalmikroskopie (Nikon A1R) zeigt adhärente fluoreszierenden Mikrokugeln 45 min nach intravenöser LPS (20 mg pro kg Körpergewicht). Beachten Sie, dass zirkulierende Mikrosphären können AnlassMotiv seiny gesehen durch die Mikrozirkulation. Um Visualisierung (grün fluoreszierend) Mikrosphären Lokalisierung zu verbessern, Schritt 6,1 Mäuse wurden mit dem vaskulären Tracer TRITC-Dextran (150 kDa, 6%) anstelle von FITC-Dextran vorbehandelt. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Koinzident mit dem expandierenden Verwendung von in vivo-Mikroskopie, gibt es zunehmende Wertschätzung sowohl für die beträchtliche Größe der ESL sowie dessen zahlreichen Beiträge Gefäßfunktion. Diese neuen Daten werden jedoch vor allem aus Studien der systemische Gefäßsystem abgeleitet. In der Tat, der in vivo-Mikroskopie in der Lunge zu verwenden ist technisch anspruchsvoll, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte.
Mehrere neuere technische Fortschritte haben zur Stabilisierung der beweglichen Mauslunge erlaubt, wird eine bessere Anwendung der intravital Techniken, um die pulmonale Mikrozirkulation 12, 13. Diese Ansätze sind jedoch möglicherweise durch die physiologischen Auswirkungen von Lungen Unbeweglichkeit verwechselt. Da die Lunge ist teleologisch ein Organ für stetige Bewegung bestimmt wird Lungenkrebs Stasis intuitiv verändern pulmonalen Physiologie. Tatsächlich ist Lungenkrebs Stasis mit Veränderungen in Endothelzellen n assoziiertitric Oxid-Signalisierung, eine Bahn mit einer Vielzahl von stromabwärtigen Auswirkungen sowohl auf dem gesunden Lunge und verletzten 14, 16. Darüber hinaus induzieren Immobilisierung von einem Bereich der Lunge Themen rund Alveolen schädlichen Scherkräfte, im Einklang mit dem "Atelektrauma" Merkmal der Ventilator Lungenschädigung 19. Diese und andere noch zu--identifiziert werden Folgen von Lungenkrebs Stasis sind wahrscheinlich zu verwechseln Interpretation intravital Beobachtungen der pulmonalen mikrovaskulären (Patho-) Physiologie.
Angesichts dieser Bedenken haben wir versucht, eine Methode, mit der pulmonalen ESL in einem frei beweglichen, in vivo Mauslunge untersucht werden könnten. Wir entschieden uns für die Technik der Tabuchi und Kuebler, ein Ansatz, der Längs-Visualisierung von einem frei beweglichen Mauslunge ermöglicht, ohne Anstiftung Lungenverletzung 18 anzupassen. Wichtig ist, enthält unser Ansatz einige subtile Veränderungen von Original-Protokoll Tabuchi die, diese alteragen aus der Notwendigkeit entwickelt, um einzigartige Bedingungen in unserem Labor unterzubringen. Ebenso Annahme unseres Modells der ESL Messung anderswo erfordern ähnliche Optimierung, um die Stabilität der Maus Hämodynamik, Oxygenierung, Beatmung, und das Fehlen der Lungenschädigung zu gewährleisten.
Wir entschieden uns für Dextran Ausgrenzung als unsere primäre Ansatz zur ESL Messung zu verwenden. Diese Technik ist für unser Modell gut geeignet, da ESL Messungen aus einem einzigen Moment in der Zeit gemacht werden können, negiert pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Während frühere Studien des systemischen Mikrozirkulation angeregt haben, dass Dextran Ausschluss nur genau in kleinen Gefäßen (<15 um 6) ist, haben wir übereinstimmende ESL Veränderungen in Gefäßen festgestellt bis zu 30 &mgr; m Durchmesser. Diese Diskrepanzen können durch optische Eigenheiten der Pleuraoberfläche.
In einer bewegenden Gefäßbett, ist es wichtig, dass Hellfeld und Fluoreszenz-Bildgebung occurs gleichzeitig, wie auch eine kurze Verzögerung bei der Bildaufnahme (zB Shutter Verschluss zwischen aufeinanderfolgenden Bildern) wäre tödlich verwechseln Messungen der ESL Dicke. Während der Pause Belüftung verringern kann diese Störfaktoren, wird eine inspiratorische Pause nicht vollständig verhindern Herzbewegung Artefakt oder respiratorischen Artefakt aus Gas Umverteilung heterogen aufgeblasen, verletzte Lunge ("pendelluft") 20. Wir entschieden uns, ein Bild Splitter verwenden, um gleichzeitig zu senden Hellfeld und Fluoreszenz-Bilder zu einem einzigen CCD-Kamera. Alternative Ansätze könnten zählen die Verwendung von dichroitischen Spiegeln, gleichzeitig reflektiertes Licht zu erfassen und fluoreszierenden Bildern während Konfokalmikroskopie.
Ein weiterer wesentlicher Anspruch unserer Modell ist die Verwendung von spezialisierten wasserlöslichen Immersionsobjektiven. Diese Ziele müssen einen ausreichend großen numerischen Apertur zu ermöglichen Auflösung von kleinen Unterschieden in Behälter Breiten während noch maintaining eine angemessene Arbeitsbedingungen Abstand sowohl die thorakale Fenster und Pleuraoberfläche eindringen. Diese Ziele, während Verfügung stehen, sind sehr teuer. Die Verwendung von reflektiertem Licht Differential-Interferenz-Kontrast (DIC)-Mikroskopie ist eine Hellfeld Technik, ungefärbten Geweberänder unterstreicht zusätzlich wünschenswert, wie DIC verbessert Präzision von Gefäß Breite Messungen.
Alternative Techniken existieren für die Bestimmung von pulmonaler ESL Breite. Während Mikrosphären Velocimetry kann nicht genau auf einem sich bewegenden Gefäßbett durchgeführt werden, können Mikrosphären Haftung eingesetzt, um indirekt testen pulmonalen Glykokalyx Integrität werden. Wir haben zuvor gezeigt, dass die intakten ESL Funktionen auszuschließen zirkulierenden Mikrokugeln aus Endotheloberfläche Adhäsionsmoleküle 2. Das Vorhandensein von Anti-ICAM-1 Mikrokugel Haftung an der endothelialen Oberfläche zeigt daher einen Verlust von Glykocalix / ESL Integrität. Diese Technik erfordert keine gleichzeitige brightfield / Fluoreszenz-Bildgebung, noch sind hohe numerische Apertur Ziele notwendig. Jedoch eine wichtige Einschränkung existiert: für eine erhöhte Anti-ICAM-1 Mikrokugel Haftung an Glykocalix Verlust anzeigen, müssen es ähnliche ICAM-1 Zelloberflächenexpression zwischen Kontroll und experimentellen Gruppen sein. Während ICAM-1 Endotheloberfläche Ausdruck stabil geblieben früh (<45 min) in Sepsis-induzierten Lungenschädigung 2 wird Oberflächenexpression schließlich in einer NF-kappaB abhängigen Weise 21 zu erhöhen. Verwendung Mikrokugel Adhäsion als Marker der Glykocalix Integrität, also nur in der frühen Entzündung gültig.
Zu beachten ist, während unsere chirurgische und Mikroskopie-Techniken nicht zu induzieren Lungenschädigung 2, ist es ungewiss, wie sich entwickelnden experimentellen Lungenversagen (zB Verletzung durch intratracheale Säure Instillation induziert) beeinflusst Messungen der ESL Dicke. Evolving Lungenödem könnte verwirren DIC Messungen des Schiffes Breiteund / oder Einfluss Dextran Durchlässigkeit. Diese Unsicherheit kann durch die Verwendung von mehreren komplementären Techniken (zB Dextran Ausgrenzung Mikrokugel Adhäsion, sowie bestätigende histologische Beurteilung der Behälter Glycosaminoglycan content 2) zu beobachteten Änderungen in der pulmonalen ESL bestätigen gemildert werden.
Zusammenfassend durch Expandieren des chirurgischen Ansatz zunächst durch Tabuchi und Kuebler gemeldet haben wir ein experimentelles Modell, das für die genaue Beobachtung des pulmonalen ESL ermöglicht entwickelt. Die Verwendung dieses Modells sollte zu einem besseren Verständnis der Bedeutung der endothelialen Glykokalyx der pulmonalen vaskulären Physiologie in Gesundheit und Krankheit zu ermöglichen.
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Wir danken Drs. Arata Tabuchi und Wolfgang Kübler (University of Toronto) für den Unterricht über Intravitalmikroskopie. Wir danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) für die Unterstützung in der Mikroskopie Design und Implementierung. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschüsse P30 HL101295 und K08 HL105538 (auf EPS) finanziert.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenz | |||
FITC-Dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
TRITC-Dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
Streptavidin-beschichtete fluoreszierenden Mikrosphären | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green Fluoreszenz (ähnlich FITC) |
Ketamin | Moore Medical | ||
Xylazin | Moore Medical | ||
Anti-ICAM-1-Antikörper biotinylierter | eBioscience | Klonen YN1/1.7.4 | 1:50 Verdünnung |
Isotyp biotinylierten Antikörper | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 Verdünnung |
EQUIPMENT | |||
Beatmungsgerät | Harvard Apparatus | Inspira | |
Tracheostomie Katheters | Harvard Apparatus | 730028 | |
Elektrokauter Gerät | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
Bipolar Kauter Pinzette | Olsen Medical | 10-1200i | 9.9cm McPherson |
Temperatur control-System | World Precision Instruments | ATC1000 | |
Spritzenpumpe | Harvard Apparatus | Pumpe 11 Elite | |
Microscope (Weitfeld) | Nikon | LV-150 | |
Microscope (konfokalen) | Nikon | A1R | |
Bild Splitter | Photometrics | DV2 | |
CCD-Kamera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
Bildverarbeitungs-Software | Nikon | NIS Elements | |
Polyvinylidenfluorid-Membran | Kure Wrap | ||
Circular Deckglas | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, Nr. 1 Dicke |
Glue (Deckglas zur Membran) | Pattex | Flüssig (liquid) | Zum Aufkleben Deckglas zur Membran |
Glue (Deckglas zur Maus) | Pattex | Gel | Membran zum Anbringen an Maus |
Chirurgische Schläuche | Intramedic | PE50, PE10 | |
Naht | Fischer | 04.00 Seide | |
Trockenrasierer | Oster | 78997 | |
Chirurgische Zange gekrümmten | Roboz | ||
Gerade chirurgische Pinzette | Roboz | ||
Chirurgische Schere | Roboz | ||
Chirurgische Mikroschere | Roboz | ||
Chirurgische Nadeltreiber | Roboz | ||
Surgical tape | Fischer | ||
Kitchen sponges (Schnitt in Keile) | verschiedene |
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