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Ein In vivo Tiermodell der Verletzung ist beschrieben. Die Methode nutzt die subkutane Lage des N. peronaeus. Velocity, Zeitpunkt der Muskelaktivität und Bogen der Bewegung sind alle vorher festgelegten und synchronisiert mit kommerzieller Software. Beitrag Verletzungen Änderungen werden überwacht In vivo Mit der MR-Bildgebung / Spektroskopie.
Muskelzerrungen sind eine der häufigsten Beschwerden von Ärzten behandelt. Eine Muskelverletzung in der Regel aus der Anamnese und körperliche Untersuchung allein diagnostiziert, aber die klinische Präsentation kann variieren stark je nach dem Ausmaß der Verletzung, die Schmerzen des Patienten Toleranz, etc. Bei Patienten mit Muskel-Verletzungen oder Muskelerkrankungen, die Beurteilung der Schädigung der Muskulatur ist in der Regel um die klinischen Symptome, wie Zärtlichkeit, Kraft, Beweglichkeit, und in jüngerer Zeit, bildgebende Verfahren beschränkt. Biologische Marker, wie zB Serum-Kreatin-Kinase-Ebenen werden in der Regel mit Muskelverletzungen erhöht, aber ihre Werte nicht immer mit dem Verlust von Kraft Produktion korrelieren. Dies gilt auch für histologische Befunde von Tieren, die eine "direkte Maßnahme" des Schadens, aber nicht für alle der Verlust der Funktion Konto. Manche haben argumentiert, dass das umfassendste Maß für die allgemeine Gesundheit des Muskels in kontraktilen Kraft. Da Muskelverletzung ist ein zufälliges Ereignis, dass unter einer Vielzahl von biomechanischen Bedingungen auftritt, ist es schwer zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine In-vivo-Tiermodell, um das Drehmoment zu messen und eine zuverlässige Muskelverletzung zu produzieren. Wir beschreiben auch unser Modell zur Messung der Kraft von einem isolierten Muskel in situ. Außerdem beschreiben wir unseren Kleintiere MRT-Verfahren.
1. In-vivo-Modell Verletzungen und die Messung der isometrischen Drehmoment.
2. In situ-Messung der gesamten Muskelspannung.
3. In vivo MR-Bildgebung und / oder-Spektroskopie von Nagetier Skelettmuskeln.
Alle MRI und MRS befindet sich auf einem Bruker Biospin (Billerica, MA) 7,0 Tesla MR-System mit einem 12 cm Steigung einfügen (660 mT / m maximale Steigung, 4570 T / m / s maximale Anstiegsgeschwindigkeit) läuft Paravision 5.0 Software ausgestattet ist.
4. Ernte und Lagerung Muskeln.
Reisebüros sind nach Ende der Experimente geerntet, gewogen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend bei -80 ° C gelagert Dies kann zu jedem Zeitpunkt nach der in-vivo-Experimente durchgeführt werden. Muskeln sind unmittelbar nach der in-situ-Experimente geerntet, da dies ein Terminal Verfahren ist. Für detaillierte morphologische Studien, wird das Tier mit 4% Paraformaldehyd über Perfusion durch die linke Herzkammer behoben.
5. Repräsentative Ergebnisse.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Daten von einer Ratte in der in vivo Apparat Die in vivo Apparat benutzt wird, um maximale Drehmoment von der Dorsalextensoren generiert erhalten;. Es wird auch benutzt, um eine Verletzung dieser selben Muskeln hervorzurufen. Aufgrund der Länge und Spannung Verhältnis von Muskel-, maximalen isometrischen Drehmoments der Regel tritt ein, wenn das Sprunggelenk bei ca. 20 ° Plantarflexion (mit dem Fuß senkrecht positioniert, um die Tibia als 0 °) positioniert ist. Nach maximale isometrische Drehmoment erhalten wird, kann der Fuß dann in jeder beliebigen Position auf der Verletzung Protokoll beginnen platziert werden. Abbildung 3 stellt eine Verletzung des Protokolls 30 Wiederholungen mit einem Bogen der Bewegung von 0 ° - 70 °. Notieren Sie sich die stetige Abnahme des Drehmoments aus der isometrischen Phase (gefüllte Pfeil) und die Verlängerung Phase (offener Pfeil) während der Kontraktion-induzierten Verletzungen Protokoll generiert. Das Drehmoment wird in Einheiten von Nmm aufgenommen, aber der absolute Wert hängt von der Größe des Tieres und dessen Zustand (zB verletzten Muskels, müde Muskeln oder Muskel fehlt ein bestimmtes Protein durch homologe Rekombination).
Abbildung 4 zeigt repräsentative Daten von einer Ratte in der in situ Apparat. Unsere in situ Apparat nicht um Verlängerung Kontraktionen, sondern erlaubt es uns, zu isolieren, richtig auszurichten und zu messen maximale Spannung von einem einzelnen Muskel an einer bekannten Länge produziert. Abbildung 4 zeigt die allmähliche Verlust der Kraft, die beim Dauertest in einem tibialis anterior der Ratte auftritt. In diesem Beispiel wurden titanic Kontraktionen einmal pro Sekunde für 5 Minuten durchgeführt. Tension (Kraft) ist in der Regel in Newton (oder Gramm) aufgezeichnet, aber wie Drehmoment, hängt der Betrag von der Größe und dem Zustand des Tieres. Da Muskelmasse sofort nach diesem Verfahren erhalten wird, kann die Kraft normiert (so genannte "spezifische Kraft"), um Muskeln Querschnittsbereich werden.
Abbildung 5 zeigt repräsentative Daten aus in vivo-Bildgebung von einer Maus, wie T1-gewichteten und T2 Parametric Mapping (A), 3D-Traktographien von Diffusions-Tensor-Bildgebung (B), 1 H-Spektroskopie (C) und 31 P-Spektroskopie. Einzelheiten sind in der Legende zur Verfügung gestellt.
Abbildung 1: In-vivo-Apparat .* Um die Verletzungsgefahr zu produzieren, die Tibia stabilisiert und den Fuß auf einem motorbetriebenen Platte befestigt. Der Knöchel Dorsalflexoren werden über den N. peronaeus stimuliert, während die Fußplatte zwingt den Fuß in Plantarflexion (gepunkteter Pfeil).
* Lovering & De Deyne, J Biomechanik 2005, mit freundlicher Genehmigung verwendet.
Abbildung 2: In situ Apparat Die Wägezelle ist mit einem Mikromanipulator montiert, so dass die TA zu Ruhelänge angepasst werden kann und richtig in die X, Y, und Z-Richtung ausgerichtet. Die distale Sehne des TA ist es, die Wägezelle befestigt und einzelne Zuckungen an verschiedenen Muskeln Längen induziert, um L 0 zu bestimmen. Eine maximale tetanische Kontraktion erhalten wird, um maximalen kontraktilen Aktivierung (P 0) zu bestimmen. Maximale tetanische Spannung kann mehrfach durchgeführt werden und als Prozentsatz der P 0 ausgedrückt, einen Index von Müdigkeit zu einem gewünschten Zeitpunkt.
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Abbildung 3: Drehmoment-Daten aus in vivo Apparat Vertreter Spur-Aufnahmen von Drehmoment von Verlängerung Kontraktionen in der Ratte. In diesem Beispiel wurden die Muskeln für 200 Millisekunden angeregt, einen Höhepunkt isometrische Kontraktion (gefüllte Pfeil) vor Verlängerung (offener Pfeil) von der Fußplatte durch eine 70 °-Bogen der Bewegung mit einer Winkelgeschwindigkeit von 900 induzieren ° / s.
Abbildung 4: Tension Daten aus in situ Apparat Repräsentative Daten zeigen den Rückgang der maximalen isometrischen tetanischen Spannung bei wiederholter Stimulation des M. tibialis anterior (TA) in eine Ratte. In diesem Beispiel wurde die TA isoliert, angepasst, um optimale Länge (L 0), und dann mit einem 200 ms tetanische Kontraktion einmal pro Sekunde für 5 Minuten stimuliert.
Abbildung 5: In-vivo-Bildgebung A: Die Bilder zeigen quer (axial) Teile der T1-gewichteten und T2 parametrische Mapping aus dem M. tibialis anterior (TA). Die gestrichelte rote Feld umgibt die TA zu zeigen erhöhte erhöhte T2 in den verletzten (links) versus unverletzt (rechte Seite) B:.. Vertreter 3D-Traktographien von Diffusion Tensor Imaging (DTI) C: Die 1 H-Spektrum einer Maus TA zeigt mehrere nachweisbar Lipid Resonanzen; Differenzierung zwischen intramyozellulären (IMCL) und extramyocellular Lipid (EMCL) Peaks erhält man mit dieser Methode D: Die 31 P NMR-Spektrum der Ratte TA zeigt Phosphokreatin (PCr), anorganischem Phosphat (Pi), und die drei. Resonanzen (α, β, γ) von Adenosin-5'-Triphosphat (ATP).
"Muscle Schaden" wurde definiert und gemessen in vielerlei Hinsicht. Bauschäden ist in histologischen Befunden 6,9 evident, aber ein Problem mit vielen der biologischen Marker verwendet werden, um Muskelverletzungen, einschließlich derjenigen in tierexperimentellen Studien verwendet zu bewerten, ist, dass sie in der Regel nicht mit dem Verlust der Kraft korrelieren. Muscle Schaden ist oft im Rahmen des Tests verwendet werden, um es zu untersuchen definiert und niemand finden kann, damit die Änderungen in Kontraktilität nach der Verletzung Konto. Da die volle kontraktile Funktion trotz der Anwesenheit von Verletzungen Marker bestehen kann, kann zum Verlust der Kraft der gültiges Maß von Verletzungen 3, und der wohl relevant.
Es ist schwierig, Muskelverletzungen in Menschen zu untersuchen, wie die Inzidenz ist ein zufälliges Ereignis, die schwierig vorherzusagen ist, und das klinische Erscheinungsbild variiert stark. Deshalb sind viele der Daten in Bezug auf Muskel-Verletzungen festgestellt worden sind aus Untersuchungen an Tieren, die Kontrolle über viele Variablen und die Fähigkeit, Mechanismen der Schädigung und Erholung Studie liefert. Die in vivo Verletzungen Apparat wir beschrieben haben, stellt eine Methode zur Beurteilung der kontraktilen Funktion ohne Zerlegung der Muskulatur und damit ohne die Notwendigkeit, das Tier zu untersuchenden einschläfern. Unsere maßgeschneiderten Verletzungen Modell (patent pending) ist auf den gleichen Prinzipien von anderen verwendet werden, um Kontraktion-induzierten Verletzungen bei Tieren 5,12,15,24 etablieren basiert. Trotz der Verfügbarkeit von Modellen auf dem Markt, gibt es wenig Belehrung über Nutzung der Hardware. Unser Modell hat die Spezifikationen in Bezug auf das verfügbare Angebot an Bewegungs-und Winkelgeschwindigkeit, die vorteilhaft 17 sind, aber unser Hauptziel ist es, die Methoden zu teilen; haben wir versucht, Verfahren von Anfang beschreiben, die zur Herstellung einer Verletzung beenden. Die Vorteile der in-vivo-Modell, dass der Muskel, Anatomie und Biomechanik nicht verändert werden und dass das Verfahren nicht Terminal. Wir verwenden die gleiche Lage in der Tibia für alle Drehmoment-Messungen folgende sanitäre Verfahren und mit einer sterilen Nadel für jede Messung. Das Bein kann ohne die Verwendung eines transosseus Pin stabilisiert werden, aber wir haben den Stift festgestellt, dass in Bezug auf Zuverlässigkeit und die Beseitigung der fremden Bewegung während der Verlängerung Kontraktionen überlegen.
Die Vorrichtung zur In-vivo-Drehmoment-Messungen verwendet hat mehrere zusätzliche Vorteile. Es beinhaltet keine Zerlegung, so ist es nicht erforderlich, um das Tier zu untersuchenden einschläfern. Das Ergebnis ist, dass man Kontraktilität im gleichen Tier im Laufe der Zeit zu messen, und / oder mit in-vivo-Bildgebung wie MRT. Weitere Vorteile sind, dass normale Anatomie nicht verändert wird, ist der Nerv nicht zur Stimulation umgangen (wie in vitro Zubereitungen), und der Muskel bleibt in seiner gewohnten Umgebung, so dass die Wirkungen der Entzündung, Hormonen oder anderen Faktoren untersucht werden können. Weil es die Verwendung von weniger Tieren, deren Muskeln sind weniger Manipulationen (zB Dissektion vor dem Test der Funktion) unterzogen verlangt, bevorzugen wir, um das Drehmoment-Messungen verwenden, wenn möglich. Der Hebelarm der Maus TA ist 4 bekannt und der Muskel kann gewogen, wenn das Tier getötet werden. Es gibt einige Einschränkungen jedoch im Vergleich zum Isolieren des Muskels. Zum Beispiel ist es schwierig, die genaue Länge Veränderungen, die während der Verlängerung Kontraktionen auftreten erkennen, und die Muskelmasse lässt sich nicht messen, bis sie geerntet werden (obwohl es kann abgeschätzt werden auf Lautstärke über MRI gemessenen) 8.
Um zu bestimmen, die "spezifische Kraft" (Kraft pro Querschnittsfläche) eines einzelnen Muskels, Bedürfnisse, die Muskeln zu isolieren und richtig positioniert werden, dies vermeidet auch die Kraftübertragung von den nahe gelegenen Muskeln 10. Die in situ Apparat wurde für diesen Zweck konzipiert. Es bietet eine Alternative zur Messung der Kontraktilität der nur ein Muskel mit einer bekannten Länge und Masse. Doch auch diese Methode hat ihre Grenzen. Obwohl die in situ Gerät bietet mehr experimentelle Kontrolle bei der Messung der Kraft eines einzelnen Muskels ist der trade-off, dass das Experiment unter physiologischen wird. In situ Kraft Messungen erfordern eine chirurgische Freigabe der TA Muskel, der die Anatomie verändern kann und beeinträchtigen Kraftübertragung. Das Experiment ist auch Terminal, so dass der Muskel nicht über längere Zeit beobachtet werden.
Diffusion Tensor Imaging (DTI) ist potentiell ein noch empfindlicher und früher Marker für Muskelschäden als Standard-T2-gewichteten MRT. Die Variablen mit DTI erhalten, zumindest in anderen Geweben wie dem Gehirn (1), zeigen eine starke und schnelle Reaktion auf Schäden, während die T2-Signal über einen längeren Zeitraum zu ändern nehmen kann. DTI beruht auf der Messung der scheinbaren Diffusion von Wasser im Gewebe basiert. Die DTI-Technik hat den tatsächlichen Längsschnitt verglichens der Ratte TA und es hat sich gezeigt, dass DTI Richtungen tatsächlich repräsentieren lokale Muskelfaser Richtungen in der Ratte TA Muskel 19.
MRS liefert Informationen über die chemische Zusammensetzung des Muskels nicht-invasiv 12. Je nach den beobachteten Kern ermöglicht MRS Beobachtung von hochenergetischen Phosphate (31 P MRS) oder Lipide (1 H MRS). 31 P MRS ist ein ideales Werkzeug für die Untersuchung von Muskel-Stoffwechsel, weil sie nicht-invasiv ist und sich leicht angewendet, um in-vivo-Studien der Skelettmuskulatur. Alternative Ansätze für die biochemische Assays von in situ Muskel Metaboliten, wie zum Beispiel Nadelbiopsie, geben können signifikante Überbewertung von Pi und scheinbare Reduktion der PCR 1. Ein Tier-Modell bietet den offensichtlichen Vorteil der Verwendung einer kontrollierten Verletzungen und zum Vergleich in vivo MRS Änderungen Erkenntnisse in der Biochemie, Morphologie und Funktion der Gewebe. Änderungen in der Hochenergie-Phosphat-Stoffwechsel bei Erkrankungen, die zu Muskel-Degeneration 2,20 gestoßen. Intrazelluläre pH-Wert, sowie die MR-Signal Intensitätsverhältnisse Pi / PCr (anorganisches Phosphat [Pi], um Phosphokreatin [PCr]) und PDE / PCr (Phosphodiester [PDE], um PCR), liefern kann wertvolle Informationen über die Bühne und die Schwere der Muskelabbau.
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Robert Bloch für seine großzügige Spende an Laborfläche und Einrichtungen und Dr. Rao Gullapalli und Da Shi danken in die Core for Translational Imaging bei Maryland (C-TRIM) und der Magnet-Resonanz-Forschungszentrum (MRRC) für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt, um von den National Institutes of Health (K01AR053235 und 1R01AR059179) und von der Gesellschaft für Muskeldystrophie (# 4278), und durch einen Zuschuss RML aus der Jain Foundation JAR.
(Alle Geräte sind die gleichen für Mäuse und Ratten mit Ausnahme der Fußplatte)
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