使用多柱板适配器的经济性和多功能性高通量蛋白质净化系统

使用多柱板适配器的经济性和多功能性高通量蛋白质纯化系统。嗨，蛋白质纯化是研究蛋白质结构和功能的必要条件。它通常与生物物理技术相结合使用。

这在需要高通量蛋白质生产的功能蛋白质组学时代尤为重要。我们假设多柱板适配器 MCPA 可以将不同脂质的多个色谱柱与多井板对接，进行平行纯化。有了这个适配器，我们开发了一种经济实用的蛋白质纯化方法，可以在重力或真空条件下以自动化系统的速度使用。

在这里，我们展示这种方法的镍亲和力色谱和离子交换色谱。将穿刺的密封垫放在长滴盘上，然后将所需的柱数插入密封垫的孔中，从而组装 MCPA。将打开的收集板放在歧管底部，并与歧管顶部关闭。

连接管子，并将组装的 MCPA 与柱子放在顶部。将 1.2 万的镍-NTA 溶液放入柱中。在管道输送时，确保珠子保持完全混合。

打开泵，将 20% 乙醇通过柱子运行，并进入下面的收集板。液体通过后关闭泵。将收集板的内容放入废品箱中。

在所有列中添加三个 EDTA 缓冲器的树脂卷。打开泵并运行液体通过。现在用三个树脂卷0.5摩尔氢氧化钠缓冲器清洗柱子。

用四个树脂卷100毫升硫酸镍清洗柱子，然后用10个树脂量的Mili-Q水洗净柱子。如果柱子运行速度较慢，请用注射器柱塞将液体推入。将收集板的内容倒入废品箱中。

然后用四个 10 毫升的伊米达佐尔洗缓冲器清洗柱子两次，然后清空收集板。如果正在净化多个样品，则用 48 井板替换开放收集板。关闭真空后，将解体加载到柱中。

使用薄塑料搅拌器轻轻混合珠子和柱子中的 lysates，以最大限度地结合。打开泵并运行液体通过。如果柱子被阻塞，请将赖素树脂混合物转移到带新过滤器的柱子上。

冻结收集板以包含您的流经。替换为打开的收集板，然后用 9 个树脂卷 10 毫升的 imidazole 洗涤缓冲器清洗柱子。重复此步骤四到五次。

为了避免溢出，定期清空废盘。用 96 井板替换打开的收集板，确保 A1 位于左上角。将一个树脂体积的脱硝洗脱缓冲器放入柱中。

将液体通过并检查收集板，以确保井之间没有污染。对于下一个稀释，重复以前的步骤，并收集在一个新的收集板。以每个精英的50微升的引用为纯度和浓度分析。

接下来，用两毫升20%乙醇清洗柱子。在柱子上再加入两密耳的20%乙醇，使用新鲜的薄塑料搅拌器将乙醇中的珠子混合，然后转移到50万米管中，在4摄氏度下储存。将 MCPA 组装在真空歧管中，并在所有柱子中配有打开的收集板和注射器柱塞。

从前排取出所有注射器柱塞。从五毫升注射器柱塞中取出橡胶垫片，然后刺穿中间的一个孔。然后将打开的柱子底部推入被刺穿的橡胶垫片。

重复这些步骤并插入列的前排。确保 Q 血糖珠完全混合。蓝色移液器尖端从底部切开两厘米，将 Q sepharose 珠子的 800 微升管道插入开柱中。

一旦珠子落到柱子底部，打开真空泵，足以运行20%乙醇通过。用两毫升的10毫升三叶草洗两次柱子。在 Tris 缓冲器运行之前关闭泵以防止树脂干燥。

径流可以丢弃，代之以 48 井收集板。将所有样品转移到第一排的 Q Sepharose 柱中，使用薄塑料搅拌器将样品和珠子混合约两分钟，然后打开真空泵。存储或冻结您的流经，以供以后分析。

使用打开的收集板，用两密耳的 10 毫升三叶草洗两次柱子。用 96 井板替换开放式收集板。第一个排可以在第一行或第二行中收集。

要在第二行中清除，从这些位置取出注射器柱塞。将 Q Sepharose 列移动到这些位置，然后将注射器柱塞放入第一行的开放柱中。将第一批盐浓度的一毫升输送到 Q 塞法罗斯柱中。

打开泵并收集洗排。要收集下一个洗脱，从下一个位置取下注射器柱塞，将 Q Sepharose 柱移到这些位置，然后替换先前位置的柱塞。重复这些步骤，用于稀释每个连续的盐浓度。

确保每四个插图使用一个新的收集板，并且每个板都经过标记和存储。用打开的收集板，用两毫升的四摩尔氯化钠，10毫升三叶草清洗柱子。派特两密耳的20%乙醇，并运行通过，直到它就在珠子上方，然后密封柱存储。

例如，MCPA 已经通过镍 NTA 在变性条件下成功纯化了 14 个 AbpSH3 突变体。在25千达顿时可以看到一种小污染物，尽管这种蛋白质基本上仍然是纯的。在致残条件下看到的小污染物在原生条件下被去除。

当 11 个不同的 SH3 域被纯化时，就会显示这一点。这表明 MCPA 可用于比较净化条件。AbpSH3 可以通过从利萨酸盐中分离出大多数污染物。

相当纯的AbpSH3蛋白的良好产量通过各种高分子量污染物被回收。使用与 MCPA 的离子交换对镍-NTA 后样品进行净化，成功清除了这些高重量污染物。虽然仍有轻微的污染，但这些分数基本上仍然是纯的，并且使用NMR和热化学变性检测产生了良好的生物物理数据。

总之，我们的结果表明，我们的假设是正确的，MCPA可以成功地纯化毫克数量的蛋白质使用不同的色谱技术。MCPA 系统可在同一运行范围内以多种方式配置，以优化净化条件。设置简单、便宜且易于培训缺乏经验的用户，尤其是在不定期纯化蛋白质的实验室中。